Effect of Wuzi Yanzong Recipe on change of scleral morphology in guinea pig with form-deprivation myopia
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摘要:目的 观察豚鼠屈光状态、眼轴及巩膜形态学变化，了解五子衍宗方对形觉剥夺性近视眼的影响。方法 选择2周龄健康豚鼠100只，通过眼罩遮盖右眼42 d制备形觉剥夺性近视模型，测量并记录实验豚鼠双眼屈光度和眼轴，将造模成功的豚鼠随机分为对照组和治疗组，再次测量记录双眼屈光度及眼轴。治疗组使用五子衍宗方水煎液(生物给药量为16 g/kg)灌胃, 1次/d, 连续30 d, 对照组不进行干预。采用电镜检查2组模型眼巩膜组织的超微结构并比较差异。结果 实验豚鼠经遮盖42 d后，右眼成功诱导出形觉剥夺性近视眼模型，与自身对照眼相比，眼轴与屈光度均有显著增加(P < 0.05)。电镜结果显示, 2组豚鼠近视眼模型后部巩膜形态均有不同程度改变，相较于治疗组模型眼，对照组模型眼的结构改变更为明显。结论 五子衍宗方可能具有延缓形觉剥夺性近视眼豚鼠巩膜组织形态改变进而延缓近视进程的作用。Abstract:Objective To observe changes of refractive status, axis oculi and sclera morphology in guinea pigs and to explore the effect of Wuzi Yanzong Recipe on changes of scleral morphology in guinea pig with form-deprivation myopia.Methods A total of 100 healthy guinea pigs with 2 weeks of age were selected, and deprivation myopia models were prepared by eye mask covering for 42 days. Their binocular diopter and axis oculi were recorded. The successful models were randomly divided into control group and treatment group, and their binocular diopter and axis oculi were recorded again. The treatment group applied intragastric administration of Wuzi Yanzong Recipe at a dose of 16 g/kg, once daily for 30 consecutive days. No intervention was performed in the control group. The sclera ultrastructure of the treatment group and the control group were examined and compared by transmission electron microscopy.Results The right eyes of guinea pigs were successfully induced for form-deprivation myopia model after 42 d covering. Compared with the self-controlled eyes, the eye axis and diopter were significantly increased (P < 0.05). The electron microscope results showed that posterior scleral morphology in the treatment group showed some pathological changes, but showed anobvious changes than those in the control group.Conclusion Wuzi Yanzong Recipe can delay progression of myopia by postponing the changes of scleral tissue morphology.
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Keywords:
- Wuzi Yanzong Recipe /
- form deprivation myopia /
- sclera /
- electron microscopy /
- guinea pig
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颅脑损伤(TBI)是神经外科常见疾病，主要由交通事故、坠落、暴力等因素所致，具有起病急、病情进展迅速等特点，尤其是重型颅脑损伤(sTBI)患者，具有较高的致残率与致死率[1]。颅脑组织结构复杂，早期寻找评估sTBI患者病情及预后的标志物有利于改善患者预后[2]。格拉斯哥昏迷量表(GCS)是临床上用于评估sTBI患者病情与预后的常用指标[3]; 计算机断层扫描(CT)检查可显示病灶位置、大小、数量等，可快速、多方位地评价脑损伤情况; Rotterdam CT评分是临床上常用的脑损伤相关CT评分系统，对脑损伤患者病情与预后有一定的预测价值，但其诊断效能在不同研究中存在差异[4]。可溶性白细胞分化抗原40配体(sCD40L)参与调节血管内皮功能，与血管损伤有关，可用于高血压脑出血患者病情评估与预后判断[5]。扣针蛋白-5(fibulin-5)是一种细胞外机制糖蛋白，参与细胞增殖、黏附及组织损伤修复等多种过程，在维护血脑屏障(BBB)功能方面起着重要作用[6]。研究[7]显示, Rotterdam CT评分联合血清标志物可提高预测急性颅脑创伤患者预后的效能。本研究探讨Rotterdam CT评分联合血清sCD40L及fibulin-5对sTBI患者不良预后的预测价值，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2020年12月—2022年7月本院收治的186例初次sTBI患者作为观察对象，其中男129例，女57例，年龄24~64岁，平均(44.58±11.56)岁。纳入标准: ①符合sTBI的诊断标准者[8]; ②年龄>18岁者; ③临床资料完整者，且入院24 h内进行CT检查，GCS评分3~8分。排除标准: ①既往有脑梗死、脑部肿瘤、脑出血或颅脑外伤者; ②严重肝肾功能不全者; ③合并高血压、自身免疫性疾病和血液系统疾病者; ④合并其他系统严重多发损伤者; ⑤患者入院时死亡。本研究经本院伦理委员会批准(批准文号: 年伦审2020第165号)。收集患者一般资料，包括年龄、性别、致伤原因、入院时GCS评分和是否合并脑疝等。
1.2 研究方法
1.2.1 血清sCD40L、fibulin-5水平检测
采集sTBI患者入院第1、3、7天时的肘静脉血5 mL, 3 000 g离心15 min, 采集血清置于-20 ℃保存。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清sCD40L、fibulin-5水平, sCD40L(货号: ARD10125) 试剂盒购自广州奥瑞奥科技有限公司, fibulin-5(货号: CSB-EL008454HU)试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.2 Rotterdam CT评分
患者入院24 h内，采用GE公司的16排螺旋CT进行颅脑检查，扫描完成后, CT图像采用高分辨率算法重建，重建层厚1.5 mm, 根据CT影像进行Rotterdam CT评分，包括中线移位(≤5 mm=0分, >5 mm=1分)、基底池(正常=0分，受压=1分，消失=2分)、硬膜外血肿(无=0分，有=1分)、脑室或(创伤性)蛛网膜下腔出血(无=0分，有=1分)5个特征，总分6分，评分越高表示颅脑损伤越严重。
1.2.3 观察指标
收集入院时血常规，包括血小板计数(PLT)、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞数目(Neu)、血红蛋白(Hb)、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体、降钙素原(PCT)等指标。
1.2.4 治疗与预后
患者入院后及时给予治疗，包括清理创面、建立静脉通道、控制血压、脱水降颅内压，并根据患者病情进行去骨瓣减压术、颅内血肿清除术等手术治疗。密切监测患者生命体征各项指标变化，并给予抗感染、营养支持等治疗。对患者进行为期12个月的随访，截止日期至2023年7月31日，根据格拉斯哥预后量表(GOS)进行预后评估，分为预后良好(4~5分)104例与预后不良(1~3分)82例。
1.3 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料符合正态分布的采用(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验; 不符合正态分布的计量资料采用中位数(四分位数)[M(Q1, Q3)]表示，行Mann-Whitney U检验; 计数资料采用[n(%)]表示，比较采用χ2检验，不同时间点比较采用重复测量方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验; Spearman分析用于探讨入院第1天血清sCD40L、fibulin-5与Rotterdam CT评分、GCS评分的相关性，采用多因素Logistic回归模型分析影响sTBI患者预后不良的危险因素，采用受试者工作特征(ROC)曲线分析Rotterdam CT评分联合入院第1天血清sCD40L、fibulin-5对sTBI患者预后的预测价值; Bootstrap法重复100次抽样交叉验证来进行内部验证, Hosmer-Lemeshow检验模型拟合程度。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 不同预后sTBI患者的一般资料比较
预后良好组与预后不良组患者的年龄、性别、致伤原因及PLT、Hb、D-二聚体、PCT比较，差异无统计学意义(P>0.05); 与预后良好组比较，预后不良组患者GCS评分降低, Rotterdam CT评分、合并脑疝比率及WBC、CRP水平升高，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 不同预后重型颅脑损伤患者一般资料比较(x±s)[n(%)][M(Q1, Q3)]指标 分类 预后良好组(n=104) 预后不良组(n=82) χ2/t/z P 年龄/岁 44.55±11.58 44.61±12.67 0.037 0.973 性别 男 70(67.31) 60(73.17) 0.749 0.387 女 34(32.69) 22(26.83) 致伤原因 交通事故 52(50.00) 44(53.66) 0.182 0.913 高处坠落 33(31.73) 25(30.49) 其他 19(18.27) 13(15.85) 格拉斯哥昏迷量表/分 6.00(3.00，8.00) 5.00(3.00，7.00) 5.392 < 0.001 Rotterdam CT评分/分 3.00(2.00，4.00) 4.00(4.00，5.00) 7.013 < 0.001 合并脑疝 是 47(45.19) 56(68.29) 9.901 0.002 否 57(54.81) 26(31.71) 白细胞计数/(×109/L) 13.01±3.56 15.87±3.78 5.293 < 0.001 血小板计数/(×109/L) 180.42±31.25 183.67±34.35 0.674 0.501 中性粒细胞数目/(×109/L) 12.89±3.41 13.16±3.69 0.517 0.606 血红蛋白/(g/L) 103.32±21.30 108.26±24.38 1.473 0.142 C反应蛋白/(mg/L) 27.42±6.56 35.21±6.79 7.917 < 0.001 D-二聚体/(mg/L) 19.36±3.75 20.24±4.08 1.528 0.128 降钙素原/(ng/mL) 0.48(0.12，0.63) 0.56(0.17，0.74) 0.712 0.453 2.2 不同预后sTBI患者血清sCD40L、fibulin-5水平比较
入院第1、3、7天，与预后良好组比较，预后不良组患者血清sCD40L、fibulin-5水平升高; 与入院第1天比较, 2组入院第3、7天血清sCD40L、fibulin-5水平升高; 与入院第3天比较, 2组入院第7天血清sCD40L、fibulin-5水平降低; 上述组间、组内差异均有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 不同预后sTBI患者血清sCD40L、fibulin-5水平变化(x±s)时点 sCD40L/(ng/mL) fibulin-5/(ng/mL) 预后良好组(n=104) 预后不良组(n=82) 预后良好组(n=104) 预后不良组(n=82) 入院第1天 12.32±2.43 15.78±3.69△ 95.36±15.21 113.12±20.34△ 入院第3天 16.55±2.32* 24.05±3.18*△ 124.05±16.47* 160.24±18.95*△ 入院第7天 14.31±1.56*# 18.67±2.65*#△ 105.32±12.15*# 132.45±16.15*#△ sTBI: 重型颅脑损伤; sCD40L: 可溶性白细胞分化抗原40配体; fibulin-5: 扣针蛋白-5。与入院第1天比较, * P < 0.05; 与入院第3天比较, #P < 0.05; 与预后良好组比较, △P < 0.05。 2.3 sCD40L、fibulin-5与Rotterdam CT评分、GCS评分的相关性
sCD40L、fibulin-5与GCS评分呈负相关(r=-0.505、-0.421, P < 0.05), 与Rotterdam CT评分呈正相关性(r=0.495、0.397, P < 0.05)。
2.4 影响sTBI患者预后不良的多因素Logistic回归分析
以患者预后作为因变量，以Rotterdam CT评分、GCS评分、合并脑疝、WBC、CRP、血清sCD40L、fibulin-5水平作为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示, Rotterdam CT评分、sCD40L、fibulin-5是影响sTBI患者预后不良的独立影响因素(P < 0.05), 见表 3。
表 3 影响sTBI患者预后不良的多因素Logistic回归分析影响因素 β SE Wald χ2 OR 95%CI P GCS评分 0.628 0.332 3.585 1.875 0.978~3.594 0.058 Rotterdam CT评分 0.942 0.317 8.822 2.564 1.377~4.772 0.002 合并脑疝 0.699 0.363 3.709 2.012 0.987~4.098 0.054 WBC 0.135 0.285 0.225 1.145 0.654~2.001 0.634 CRP 0.283 0.303 0.871 1.327 0.732~2.403 0.350 sCD40L 1.018 0.300 11.517 2.768 1.537~4.983 < 0.001 fibulin-5 0.931 0.341 7.466 2.539 1.301~4.953 0.006 sTBI: 重型颅脑损伤; GCS: 格拉斯哥昏迷量表; WBC: 白细胞计数; CRP: C反应蛋白; sCD40L: 可溶性白细胞分化抗原40配体; fibulin-5: 扣针蛋白-5。 2.5 Rotterdam CT评分联合入院第1天血清sCD40L、fibulin-5对sTBI患者预后的预测价值
Rotterdam CT评分以及入院第1天血清sCD40L、fibulin-5单独及联合预测sTBI患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.855、0.831、0.833、0.969，联合诊断AUC高于Rotterdam CT评分、sCD40L、fibulin-5单独诊断，差异有统计学意义(Z联合-Rotterdam CT评分=4.233, Z联合-sCD40L=4.274, Z联合-fibulin-5=4.433, P < 0.001), 见表 4、图 1。
表 4 Rotterdam CT评分联合入院第1天sCD40L、fibulin-5对sTBI预后不良的诊断价值指标 AUC 95%CI 截断值 敏感度/% 特异度/% 约登指数 Rotterdam CT评分 0.855 0.796~0.902 3分 70.85 70.19 0.482 sCD40L 0.831 0.769~0.882 14.95 ng/mL 78.05 80.77 0.588 fibulin-5 0.833 0.772~0.884 106.31 ng/mL 75.61 79.81 0.554 联合 0.969 0.933~0.989 — 86.59 94.20 0.808 2.6 预测模型的内部验证
采用Bootstrap重抽样100次内部验证结果显示，校准曲线与理想曲线基本一致。Hosmer-Lemeshow拟合优度检验显示χ2=1.989, 自由度为8, P=0.981, 表明一致性较好，见图 2。
3. 讨论
sTBI是最严重的颅脑损伤之一，病情进展迅速，患者预后较差, sTBI的发病率呈升高趋势，早期评估患者病情与预后，有助于改善患者预后[9]。
颅脑CT可分辨病灶大小、形态、范围及临近脑组织压迫情况，其具有图像清晰、无创、检测时间短等优点，常用于检测TBI患者脑损伤情况[10]。目前对于颅脑损伤预后评估常用GCS评分及基于头颅CT的评分，均为主观等级指标，不能对患者预后进行客观评价[11]。Rotterdam CT评分是基于CT图像的综合评分系统，临床上广泛用于评估sTBI患者病情与预后，且其是sTBI患者预后不良的危险因素，但是诊断效能不高[12]。本研究结果显示，预后不良组患者Rotterdam CT评分显著高于预后良好组患者，且对sTBI预后不良有一定诊断价值，但诊断的敏感度与特异度均不高，需联合其他指标提高诊断效能。研究[13]显示, Rotterdam CT评分联合血清标志物可提高对TBI患者不良预后的诊断价值。
sCD40L是一种跨膜蛋白，可与受体CD40结合，参与免疫调节及炎症反应; 血管内皮损伤后, sCD40L水平升高，与冠心病、脑卒中等多种心血管疾病密切相关，可用于病情与预后评估[14]。研究[15]显示，高血压脑出血患者血清sCD40L水平升高，且其与病情严重程度呈正相关，可用于患者病情程度及预后判断。LORENTE L等[16]研究显示，与存活组比较，死亡组TBI患者在第1、4、8天的血清sCD40L水平升高，对患者预后有一定的诊断价值。fibulin-5是一种基质细胞蛋白，通过与细胞膜表面整合素受体结合，促进内皮细胞与细胞外基质黏附，促进BBB结构的稳定[17]。研究[18]显示，脑卒中后认知障碍患者血清fibulin-5水平升高，并与患者认知损害程度有关。研究[19]还显示，动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者血浆fibulin-5水平升高，与入院严重度分级、神经系统恶化和不良预后有关，是90 d不良预后的危险因素。本研究结果显示，预后不良sTBI患者血清sCD40L、fibulin-5在入院第1、3、7天水平显著高于预后良好组，与既往研究[16, 19]结果类似，提示sCD40L、fibulin-5与sTBI患者预后相关，且在第3天达到水平峰值，分析其原因可能是脑损伤后氧化水平升高，炎症因子释放，sCD40L水平升高，脑组织在缺血缺氧条件下，诱导fibulin-5表达发挥修复BBB、保护缺氧脑细胞的作用，与颅脑损伤后脑水肿在创伤后3~4 d达高峰的时间一致。
本研究还显示, sCD40L、fibulin-5与Rotterdam CT评分、GCS评分具有相关性，提示sCD40L、fibulin-5可反映sTBI患者病情严重程度。脑组织受到创伤后，引起瀑布式级联损害效应，并引发过氧化损伤、炎症反应，导致WBC、CRP等水平升高。研究[20-21]显示，脑疝、WBC、GCS评分、CRP、多发脑挫裂伤等是影响sTBI患者预后不良的危险因素。本研究显示, GCS评分、Rotterdam CT评分、合并脑疝、sCD40L、fibulin-5是影响sTBI患者预后不良的独立影响因素，提示血清sCD40L、fibulin-5水平升高患者发生预后不良的风险较高，监测血清sCD40L、fibulin-5水平变化有利于早期识别预后不良的高风险人群，对于指导临床治疗具有一定的意义。ROC曲线分析显示，Rotterdam CT评分与入院第1天血清sCD40L、fibulin-5对预测sTBI患者预后不良的AUC分别为0.855、0.831、0.833, 而三者联合预测的AUC为0.969, 敏感度为86.59%, 特异度为94.23%, 提示Rotterdam CT评分与sCD40L、fibulin-5联合诊断可提高对预后不良的预测效能。
综上所述, sTBI患者血清sCD40L、fibulin-5水平升高，与sTBI患者不良预后有关, Rotterdam CT评分联合血清sCD40L、fibulin-5对sTBI患者不良预后有较高的预测效能。
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图 1 2组豚鼠后部颞侧巩膜组织电镜检查图
A、B、C、D为对照组模型眼, E、F、G、H为治疗组模型眼; A、C、D、G放大倍数6 000倍, B、E、F、H放大倍数2 500倍。
表 1 豚鼠造模前后屈光度和眼轴的变化(x±s)
时点 屈光度/D 眼轴/mm 右眼 左眼 右眼 左眼 造模前(n=100) 3.54±0.77 3.55±0.74 7.28±0.18 7.31±0.16 造模后(n=60) -5.17±0.78# 2.91±0.79*# 10.31±0.17# 8.05±0.29*# 与右眼比较, *P < 0.05; 与造模前比较, #P < 0.05。 
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