小檗碱上调程序性细胞死亡蛋白4抑制黑色素瘤B16细胞增殖及促细胞凋亡的研究

王迪; 徐楠; 郭家妍; 宋跃; 唐明睿

doi:10.7619/jcmp.202011023

小檗碱上调程序性细胞死亡蛋白4抑制黑色素瘤B16细胞增殖及促细胞凋亡的研究

中国医科大学附属第一医院整形外科, 辽宁沈阳, 110001

基金项目:

辽宁省自然科学基金项目(2020-MS-145)

详细信息

通讯作者:
唐明睿,E-mail:tangmingrui@sina.com

中图分类号: R73.3
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出版历程
- 收稿日期: 2020-03-12
- 网络出版日期: 2020-08-27

Berberine inhibits proliferation and promotes apoptosis of melanoma B16 cells by up-regulating programmed cell death 4

Department of Plastic Surgery, The First Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang, Liaoning, 110001

摘要

摘要: 目的探讨小檗碱对黑色素瘤B16细胞增殖、凋亡的影响。方法使用CCK-8法检测细胞增殖活力; 使用流式细胞仪检测细胞周期; 使用脂质体转染siRNA敲减程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)基因; 使用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)明确敲减情况; 使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;使用Western-blotting检测PDCD4增殖、凋亡情况及其相关蛋白表达。结果小檗碱可抑制黑色素瘤B16细胞的增殖活力,并将其细胞周期阻滞于G₀/G₁期; PDCD4是小檗碱抑制B16细胞增殖、促细胞凋亡的关键基因; 小檗碱处理可增高PDCD4、Cleaved Caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平,降低Ki-67、Bcl-2的表达水平,敲除PDCD4能减弱小檗碱对黑色素瘤B16细胞Ki-67、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3的影响。结论小檗碱通过上调PDCD4来抑制黑色素瘤B16细胞增殖并促使其凋亡。
- 小檗碱 /
- 程序性细胞死亡蛋白4 /
- 黑色素瘤B16细胞 /
- 细胞周期 /
- 细胞增殖 /
- 细胞凋亡 /
- 基因敲除
Abstract: Objective To explore the effect of berberine on the proliferation and apoptosis of melanoma B16 cells. Methods The CCK-8 method was used to detect cell proliferation viability. Cell cycle was detected by flow cytometry. The programmed cell death 4(PDCD4)gene was knocked down by liposome transfection of siRNA. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to identify knockout condition. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Expressions of PDCD4, proliferation-associated and apoptosis-associated proteins were detected by Western-blotting. Results Berberine was able to inhibit the proliferation viability of melanoma B16 cells and arrest cell cycle at G₀/G₁ phase.PDCD4 was the key gene for berberine to inhibit proliferation and promote apoptosis of melanoma B16 cells. Berberine treatment was able to increase the expression levels of PDCD4, Cleaved Caspase-3 and Bcl-2 associated protein X(Bax)as well as decrease expression levels of Ki-67 and Bcl-2. The effect of berberine on Ki-67, Bcl-2, Bax and Cleaved Caspase-3 of melanoma B16 cells was weakened by knocking out PDCD4. Conclusion Berberine can inhibit proliferation and promote apoptosis of melanoma B16 cells by up-regulating PDCD4.
- berberine /
- programmed cell death 4 /
- melanoma B16 cells /
- cell cycle /
- cell proliferation /
- cell apoptosis /
- gene knockout

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克罗恩病(CD)是一种慢性、反复发作的肠道非特异性炎性疾病，有效评估和监测疾病活动度对于临床上指导治疗、判断预后至关重要^[1-2]。2021年国际炎症性肠病组织提出的CD治疗目标要求在实现症状缓解的基础上，最终达到黏膜愈合^[3]。结肠镜检查是评估患者黏膜愈合的金标准，但其作为常规评估CD活动度的手段存在一定的局限。克罗恩病活动指数(CDAI)可以有效评估CD患者疾病的临床活动程度，但证据^[4]表明CDAI与内镜下肠道炎症的相关性较差。患者报告结局(PRO)评分可反映CD患者临床活动程度, PRO评分以CDAI中患者症状及感觉为基础(腹泻次数、腹痛程度和总体感觉)，研究^[5-6]证明PRO评分在评估CD患者内镜下活动程度方面较CDAI有着更好的准确性。然而，考虑到CD具有表型异质性，临床症状有较大的差异，因此需结合可以反映肠道炎症的客观指标评估内镜下疾病活动度。研究^[7-9]表明白蛋白(ALB)、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)等血液学指标对于CD患者黏膜愈合具有一定的预测价值。本研究探讨PRO评分联合血清学指标对CD患者内镜下疾病活动度的评估价值，现报告如下。

1. 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年8月—2021年6月住院的CD患者224例, 男126例(56.2%), 女98例(43.8%), 年龄28.3~49.0岁，中位年龄41.0岁。纳入标准: ①符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018年·北京)》^[10]中CD的诊断标准者; ②临床资料、实验室检查及内镜检查资料完整者，实验室检查在内镜检查前7 d内完成。排除标准: ①伴肝脏、肾脏等重要脏器功能障碍者; ②合并白血病、淋巴瘤等血液疾病者; ③合并恶性肿瘤者; ④合并系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等结缔组织病者; ⑤全身或肠道严重感染者; ⑥合并溃疡性结肠炎、累及上消化道和小肠的CD、肠易激综合征者; ⑦肠切除术后患者; ⑧妊娠患者。

1.2 研究方法

收集入组患者的血清学指标，包括白细胞数(WBC)、中性粒细胞比率(NEUR)、淋巴细胞比率(LY)、血小板(PLT)、红细胞(RBC)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、ALB、CRP、ESR。收集患者一般临床资料，包括性别、年龄、CDAI等，选取CDAI中“腹泻次数、腹痛程度和总体感觉”计算PRO评分^[11]。内镜操作由2名具有5年以上工作经验的临床医生完成(2名内镜医师不知晓患者的临床资料)，检查结束后各自评估CD简化内镜评分(SES-CD), 将SES-CD≤3分者纳入缓解期组, SES-CD≥4分者纳入活动期组。本研究通过医院伦理委员会审批，所有患者均知情同意。

1.3 统计学方法

应用SPSS 26.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验; 偏态分布的计量资料以中位数(四分位间距)[M(P₂₅, P₇₅)]表示，应用Mann-Whitney U非参数检验分析各组的差异; 采用Spearman相关分析评估PRO评分与SES-CD的相关性。采用多因素Logistic回归分析探讨CD内镜下疾病活动度的独立危险因素; 应用受试者工作特征(ROC)曲线分析各指标评估CD内镜下疾病活动度的价值。双侧P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 PRO评分与SES-CD的相关性

Spearman相关分析结果显示, 224例患者的PRO评分与SES-CD呈轻度正相关(r=0.394, P < 0.001), 见图 1。

图 1 PRO评分与SES-CD的相关性分析(n=224)

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2.2 活动期组与缓解期组患者临床资料比较

活动期组患者PLT、RDW、PCT、CRP、ESR、PRO评分高于缓解期组, LY、HCT、MCV、PDW、MPV、ALB低于缓解期组，差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。2组WBC、NEUR、RBC比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

表 1 活动期组与缓解期组临床资料比较(x±s)[M(P₂₅, P₇₅)]

变量	全组(n=224)	缓解期组(n=60)	活动期组(n=164)
WBC/(×10⁹/L)	5.6(4.3, 7.2)	5.4(4.3, 6.4)	5.6(4.4, 7.3)
NEUR/%	67.4(59.5, 73.7)	65.8(57.5, 72.4)	68.0(59.9, 74.7)
LY/%	22.8(17.0, 29.8)	24.7(19.5, 33.7)	22.5(16.6, 29.0)^*
PLT/(×10⁹/L)	233.0(189.8, 302.3)	201.0(171.3, 243.5)	249.0(200.8, 323.0)^**
RBC/(×10¹²/L)	4.4(4.0, 4.9)	4.7(4.0, 5.0)	4.4(4.0, 4.8)
HCT/%	37.9(34.2, 42.9)	41.0(36.6, 44.8)	37.3(33.3, 41.7)^**
MCV/fL	86.5(82.0, 91.9)	90.3(86.3, 93.1)	85.5(80.2, 91.0)^**
RDW/%	13.2(12.4, 14.9)	12.8(12.1, 13.4)	13.5(12.6, 15.3)^**
PDW/%	14.5(11.6, 16.0)	15.6(12.6, 16.4)	13.8(11.2, 15.9)^**
PCT/%	0.2(0.2, 0.3)	0.2(0.2, 0.3)	0.3(0.2, 0.3)^**
MPV/fL	10.2(9.2, 11.1)	10.7(9.8, 11.8)	9.9(9.1, 10.7)^**
ALB/(g/L)	39.3(34.7, 43.2)	41.0(37.8, 44.1)	38.5(33.3, 42.7)^**
CRP/(mg/L)	10.3(1.6, 29.6)	1.7(0.5, 9.2)	13.7(4.0, 33.0)^**
ESR/(mm/h)	17.5(7.8, 38.3)	9.0(3.0, 22.0)	22.0(9.0, 46.0)^**
PRO评分/分	73.2±38.0	53.4±33.6	80.5±37.1^**
WBC: 白细胞; NEUR: 中性粒细胞比率; LY: 淋巴细胞比率; PLT: 血小板; RBC: 红细胞; HCT: 红细胞压积; MCV: 平均红细胞体积; RDW: 红细胞分布宽度; PDW: 血小板分布宽度; PCT: 血小板压积; MPV: 平均血小板体积; ALB: 白蛋白; CRP: C反应蛋白; ESR: 红细胞沉降率; PRO: 患者报告结局。与缓解期组比较, P < 0.05, *P < 0.01。

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2.3 内镜下疾病活动度的多因素Logistic回归分析

将单因素分析中P < 0.05变量作为自变量，以内镜下疾病是否活动为因变量，进行多因素Logistic回归分析，其中PLT、PCT通过共线性诊断从自变量中剔除。结果显示, RDW(OR=1.525, 95%CI为1.134~2.049, P=0.005)、ESR(OR=1.025, 95%CI为1.000~1.049, P=0.047)和PRO(OR=1.016, 95%CI为1.004~1.027, P=0.007)是CD内镜下疾病活动度的独立危险因素。见表 2。

表 2 内镜下疾病活动度的多因素Logistic回归分析

变量	B	SE	Wald	P	OR	95%CI
LY	-0.018	0.014	1.595	0.207	0.982	0.956~1.010
HCT	0.034	0.037	0.838	0.360	1.035	0.962~1.113
MCV	0.032	0.026	1.548	0.213	1.033	0.982~1.086
RDW	0.422	0.151	7.812	0.005	1.525	1.134~2.049
PDW	-0.115	0.073	2.486	0.115	0.891	0.772~1.028
MPV	-0.228	0.146	2.434	0.119	0.796	0.598~1.060
ALB	-0.025	0.048	0.282	0.595	0.975	0.888~1.071
CRP	-0.010	0.008	1.616	0.204	0.990	0.974~1.006
ESR	0.024	0.012	3.932	0.047	1.025	1.000~1.049
PRO	0.015	0.006	7.325	0.007	1.016	1.004~1.027

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2.4 各指标单独及联合预测内镜下疾病活动度的价值

PRO评分预测CD内镜下疾病活动度的曲线下面积(AUC)为0.708, 临界值为49.5分，灵敏度为78.8%, 特异度为55.0%(P < 0.001); RDW预测内镜下疾病活动度的AUC为0.667, 临界值为13.4%, 灵敏度为54.3%, 特异度为75.0%(P < 0.001); ESR预测内镜下疾病活动度的AUC为0.705, 临界值为25.5 mm/h, 灵敏度为43.9%, 特异度为85.0%(P < 0.001); PRO评分联合RDW、ESR预测CD内镜下疾病活动度的AUC为0.774, 灵敏度为80.5%, 特异度为90.0%(P < 0.001)。见表 3、图 2。

表 3 各指标单独及联合预测内镜下疾病活动度的价值

变量	临界值	AUC	灵敏度/%	特异度/%	约登指数	P
ESR/(mm/h)	25.5	0.705	43.9	85.0	0.289	< 0.001
RDW/%	13.4	0.667	54.3	75.0	0.293	< 0.001
PRO评分/分	49.5	0.708	78.8	55.0	0.337	< 0.001
联合指标	—	0.774	80.5	90.0	0.437	< 0.001
ESR: 红细胞沉降率; RDW: 红细胞分布宽度; PRO: 患者报告结局; AUC: 曲线下面积。

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图 2 PRO评分单独及联合其他指标预测CD内镜下疾病活动度的ROC曲线

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3. 讨论

CD作为一种常见的慢性、非特异性炎性疾病，具有病情易反复发作的临床特点，而准确地评估CD疾病活动度对预防复发、减少并发症和降低手术率有重要的作用。本研究结果显示, PRO评分与SES-CD呈显著正相关。此外，活动期组PRO评分、ESR及RDW显著高于缓解期组，同时也是CD内镜下疾病活动度的独立危险因素。当PRO评分的临界值为49.5分时，其预测CD内镜下疾病活动度的敏感度为78.8%, 特异度为55.0%, AUC为0.708。当PRO评分联合ESR和RDW时，灵敏度、特异度和AUC分别提高到80.5%、90.0%和0.774。

PRO评分是以患者自身症状及感受为基础来反映CD临床疾病活动度的指标，许多研究已经报道了其与CD内镜下疾病活动度的关系。MORRIS M W等^[6]纳入了164例CD患者，发现PRO评分预测CD内镜下疾病活动度的灵敏度和特异度分别为61.0%和55.0%。LEWISJ D等^[5]研究发现, CD患者PRO评分与SES-CD呈轻度正相关(r=0.360, P < 0.001), 与本研究结果(r=0.394, P < 0.001)一致；进一步将患者按照疾病位置进行亚组分析，在病变单纯累及结肠的CD患者中, PRO评分与SES-CD的相关系数提高到了0.440, 这说明在结肠型CD患者中, PRO评分与内镜活动有着更好的相关性(P < 0.001)。

ESR是反映全身性炎症反应的可靠指标，其病理性升高主要见于感染、癌症或自身免疫病等炎症性疾病。MAK L Y等^[9]发现CD患者的ESR临界值为25.0 mm/h时，区别内镜下活动期和缓解期的灵敏度为55.6%, 特异度为71.4%。ALPER A等^[12]发现当ESR作为二分类变量时，与CD患者的临床活动、内镜下活动及组织学活动密切相关; 当ESR作为连续性变量时，只与内镜下活动和组织学活动相关。本研究中，将ESR作为连续性变量时，其预测内镜下疾病活动度的临界值为25.5 mm/h, 灵敏度为43.9%, 特异度为85.0%, AUC为0.705。RDW是衡量外周血红细胞大小的定量标准，越来越多的研究^[13-14]表明, RDW可以作为CD的预后指标。YEŞIL A等^[15]发现CD活动期患者的RDW水平显著高于缓解期，并且与ESR(r=0.351, P < 0.001)、CRP(r=0.503, P < 0.001)、PLT(r=0.304，P=0.001)等指标相关，当RDW的临界值为14.0%时，可有效鉴别CD内镜下活动。研究^[16]发现炎症性肠病患者RDW临界值为13.15%时，鉴别内镜下活动的灵敏度为38.8%, 特异度为75.3%, AUC为0.561; 将RDW、中性粒细胞与淋巴细胞比值、血小板与淋巴细胞比值联合检测后，灵敏度、特异度、AUC分别提高到69.2%、96.0%、0.862。本研究发现, RDW临界值为13.35%时，鉴别CD内镜下疾病活动度的灵敏度为54.3%, 特异度为75.0%, AUC为0.667; 将RDW、ESR、PRO联合检测后，灵敏度、特异度、AUC分别提高到80.5%、90.0%、0.774。REINISCH W等^[17]将CDAI与粪钙卫蛋白(FC)、CRP联合，预测CD内镜下活动的敏感度为70%, 特异度为63%, AUC为0.63, 均低于本研究结果(敏感度为80.5%, 特异性度为90.0%, AUC为0.774), 与既往研究^[5]结果一致。MORRIS M W等^[6]在PRO评分基础上联合FC、CRP等非侵入性指标预测CD内镜下活动，发现其特异度提高到94.0%，可能与将粪便标志物FC也纳入了联合指标有关。

本研究也存在一定的局限性: 首先，本研究为回顾性单中心研究，样本量总体偏小，可能导致研究结果存在一定偏倚; 其次，本研究未将活动期患者进一步进行亚组分析，无法分析联合指标对疾病活动期严重程度的预测价值; 最后, SES-CD作为评估内镜活动的标准，不能准确反映小肠及手术后CD患者的情况。

总之, PRO评分联合ESR和RDW能提高预测CD患者内镜下疾病活动度的准确性，是便捷且可靠的非侵入性评估指标，但后续仍需要开展多中心研究来进一步验证。

参考文献(26)

Jemal A, Bray F, Center M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

Gershenwald J E, Guy G P Jr. Stemming the rising incidence of melanoma: calling prevention to action[J]. J Natl Cancer Inst, 2016, 108(1): 381-387.

Zhu Y, Ma N, Li H X, et al. Berberine induces apoptosis and DNA damage in MG-63 human osteosarcoma cells[J]. Mol Med Rep, 2014, 10(4): 1734-1738.

Li X N, Zhang A H, Sun H, et al. Metabolic characterization and pathway analysis of berberine protects against prostate cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(39): 65022-65041.

Li M, Zhang M, Zhang Z L, et al. Induction of apoptosis by berberine in hepatocellular carcinoma HepG2 cells via downregulation of NF-κB[J]. Oncol Res, 2017, 25(2): 233-239.

LYU Y, Han B B, Yu H L, et al. Berberine regulates the microRNA-21-ITGΒ4-PDCD4 Axis and inhibits colon cancer viability[J]. Oncol Lett, 2018, 15(4): 5971-5976.

Matsuhashi S, Manirujjaman M, Hamajima H, et al. Control mechanisms of the tumor suppressor PDCD4: expression and functions[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(9): E2304-E2309.

Wang Q, Zhu J, Wang Y W, et al. Tumor suppressor Pdcd4 attenuates Sin1 translation to inhibit invasion in colon carcinoma[J]. Oncogene, 2017, 36(45): 6225-6234.

Shibahara K, Asano M, Ishida Y, et al. Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death[J]. Gene, 1995, 166(2): 297-301.

Soejima H, Miyoshi O, Yoshinaga H, et al. Assignment of the programmed cell death 4 gene(PDCD4)to human chromosome band 10q24 by in situ hybridization[J]. Cytogenet Cell Genet, 1999, 87(1/2): 113-114.

Suzuki C, Garces R G, Edmonds K A, et al. PDCD4 inhibits translation initiation by binding to eIF4A using both its MA3 domains[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(9): 3274-3279.

Yang H S, Cho M H, Zakowicz H, et al. A novel function of the MA-3 domains in transformation and translation suppressor Pdcd4 is essential for its binding to eukaryotic translation initiation factor 4A[J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(9): 3894-3906.

Ortiz L M, Lombardi P, Tillhon M, et al. Berberine, an Epiphany against cancer[J]. Molecules, 2014, 19(8): 12349-12367.

Wang Y, Liu Y F, Du X Y, et al. The anti-cancer mechanisms of berberine: a review[J]. Cancer Manag Res, 2020, 12: 695-702.

Wang C, Li J K, Li H Z, et al. The importance of expressing PDCD4 and PDCD5 anti-oncogenes in glioma[J]. J Biol Regul Homeost Agents, 2018, 32(3): 731-736.

Zhao M X, Ding L, Yang Y, et al. Aberrant expression of PDCD4/eIF4A1 signal predicts postoperative recurrence for early-stage oral squamous cell carcinoma[J]. Cancer Manag Res, 2019, 11: 9553-9562.

Zhang J D, Ma L, Shi D M, et al. Prognostic significance of miR-21 and PDCD4 in patients with stage Ⅱesophageal carcinoma after surgical resection[J]. J Cell Biochem, 2018, 119(6): 4783-4791.

Chen Y, Knösel T, Kristiansen G, et al. Loss of PDCD4 expression in human lung cancer correlates with tumour progression and prognosis[J]. J Pathol, 2003, 200(5): 640-646.

Afonja O, Juste D, Das S, et al. Induction of PDCD4 tumor suppressor gene expression by RAR agonists, antiestrogen and HER-2/neu antagonist in breast cancer cells. Evidence for a role in apoptosis[J]. Oncogene, 2004, 23(49): 8135-8145.

Zhang H, Ozaki I, Mizuta T, et al. Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-beta1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene, 2006, 25(45): 6101-6112.

Motoyama K, Inoue H, Mimori K, et al. Clinicopathological and prognostic significance of PDCD4 and microRNA-21 in human gastric cancer[J]. Int J Oncol, 2010, 36(5): 1089-1095.

Long J L, Yin Y T, Guo H N, et al. The mechanisms and clinical significance of PDCD4 in colorectal cancer[J]. Gene, 2019, 680: 59-64.

Ye Y F, Yang S N, Han Y P, et al. Linc00472 suppresses proliferation and promotes apoptosis through elevating PDCD4 expression by sponging miR-196a in colorectal cancer[J]. Aging(Albany NY), 2018, 10(6): 1523-1533.

Jiang Z P, Li L, Hou Z H, et al. LncRNA HAND2-AS1 inhibits 5-fluorouracil resistance by modulating miR-20a/PDCD4 Axis in colorectal cancer[J]. Cell Signal, 2020, 66: 109483.

Xiao J, Pan Y, Li X H, et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4[J]. Cell Death Dis, 2016, 7(6): e2277-2284.

Wang D, Guo S, Han S Y, et al. Distinct roles of different fragments of PDCD4 in regulating the metastatic behavior of B16 melanoma cells[J]. Int J Oncol, 2013, 42(5): 1725-1733.

施引文献(3)

期刊类型引用(3)

1.	林梵，杨晓强，郝勇. 术前血清IgG4水平与克罗恩病患者回结肠切除术后复发的相关性. 广西医学. 2024(01): 59-64 . 百度学术
2.	殷滋，王修石，彭绍贤. 平均血小板体积/淋巴细胞比值与克罗恩病患者内镜评分、疾病活动度的关系. 转化医学杂志. 2024(02): 203-207 . 百度学术
3.	王凌，马晓维. 结肠癌切除术前外周血NLR、PLR、MPV、PCT、ESR水平变化及临床意义. 浙江创伤外科. 2023(05): 829-832 . 百度学术