Raltitrexed versus epirubicin in treatment of unresectable primary liver cancer patients with transarterial chemoembolization
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摘要: 目的 比较雷替曲塞与表柔比星治疗不可切除原发性肝癌(PLC)行经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)患者的疗效及安全性。 方法 将114例不可切除PLC行TACE患者随机分为雷替曲塞组(n=58)和表柔比星组(n=56),2组均行2~5周期TACE治疗。雷替曲塞组采用雷替曲塞联合奥沙利铂治疗,表柔比星组采用表柔比星联合奥沙利铂治疗。比较2组临床疗效、甲胎蛋白(AFP)变化情况、远期疗效、不良反应及预后影响因素。 结果 2组患者均完成2次TACE治疗。雷替曲塞组患者客观有效率、疾病控制率均高于表柔比星组,但差异无统计学意义(P>0.05)。2次TACE术后4周复查发现,雷替曲塞组有24例AFP水平下降,表柔比星组有19例, 2组差异无统计学意义(P>0.05)。随访6、12、24个月时, 2组患者生存率均无显著差异(P>0.05); 随访18个月时,雷替曲塞组患者生存率显著高于表柔比星组患者(P<0.05)。雷替曲塞组中位无进展生存期为12个月(95%CI为10.76~13.26), 表柔比星组中位无进展生存期为9个月(95%CI为8.32~9.88), 差异有统计学意义(P<0.05)。雷替曲塞组中位总生存期为18个月(95%CI为16.85~19.15), 表柔比星组中位总生存期为16个月(95%CI为15.20~16.80), 但差异无统计学意义(P>0.05)。雷替曲塞组术后不良反应发生率显著低于表柔比星组(P<0.05或P<0.01)。雷替曲塞组术后谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平显著低于表柔比星组(P<0.01)。预后影响因素分析结果显示,在治疗具有女性、乙肝、Child-Pugh分级B级、美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分2分、肿瘤多发、肿瘤长径总和大于8 cm、有门脉癌栓、TNM分期Ⅲa期、术前AFP>400 μg/mL等临床特征的患者时,采用雷替曲塞治疗获得的中位生存期显著长于采用表柔比星治疗的患者(P<0.05或P<0.01)。 结论 与表柔比星比较,采用雷替曲塞治疗不可切除PLC患者的临床疗效更好,不良反应更少,患者可以获得更长的中位生存期。Abstract: Objective To compare the efficacy and safety of raltitrexed and epirubicin in the treatment of unresectable primary liver cancer(PLC)patients with transarterial chemoembolization(TACE). Methods Totally 114 unresectable PLC patients with TACE were randomly divided into raltitrexed group(n=58)and epirubicin group(n=56). Both groups were treated with TACE for 2 to 5 cycles. The patients in the raltitrexed group were treated with raltitrexed and oxaliplatin, and those in the epirubicin group were treated with epirubicin and oxaliplatin. The clinical efficacy, change of alpha fetoprotein(AFP), long-term efficacy, adverse reactions and influencing factors of prognosis were compared between the two groups. Results Patients in both groups completed 2 times of TACE treatment. The objective effective rate and disease control rate of raltitrexed group were higher than those of epirubicin group(P>0.05). At four weeks after 2 times of TACE, the decreased AFP - level was observed in 24 cases in the raltitrexed group and 19 cases in the epirubicin group, and there was no significant difference between the two groups(P>0.05). At 6, 12 and 24 months of follow-up, there were no significant differences in survival rates between the two groups(P>0.05). At 18 months of follow-up, the survival rate of the raltitrexed group was significantly higher than that of the epirubicin group(P<0.05). The median progression free survival of the raltitrexed group was 12 months(95%CI: 10.76 to 13.26), which showed no significant difference when compared to 9 months of the epirubicin group(95%CI: 8.32 to 9.88)(P>0.05). The median total survival of the raltitrexed group was 18 months(95%CI: 16.85 to 19.15), which showed no significant difference when compared to 16 months of the epirubicin group(95%CI: 15.20 to 16.80)(P>0.05). The incidence of adverse reactions in the raltitrexed group was significantly lower than that in the epirubicin group(P<0.05 or P<0.01). The levels of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in the raltitrexed group were significantly lower than those in the epirubicin group(P<0.01). The analysis in influencing factors of prognosis showed that the female patients and those with clinical features such as hepatitis B, grade B of Child-Pugh classification, 2 points of Eastern Cancer Collaboration Group(ECOG), multiple tumors, sum of tumor long diameters greater than 8 cm, portal vein tumor thrombus, phase IIIa of TNM classification, and preoperative AFP level over 400 μg/mL were able to achieve longer median survival by raltitrexed than epirubicin(P<0.05 or P<0.01). Conclusion Compared with epirubicin, raltitrexed has a better clinical efficiency in treatment of unresectable PLC patients with TACE, which can cause less adverse reactions and achieve a longer median survival.
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卵巢早衰是一种原发性卵巢功能不全的妇科疾病，是由卵泡衰竭或功能障碍导致的，临床症状有闭经、潮热出汗、性欲减退等，患者的自然怀孕率仅为5%~10%[1]。研究[2]指出，颗粒细胞凋亡能够引起卵泡闭锁，最终导致卵泡减少，表明抑制颗粒细胞凋亡可能是改善卵巢早衰的一种有效方法。雌激素治疗能在一定程度上降低相关并发症的发生风险，但是不能恢复卵巢功能[3]。骨髓间充质干细胞(BMSC)能分化为不同类型的细胞，是干细胞治疗领域的研究热点[4], 有研究[5]指出其能够抑制颗粒细胞凋亡。外泌体是由质膜出芽产生的囊泡，其直径为30~150 nm, 包含膜蛋白、mRNA、非编码RNA物种和DNA, 参与胞间通讯、免疫反应和感染等[6-7]。既往研究[8]指出, BMSC外泌体微小RNA(miRNA)具有治疗卵巢早衰的潜力，但BMSC来源外泌体miR-22-3p是否参与卵巢早衰疾病的发病机制尚未阐明。鉴于环磷酰胺(CTX)能通过促进卵泡中颗粒细胞的凋亡而减少卵母细胞数量[9], 本研究采用CTX诱导卵巢早衰细胞模型，围绕BMSC来源的外泌体以及BMSC来源的外泌体miR-22-3p对卵巢早衰的影响进行研究，现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
NanoSight LM10分析仪购自英国马尔文帕纳科公司; 卵巢颗粒细胞、人骨髓间充质干细胞购自武汉普诺赛生物; miR-22-3p模拟物、模拟物对照、二苯基四氮唑溴盐(MTT)细胞活性试剂盒、外泌体提取试剂盒购自广州锐博生物; 化学发光检测试剂、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自南京诺唯赞生物; DMEM培养基、细胞凋亡检测试剂、SYBR qPCR Master Mix、簇状分化抗原63 (CD63)和簇状分化抗原9(CD9)一抗抗体，磷酸缓冲液(PBS)购自北京索莱宝生物; 透射电子显微镜购自日本jeol公司。
1.2 实验方法
1.2.1 临床样品收集
选取接受体外受精或者第二代试管婴儿治疗的卵巢早衰患者(n=23)以及接受同样治疗的因男性因素不孕的正常志愿者(n=23)提供了卵泡液。所有参与者均提供了知情同意书。卵巢早衰患者的诊断依据为间隔28 d所测量患者的卵泡刺激素>30 IU/L。本院伦理委员会同意此研究。将收集的卵巢液储存在4 ℃冰箱。
1.2.2 BMSC来源外泌体分离及鉴定
将BMSC在DMEM培养基中培养，通过离心(350 g离心10 min)将培养上清(20 mL)收集，转移上清至新的离心管，将离心管放入离心机，在2 000 g条件下离心30 min, 转移上清至新的离心管，将离心管放入离心机，在10 000 g条件下离心20 min, 转移上清至新的离心管; 将约1/3的外泌体提起试剂加到离心管中, 4 ℃静置过夜，将混合液分批在15 000 g转速下离心0.5 h, 弃掉上清液，所得的沉淀包含外泌体保存在-80 ℃冰箱中。分离外泌体的形态学、粒子大小以及标志蛋白，通过透射电子显微镜、NanoSight LM10分析仪以及蛋白免疫印迹的方法进行分析。
1.2.3 细胞处理和分组
卵巢颗粒细胞培养在12孔板，选择汇合度为50%~60%的细胞进行后续实验，将3个孔的细胞暴露在2 μmol/L CTX溶液中24 h以诱导卵巢早衰样的颗粒细胞损伤[8], 对照组细胞(3个孔)在相同量的PBS中孵育，相应处理的细胞记为CTX组和Control组; 将10 μg/mL的外泌体和磷酸盐缓冲液(PBS)分别加到另外6个孔后，细胞在培养箱继续培养48 h, 相应处理的培养孔记为外泌体孵育组和PBS处理组; 其他12个培养孔被分为4组(CTX+miR-22-3p组、CTX+miR-NC组、CTX+Exosomes组以及CTX+PBS组，每组3个培养孔)，一组在加入miR-22-3p模拟物和转染试剂混合物后48 h用CTX诱导，一组在模拟物对照和转染试剂混合物加入后48 h用CTX诱导，一组中的细胞在和分离的外泌体孵育48 h后用CTX诱导24 h, 另外一组中的细胞在和PBS孵育后用CTX诱导，CTX诱导方法同上。上述处理的细胞进行下述实验。
1.2.4 CD63和CD9蛋白表达分析
人BMSC外泌体和颗粒细胞经裂解液裂解，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将裂解液中的蛋白分离，用脱脂奶粉屏蔽非特异的信号后，用CD63以及CD9一抗抗体孵育聚偏二氟乙烯膜，用化学发光检测试剂检测抗体复合物。采用Image Lab软件定量条带灰度值。
1.2.5 miR-22-3p表达分析
卵泡液和颗粒细胞(经外泌体孵育、CTX处理以及转染处理)的RNA提取参照RNeasy 96 QIAcube HT Kit说明书。将RNA和gDNA Wiper Mix在42 ℃反应2 min，将cDNA、引物、RT Mix和HiScript Ⅱ Enayme Mix按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书的条件反应，随后用SYBR qPCR Master Mix定量miR-22-3p的表达。miR-22-3p上游引物和下游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGAAGCTGCCAGTTGAAG-3′和5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′; U6 为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA TA-3′和5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′。
1.2.6 细胞活力分析
在培养颗粒细胞的培养孔中加入MTT试剂，并在37 ℃下孵育4 h, 加入二甲基亚砜后，在室温下孵育10 min, 用酶标仪分析各孔样品。
1.2.7 细胞凋亡分析
采用冷PBS清洗细胞3次，用凋亡检测试剂盒中的碘化丙啶和Annexin V在黑暗条件下染色15 min, 然后用荧光激活细胞分选染色细胞。
1.3 统计学分析
计量资料以(x±s)表示, 2组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 BMSC来源外泌体提取及鉴定
本研究首先利用透射扫描电子显微镜鉴定从BMSC上清中提取外泌体的形态学，结果显示所提取的外泌体具有典型的杯状囊泡(图 1A); 蛋白免疫印迹实验分析显示，外泌体标志蛋白CD63和CD9表达在所提取的细胞上清外泌体中，而在细胞裂解液中没有表达(图 1B); 此外，纳米颗粒跟踪分析结果表明所提取的外泌体粒子大小为80~150 nm(图 1C)。
2.2 miR-22-3p在卵巢早衰患者和CTX诱导的卵巢颗粒细胞中低表达
miR-22-3p在卵巢早衰患者卵泡液中的表达低于输卵管因素不孕症患者卵泡液中表达，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 2A); miR-22-3p在CTX刺激的卵巢颗粒细胞中的表达低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05，图 2B); 与PBS孵育的卵巢颗粒细胞相比, miR-22-3p在BMSC来源的外泌体孵育卵巢颗粒细胞中的表达增加，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 2C)。
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图 2 miR-22-3p在卵泡液、CTX刺激的卵巢颗粒细胞以及BMSC来源的外泌体孵育卵巢颗粒细胞中的表达分析与卵巢早衰患者比较, ****P < 0.000 1; 与Control比较, **P < 0.01; 与PBS处理比较, **P < 0.01。2.3 miR-22-3p过表达减弱CTX处理对卵巢颗粒细胞活力和凋亡的影响
miR-22-3p表达在CTX组中低于对照组，而在CTX+miR-22-3p组的表达高于CTX+miR-NC组，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 3A); 颗粒细胞活力在CTX组中低于对照组，但在CTX+miR-22-3p组高于CTX+miR-NC组，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 3B); 此外，颗粒细胞凋亡率在CTX组高于对照组，但在CTX+miR-22-3p组低于CTX+miR-NC组，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 3C)。
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图 3 miR-22-3p过表达减弱CTX处理对卵巢颗粒细胞活力和凋亡的影响A: miR-22-3p表达分析; B、C: 细胞活力和凋亡分析。与CTX组比较, ***P < 0.001;
与CTX+miR-NC组比较, **P < 0.01, ***P < 0.001。2.4 BMSC来源的外泌体保护卵巢颗粒细胞反抗CTX诱导的损伤
miR-22-3p表达在CTX组低于Control组，而在CTX+Exosomes组表达高于CTX+PBS组，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 4A); 颗粒细胞活力在CTX组低于Control组，但在CTX+Exosomes组高于CTX+PBS组，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 4B); 颗粒细胞凋亡率在CTX组高于Control组，但在CTX+Exosomes组低于CTX+PBS组，差异有统计学意义(P < 0.05, 图 4C)。
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图 4 BMSC来源的外泌体保护卵巢颗粒细胞反抗CTX诱导的损伤A: miR-22-3p表达分析; B、C: 细胞活力和凋亡分析。与CTX组比较, ***P < 0.001; 与CTX+PBS组比较, **P < 0.01。3. 讨论
卵巢早衰表现为40岁前卵巢功能不全，当前的治疗手段主要包括激素替代治疗、间充质干细胞治疗、富含血小板血浆自体注射、体外激活治疗、外泌体和miRNA治疗[3, 11], 但这些治疗方法的疗效和预后较差。研究[12]表明，间充质干细胞是一种有希望治疗包括卵巢早衰在内引起不孕的方法，其优势在于丰富度高，涉及的伦理问题少，自我更新能力强。本研究围绕BMSC来源的外泌体对卵巢早衰的影响及机制展开研究，结果表明, BMSC来源的外泌体及BMSC来源外泌体的miR-22-3p抑制CTX诱导卵巢颗粒细胞损伤过程。
在很多疾病中已研究BMSC来源外泌体的疗效，例如SENGUPTA V等[13]指出异基因BMSC外泌体能够提高新型冠状病毒患者临床状况及氧合情况。BMSC外泌体在散发性阿尔兹海默氏病小鼠模型中限制胶质细胞过度激活[14], 而且BMSC外泌体能够降低顺铂对卵巢的伤害[15]。本研究结果表明，颗粒细胞活力在CTX组低于对照组，但在CTX+Exosomes组高于对照组; 另外，颗粒细胞凋亡率在CTX组高于对照组，但在CTX+Exosomes组低于对照组，表明BMSC来源的外泌体保护卵巢颗粒细胞反抗CTX诱导的损伤。研究[8]表明, BMSC来源外泌体的miR-644-5p表达在颗粒细胞中下调能够消除BMSC来源外泌体对顺铂诱导凋亡的影响。研究[16]指出, BMSC来源外泌体的miR-144-5p参与BMSC来源外泌体对卵巢滤泡闭锁的调控作用。研究[17]发现, miR-22-3p在卵巢早衰患者的血浆中表达下调，且人脐带间充质干细胞分泌外泌体的miR-22-3p降低颗粒细胞凋亡率[18]。本研究发现, miR-22-3p在卵巢早衰患者卵泡液和CTX刺激的卵巢颗粒细胞中的表达低于对照组，而且miR-22-3p在BMSC来源的外泌体孵育卵巢颗粒细胞中的表达显著增加; 此外, miR-22-3p表达和颗粒细胞活力在CTX组低于对照组，而其在CTX+miR-22-3p组表达高于CTX+miR-NC组; 颗粒细胞凋亡率在CTX组高于对照组，但在CTX+miR-22-3p组低于CTX+miR-NC组，说明miR-22-3p过表达减弱CTX处理对卵巢颗粒细胞活力和凋亡的影响。
综上所述，本研究揭示了BMSC来源的外泌体miR-22-3p在卵巢颗粒细胞损伤中的保护作用，拓展了对外泌体生物学功能的认识，为卵巢早衰的防治提供了新的策略。但本研究所用的临床数据较少，得到的结果只是在单个细胞模型中验证，存在模型单一问题，还有待进一步研究。
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