Influence of Longxue Tongluo Capsule combinedwith Shugan Jieyu Capsule on quality of life and motor aphasia in patients with cerebral infarction in recorery stage
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摘要:目的 探讨龙血通络与舒肝解郁胶囊联合治疗恢复期脑梗死的效果。方法 选取68例恢复期脑梗死患者, 采用随机数表法分为观察组(n= 34)与对照组(n= 34)。对照组接受针刺治疗，观察组在此基础上予以龙血通络胶囊与舒肝解郁胶囊联合治疗。比较2组36条目简明健康量表(SF-36)、汉语失语成套测验(ABC)评分。结果 观察组治疗后SF-36评分以及ABC评分均显著高于对照组(P < 0.05)。结论 针对恢复期脑梗死患者，龙血通络与舒肝解郁胶囊联合治疗能提高其生活质量，减轻其运动性失语症状。Abstract:Objective To investigate the effect of Longxue Tongluo Capsule combined with Shugan Jieyu Capsule on the treatment of patients with cerebral infarction in convalescent stage.Methods A total of 68 patients with convalescent cerebral infarction were randomly divided into observation group (n=34) and control group (n=34). The control group was treated with acupuncture, while the observation group was treated with Longxue Tongluo Capsule and Shugan Jieyu Capsule on the basis of control group. The scores of short-form 36 items health scale (SF-36) and Chinese Aphasia test (ABC) were compared between the two groups.Results After treatment, the SF-36 score and ABC score in the observation group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05).Conclusion For patients with convalescent cerebral infarction, Longxue Tongluo Capsule combined with Shugan Jieyu Capsule can improve the quality of life and alleviate the symptoms of motor aphasia.
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脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性遗传性疾病，由5号染色体运动神经元生存基因(SMN)突变导致。2018年, SMA被列入中国《第一批罕见病目录》，发生率仅约1/10 000[1]。人类SMN基因有SMN1和SMN2, SMN1基因主要编码蛋白基因, SMN2是备用基因，也是SMA的主要疾病修饰因子[2]。根据发病年龄和达到的最大运动里程碑, SMA分为0、1、2、3、4共5型[3]。SMA患者的肌无力、肌萎缩症状，主要是由于患者体内不能编码产生足够的SMN蛋白，其缺失导致脊髓前角运动神经元逐渐丢失，进而引发一系列临床表现，重型可导致死亡。
环状RNA(circRNA)是一类内源性非编码RNA分子(ncRNA), 具有高度保守、结构稳定、自然抵抗外切酶的降解和组织特异性等优点，有成为生物标志物的巨大潜力[4-6]。多项研究[7-11]表明circRNA参与了神经退行性疾病并扮演了重要的角色，例如颞叶癫痫、阿尔兹海默症、帕金森病、多发性硬化症以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症。本研究通过芯片技术筛选儿童SMA2型患者和健康人群血浆中显著差异表达的circRNA, 并分析这些circRNA可能参与的生物学过程及通路，同时构建circRNA-miRNA网络，从circRNA的视角探讨SMA的发病机制，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2021年9月—2022年3月安徽省儿童医院收治的5例SMA2型患儿作为SMA组。收集患儿的性别、就诊年龄、发病年龄、肌张力、骨密度以及遗传学等临床资料。所有患儿按照《脊髓性肌萎缩症遗传学诊断专家共识》[12]的标准进行诊断及分型。另选取同期年龄匹配的5例健康儿童作为对照组。纳入标准为: 患儿就诊时年龄不超过18岁，未接受基因修饰治疗; 排除合并其他系统性疾病者，排除SMN1基因外显子发生纯合性缺失及拷贝数异常者。本研究已通过安徽省儿童医院伦理委员会批准(批件号: EYLL-2020-015), 全部受试者及其监护人均知晓并签订知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 RNA样品抽提和上机测序
采集2组受试者的空腹静脉血各5 mL置于抗凝管中, 4 ℃低温下1 200转/min离心10 min, 吸取上层液体分离出血浆，保存于-80 ℃冰箱中。采用Trizol法对血浆中游离RNA进行抽提。采用NanoDrop检测方法测定RNA浓度和纯度。采用Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA的完整性。样品质检合格后，取1~10 ng RNA, 使用Clontech SMARTer Stranded Total RNA seq kit V2 pico input试剂盒进行文库构建，所有样品的互补DNA文库均采用Illumina HiSeq 2000测序平台(广州吉赛生物科技股份有限公司)进行测序。
1.2.2 差异circRNAs的筛选
对获得的原始数据进行过滤，同时删掉接头序列、含N较多的序列及低质量的reads, 获得高质量数据(clean reads); 将clean reads与参考基因组进行比对，比对结果用于下一步circRNA的鉴定。采用DCC软件综合鉴定circRNA, 得到高可信circRNA。应用edgeR工具进一步对鉴定到的circRNA进行序列预测、表达值计算和表达差异分析。显著差异表达的circRNA进行热图(Heatmap)和聚类分析(差异倍数≥1.5, 统计学显著性P < 0.05), 用于后续功能的挖掘。
1.2.3 竞争性内源RNA(ceRNA)网络构建
circRNA可作为ceRNA来保护mRNA免受微小RNA(miRNA)的降解，进而调控mRNA的表达丰度。利用TargetScan和miRanda软件预测circRNAs可能结合的miRNA, 以及所有对应物种的miRNA与差异表达circRNA的关系，判断两者关系的主要依据包括序列匹配、circRNA-miRNA双链结合热稳定性等。根据miRanda比对得分>140, 自由能 < -15构建circRNA-miRNA网络关系调控图。
1.2.4 功能富集分析
使用R软件clusterProfiler对差异表达的circRNA分别进行基因本体论(GO)功能分析、京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集以及Reactome通路富集分析，以查看可能参与的生物学过程和通路。
1.3 统计学分析
为了获得表达更准确的差异表达circRNA转录本，对circRNA进行了M-值的加权截尾均值(TMM)标准化并过滤表达过低的circRNA(基因表达谱CPM值>0.1), 随后根据分组信息采用edgeR对circRNA进行了差异表达分析(差异倍数≥1.5, P < 0.05, FDR < 1)。差异表达基因集合是否显著富集到GO/KEGG/Reactome term, 不仅仅要看P值，还需要关注overlap Gene Count, 如果其太小(< 3), 即使P值很显著，也没有太大的生物学意义。
2. 结果
2.1 临床资料
结合发病年龄和运动里程碑, SMA组5例均为SMA2型，其中男2例，中位年龄3岁，女3例，中位年龄10岁。见表 1。对照组性别及年龄均按1:1匹配入组。
表 1 SMA组5例SMA患儿临床资料临床资料 病例1 病例2 病例3 病例4 病例5 性别 女 男 女 男 女 就诊年龄 4岁9个月 3岁 10岁 3岁 12岁10个月 发病年龄 6个月 6个月 12个月 10个月 9个月 肌肉萎缩 + + + + + 骨骼畸形 + + + + + 肌张力 减弱 减弱 减弱 减弱 减弱 左肩-肘-腕-掌指肌力 4 3 2 2 3 右肩-肘-腕-掌指肌力 4 3 2 2 3 左髋-膝-踝-掌趾肌力 2 2 1 1 2 右髋-膝-踝-掌趾肌力 2 2 1 1 2 骨密度(胫骨中段) 0.6 1.3 -5.9 0.5 -1.8 2.2 SMA患者血浆中差异circRNA表达谱
层次聚类分析显示了SMA组与对照组circRNA的差异表达谱。相对表达较高的circRNA用红色表示，表达较低的用蓝色表示，见图 1, 热图展示将SMA患者与健康对照组区分开来。以差异倍数绝对值≥1.5、统计学显著性P < 0.05为标准，相较于对照组, SMA组中共鉴定出136个显著差异表达的circRNA, 其中55个circRNA表达上调, 81个circRNA表达下调，见图 2。根据变化差异倍数和P值，分别选取上升和下降排名前10位的circRNAs, 见表 2。
表 2 SMA组与正常对照组差异表达的circRNA环状RNA 染色体定位 基因名 表达情况 log2倍数变化 差异倍数 P hsa_circ_0024193 chr11 ATM 高 2.353 5.110 < 0.001 hsa_circ_0008833 chr6 SAMD3 高 2.098 4.281 0.001 hsa_circ_0000944 chr19 CCDC9 高 2.044 4.125 < 0.001 hsa_circ_0004137 chr14 RBM23 高 2.014 4.040 0.002 hsa_circ_0004751 chr17 AATF 高 1.934 3.821 0.007 hsa_circ_0005573 chr20 STK4 高 1.828 3.552 0.007 hsa_circ_0000615 chr15 ZNF609 高 1.812 3.511 < 0.001 hsa_circ_0007694 chr11 ATM 高 1.738 3.336 < 0.001 hsa_circ_0135062 chr7 ANKIB1 高 1.722 3.299 0.003 hsa_circ_0006956 chr10 CCSER2 高 1.709 3.269 0.004 hsa_circ_0005910 chr2 LTBP1 低 -2.624 0.162 < 0.001 hsa_circ_0009109 chr1 DCAF6 低 -2.320 0.200 0.002 hsa_circ_0076179 chr6 MAPK14 低 -2.084 0.235 0.003 hsa_circ_0028899 chr12 RNF10 低 -2.032 0.245 0.004 hsa_circ_0006809 chr14 CDC42BPB 低 -1.924 0.264 0.004 hsa_circ_0035957 chr15 DENND4A 低 -1.819 0.283 0.004 hsa_circ_0007017 chr7 KMT2C 低 -1.759 0.295 0.015 hsa_circ_0006272 chr10 CCAR1 低 -1.737 0.300 0.007 hsa_circ_0018403 chr10 SGMS1 低 -1.680 0.312 0.004 hsa_circ_0101926 chr14 KLHDC1 低 -1.665 0.315 0.015 2.3 circRNA-miRNA调控网络
使用TargetScan和miRanda数据库预测差异表达circRNA的靶向miRNA, circRNA序列上的miRNA结合位点数目越多, miRNA越有可能结合到circRNA上。根据差异倍数排序，各选取前5位的上调、下调circRNA进行预测，筛选出匹配值较高的5个miRNA进行注释，见表 3。通过对预测结果过滤，保留总分最大的前1 000个miRNA, 应用Cytoscape软件绘制circRNA-miRNA调控网络图，见图 3。
表 3 差异表达的circRNA与miRNA结合位点的预测结果表达趋势 环状RNA 结合相关miRNA hsa_circ_0024193 hsa-miR-513a-3p hsa-miR-548c-3p hsa-miR-507 hsa-miR-557 hsa-miR-324-5p 上调 hsa_circ_0008833 hsa-miR-1234 hsa-miR-586 hsa-miR-155 hsa-miR-616 hsa-miR-598 hsa_circ_0000944 hsa-miR-1307 hsa-miR-548b-3p hsa-miR-942 hsa-miR-136 hsa-miR-361-3p hsa_circ_0004137 hsa-miR-876-3p hsa-miR-31 hsa-miR-619 hsa-miR-1208 hsa-miR-1178 hsa_circ_0004751 hsa-miR-1208 hsa-miR-623 hsa-miR-766 hsa-miR-513a-3p hsa-miR-224 下调 hsa_circ_0005910 hsa-miR-1258 hsa-miR-184 hsa-miR-485-3p hsa-miR-488 hsa-miR-623 hsa_circ_0009109 hsa-miR-1256 hsa-miR-624 hsa-miR-577 hsa-miR-579 hsa-miR-557 hsa_circ_0076179 hsa-miR-769-5p hsa-miR-203 hsa-miR-516b hsa-miR-657 hsa-miR-1288 hsa_circ_0028899 hsa-miR-1248 hsa-miR-647 hsa-miR-194 hsa-miR-31 hsa-miR-183 hsa_circ_0006809 hsa-miR-766 hsa-miR-1205 hsa-miR-1248 hsa-miR-578 hsa-miR-576-5p 2.4 差异circRNA的生物信息学分析
根据差异表达的circRNA进行GO功能注释，结果显示主要富集于去磷酸化作用、DNA复制、有丝分裂等生物过程。细胞成分的定位主要在高尔基外侧网络、纺锤体和细胞质膜侧等，其主要分子功能为ATP酶活性、磷酸酶、磷酸酯水解酶活性和组蛋白结合等，见图 4。KEGG分析发现，差异的circRNA可能涉及的通路包括MAPK信号通路、HIV病毒感染、VEGF信号通路、同源重组修复、DNA复制等，见图 5。Reactome分析结果显示，差异的circRNA主要富集在高尔基体和内质网的运输、DNA双链断裂修复、同源重组和非同源末端连接等信号通路，见图 6。
3. 讨论
SMA是最常见的神经退行性疾病之一，与儿童的死亡率有关。目前诊断SMA的金标准是基因检测，但仍需结合典型的临床症状和家族史[13]。近年来，基因疗法成为第2种被批准治疗SMA的方法，其能够恢复SMN2外显子7的小分子化合物，进一步扩展了用于SMA治疗的RNA靶向分子类别，除SMN2 pre-mRNA外，内源性RNA靶标如miRNA和circRNA, 也可能被用于开发额外的SMA疗法[14]。
研究[15]显示, circRNA具有独特的闭环结构，使其可以高度稳定地存在于血清、血浆等细胞外坏境中，这也提高了circRNA作为miRNA海绵通过ceRNA网络调节亲本基因表达的有效性[16]。目前已有多项研究[17-18]表明，血浆circRNA分子能够作为诊断疾病和肿瘤的分子标志物，不仅与治疗敏感性密切相关，还可作为预后相关的重要分子标志物，具有很强的临床诊断意义[19-20]。然而，目前circRNA在儿童SMA患者中的研究仍较少。本研究首次使用来自儿童SMA2型患者和健康对照组血浆中circRNA的表达谱进行多层综合分析，发现共有136个显著差异表达的circRNA, 其中55个在SMA组表达上调, 81个表达下调，这些circRNA可以在血浆样本中作为SMA的候选生物标志物，同时高通量数据为SMA可能的致病作用也提供了线索。
研究[21]表明miRNA在运动神经元的发生发展、SMA发病机制方面发挥着至关重要的作用，识别潜在的SMA相关miRNA及其相应的伴侣RNA结合蛋白，不仅可以提供监测疾病进展的生物标记物，还可以代表潜在的治疗靶点。ABIUSI E等[22]发现miR-181a-5p、miR-324-5p和miR-451a在SMA患者血清中显著上调，并提高了SMA的表型预测价值。本研究对SMA患者血浆中差异表达的circRNA进行了miRNA位点的预测，筛选出匹配值较高的5个circRNA, 并在此基础上构建了circRNA-miRNA调控网络。初步分析发现除了上述3种miRNA均在预测范围内，这些差异表达的circRNA还具有与神经元发育相关miRNAs(miR-9、miR-124和miR-133)、富含运动神经元miRNAs(miR-183和miR-218)、肌肉特异性miR-206以及星形细胞产生的miR-146等在SMA的发病机制中发挥重要调控作用的miRNA的结合位点[23-26]。因此，这些circRNA可能通过靶向吸附miRNA调控SMA的发生和发展。此外，本研究绘制的ceRNA调节网络也为SMA中circRNA-miRNA级联放大协同效应的调控途径提供了线索。
GO功能富集分析显示，多数差异表达的circRNA参与了ATP酶活性以及磷酸酶活性。研究[27]表明, SMN蛋白的缺失影响了线粒体稳态的维持以及能量代谢的调控，其中包括ATP酶活性。PTEN是一种磷酸酶和张力蛋白同源物，其缺失可激活抗凋亡因子，该通路在许多神经退行性疾病中起着重要的保护作用[28]。因此, PTEN基因的敲除、缺失或突变通过调节其磷酸酶活性可能是促进SMA运动神经元存活的重要治疗策略。此外, KEGG及Reactome通路富集分析均显示，候选circRNA的靶基因在同源重组修复(HR)、非同源末端连接(NHEJ)以及DNA复制途径中富集。KANNAN A等[29]研究指出长期低水平的SMN蛋白会导致感觉神经毒素(SETX)缺乏，诱导DNA双链断裂(DSB)增加，以及DNA活化蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)的缺乏，从而损害DSB修复。因此, DNA损伤在SMA患者脊髓组织中积累，在细胞分裂过程中, DSB通过HR和NHEJ途径修复[30]。另外, TAY S H等[31]利用同源重组修复机制产生了一个具有中等水平SMN蛋白的斑马鱼突变体，用于研究晚期SMN蛋白的缺失对运动神经元和肌肉的影响。据此推测，这些circRNA可能通过同源重组修复参与调控SMA的发生和发展。
综上所述，本研究通过对儿童SMA2型患者血浆中提取的circRNA的差异表达进行详细的生物信息学分析，并基于该假设构建了circRNA-miRNA网络，这些结果可能有助于阐明SMA的发病机制，以指导治疗策略的制订。鉴于SMA发病率低，临床罕见，本研究纳入病例量较少，后续仍需进一步扩充临床样本，考虑在其他亚型SMA患者、肌肉活检组织或细胞水平进行验证，以期为SMA的早期检测、精确诊断以及靶向治疗提供新的策略方向和更多的数据基础。
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表 1 2组治疗后SF-36评分对比(x±s)
分 组别 生理机能 躯体疼痛 生理职能 精力 精神健康 精神职能 社会功能 一般健康状况 对照组(n= 34) 78.06±4.23 77.95±4.01 78.32±4.32 76.75±5.29 79.15±4.83 79.11±4.90 77.65±5.33 78.12±3.95 观察组(n= 34) 84.07±4.51* 83.78±4.48* 84.10±4.53* 83.02±6.14* 85.22±5.14* 85.38±5.27* 83.54±5.46* 84.60±4.29* 与对照组比较，*P < 0.05。 
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表 2 2组治疗后ABC评分对比(x±s)
分 组别 谈话 理解 命名 复述 阅读 书写 对照组(n= 34) 18.15±3.27 121.12±7.04 35.12±3.11 79.06±5.84 82.45±6.33 77.58±7.60 观察组(n= 34) 22.06±3.54* 139.64±7.55* 38.21±3.53* 86.12±6.01* 89.12±6.54* 85.10±8.33* 与对照组比较, *P < 0.05。
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