尿酸盐水解酶假基因在子痫前期胎盘组织的表达及其分子机制

李巍巍; 李彦姝

doi:10.7619/jcmp.20201297

尿酸盐水解酶假基因在子痫前期胎盘组织的表达及其分子机制

李巍巍¹,
李彦姝²

1.
中国医科大学附属第一医院产科, 辽宁沈阳, 110001
2.
中国医科大学细胞生物学实验室, 辽宁沈阳, 110013

基金项目: 辽宁省教育厅基金支持项目（L2010612）

详细信息

中图分类号: R714.7;R34
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出版历程
- 收稿日期: 2020-10-30
- 网络出版日期: 2021-04-08
- 发布日期: 2021-03-27

Expression of urate hydrolase pseudogene in placentae tissues of preeclampsia and its molecular mechanism

LI Weiwei¹,
LI Yanshu²

1.
Department of Obstetrics, The First Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang, Liaoning, 110001
2.
Laboratory of Cell Biology, China Medical University, Shenyang, Liaoning, 110013

摘要

摘要:
目的探讨长链非编码RNA（LncRNA）尿酸盐水解酶假基因（URAHP）在子痫前期胎盘组织中的异常表达及其对滋养层细胞增生、侵袭的影响。
方法选取子痫前期及正常孕妇胎盘组织6例，其中PE组纳入子痫前期患者3例，对照组纳入正常妊娠孕妇3例。筛选2组差异表达LncRNA和miRNA；分析LncRNA URAHP在2组胎盘组织中的差异表达。采用CCK-8法，分析URAHP对滋养层细胞增生及侵袭的影响。测定URAHP和吻素受体（KISS1R）在JAR、JET-3、HTR-8/SVneo细胞系中的表达。
结果通过分析鉴定了205个差异表达基因，其中56个上调，149个下调。与正常妊娠相比，子痫前期患者胎盘组织中假基因URAHP表达增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。URAHP的下调可改变JAR/JET-3细胞增殖能力；URAHP过表达可促进HTR-8/SVneo细胞增殖。KISS1R是URAHP在子痫前期胎盘中的共表达基因。
结论假基因URAHP可能与子痫前期发病有关。
- 长链非编码RNA /
- 尿酸盐水解酶假基因 /
- 子痫前期 /
- 胎盘 /
- 细胞增殖
Abstract:
Objective To investigate the abnormal expression of long non-coding RNA (LncRNA) urate hydrolase pseudogene (URAHP) in the placental tissue of preeclampsia and its effects on proliferation and invasion of trophoblast cells.
Methods Six cases of preeclampsia and normal maternal placental tissue were selected, among whom three patients with preeclampsia were selected as PE group, and three normal pregnant women as control group. The differentially expressed LncRNAs and miRNAs in the two groups were screened; the differential expression of LncRNA URAHP in the placental tissues of the two groups was analyzed. CCK-8 method were used to analyze the effects of URAHP on trophoblastic proliferation and invasion. The expressions of URAHP as well as KISS1R in JAR, JET-3 and HTR-8/SVneo cell lines were determined.
Results A total of 205 differentially expressed genes were identified, among which 56 were up-regulated and 149 were down-regulated. The expression of URAHP pseudogenes was significantly increased in placental tissues of preeclampsia patients compared with those of the normal pregnant women (P < 0.05). Downregulation of URAHP could change the proliferation ability of JAR/Jet-3 cells; the overexpression of URAHP promoted the proliferation of HTR-8/SVneo cells. KISS1R was the co-expression gene of URAHP in the placenta of preeclampsia.
Conclusion Pseudogene URAHP may be associated with the onset of preeclampsia.
- long non-coding RNA /
- urate hydrolase pseudogene /
- preeclampsia /
- placenta /
- cell proliferation

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前列腺是男性生殖系统中的附属腺体，具有分泌激素及控制排尿等功能。目前，中国前列腺恶性病变的发病率及致死率呈连续增长趋势。前列腺良性病变可直接影响患者排尿功能，前列腺癌可加重患者排尿功能异常程度, 2种疾病症状相似，难以通过常规MRI进行诊断^[1]。磁共振动态增强扫描(DCE-MRI)是基于MRI发展而来的一种检查技术，在注射对比剂后，通过观察对比剂在血管、组织中的分布及清除情况，以评价病变性质^[2]。信号强度-时间曲线(SI-T曲线)可反映DCE-MRI信号强度随时间变化情况，能量化评价病变组织血供特点。相关研究^[3]指出，前列腺癌存在DCE-MRI早期、快速及明显强化。前列腺癌组织微血管丰富，且微血管系统通透性高，新生毛细血管具有不连续的基底膜，可使对比剂进入肿瘤组织。基于此，本研究探讨DCE-MRI及SI-T曲线诊断前列腺良恶性病变的价值，以期为该疾病的临床早期诊断提供参考依据。

1. 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年3月—2022年5月前列腺疾病患者102例为研究对象，并分为良性组65例和恶性组37例。良性组: 年龄41~69岁，平均(56.08±5.14)岁。恶性组: 年龄37~68岁，平均(55.85±5.27)岁。2组年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准: ①符合有关前列腺增生、前列腺癌等诊断标准^[4], 存在尿频、尿急等排尿异常相关症状者; ②临床资料完整者; ③行手术治疗者。排除标准: ①存在泌尿系统畸形者; ②急性前列腺炎患者; ③既往具有腹部手术史患者; ④检查前已进行放化疗治疗者。

1.2 方法

采用飞利浦Achieva 3.0T超导MRI扫描仪及腹部相控阵线圈进行腹部检查，患者取仰卧位，膀胱适当充盈，对前列腺及精囊腺进行扫描，先行常规序列扫描[T1WI横轴位、T2WI横轴位、T2WI矢状位，层厚4.0 mm, 层间距4.5 mm, 视野(FOV): 250 mm×250 mm], 然后行DCE-MRI检查(3DRSSG-TIGRE序列, TR 4.2 ms, TE 1.7，层厚4.0 mm, 矩阵224×208), 经手肘正中静脉注入0.2 mL/kg Gd-DTPA对比剂，流速为25 mL/s, 然后以相同速率注入20 mL氯化钠注射液(扫描前先在患者手背静脉建立通道，注入生理盐水约10 mL, 速率为2~3 mL/s, 观察有无外漏)。当对比剂注入可连续扫描12个时相，采用康达工作站MyRian软件对数据进行分析。选择感兴趣区域(ROI)时需避开肉眼可见的出血、坏死、液化，在病灶最大层面，选择强化最明显区域为ROI。绘制SI-T曲线，并计算达峰时间、强化程度及强化率。

1.3 观察指标

比较前列腺良恶性病变患者的DCE-MRI指标、SI-T曲线类型及相关参数，并分析各指标联合检测对前列腺良恶性病变的诊断价值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件处理数据，计数资料以[n(%)]表示，采用χ²检验比较组间差异; 符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，采用t检验比较组间差异; 采用受试者工作特征(ROC)曲线分析DCE-MRI及SI-T曲线相关指标对前列腺良恶性病变的诊断价值。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 前列腺良恶性病变患者的DCE-MRI指标比较

恶性组患者的容量转移常数(Ktrans)、速率常数(Kep)、血管外细胞外间隙容积比(Ve)大于良性组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。前列腺恶性病变患者MRI图像见图 1。

表 1 前列腺良恶性病变患者的DCE-MRI指标比较(x±s)

组别	n	Ktrans/min	Kep/min	Ve
良性组	65	0.68±0.08	0.61±0.05	0.64±0.04
恶性组	37	0.73±0.06^*	0.67±0.06^*	0.68±0.05^*
与良性组比较, * P < 0.05。

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图 1 1例患者前列腺恶性病变MRI图像

A: T2WI图像，前列腺右侧外周带及中央区可见局灶性低信号影; B: 扩散加权成像(DWI) 呈高信号; C: 表观扩散系数(ADC)呈低信号, ROI内ADC=0.868×10^-3 mm²/s; D: DCE-MRI早期病灶明显强化; E: SI-T曲线为速升缓降型。

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2.2 前列腺良恶性病变患者的SI-T曲线比较

前列腺良恶性病变患者的SI-T曲线类型比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。恶性组患者的SI-T曲线速升缓降型占比高于良性组，持续缓升型、缓升平台型占比低于良性组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。

表 2 前列腺良恶性病变患者的SI-T曲线比较[n(%)]

组别	n	持续缓升型	缓升平台型	速升平台型	速升缓降型
良性组	65	19(29.23)	23(35.38)	18(27.69)	5(7.69)
恶性组	37	2(5.41)^*	5(13.51)^*	12(32.43)	18(48.65)^*
与良性组比较, * P < 0.05。

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2.3 前列腺良恶性病变患者的SI-T曲线参数比较

恶性组患者的达峰时间短于良性组，强化程度、强化率高于良性组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。

表 3 前列腺良恶性病变患者的SI-T曲线参数比较(x±s)

组别	n	达峰时间/s	强化程度/%	强化率/%
良性组	65	126.27±20.49	153.05±10.31	18.15±4.92
恶性组	37	101.15±18.57^*	160.89±9.04^*	24.71±5.08^*
与良性组比较, * P < 0.05。

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2.4 DCE-MRI指标及SI-T曲线参数对前列腺良恶性病变的诊断价值

联合检测诊断前列腺良恶性病变的曲线下面积(AUC)大于DCE-MRI指标及SI-T曲线参数单独检测，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 4、图 2。

表 4 DCE-MRI指标及SI-T曲线参数对前列腺良恶性病变的诊断价值

指标		截点值	AUC	SE	95%CI	敏感度/%	特异度/%
DCE-MRI指标	Ktrans	0.72 min	0.693^*	0.053	0.590~0.796	58.46	70.27
	Kep	0.64 min	0.777^*	0.049	0.681~0.873	83.08	65.16
	Ve	0.68	0.757^*	0.051	0.657~0.857	86.15	54.05
SI-T曲线	达峰时间	119.59 s	0.828^*	0.043	0.743~0.913	64.62	86.49
	强化程度	152.58%	0.731^*	0.051	0.631~0.830	49.23	86.49
	强化率	23.31%	0.806^*	0.049	0.711~0.902	95.38	59.46
联合检测			0.982	0.014	0.954~1.000	98.46	94.59
Ktrans: 容量转移常数; Kep: 速率常数; Ve: 血管外细胞外间隙容积比。与联合检测比较, * P < 0.05。

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图 2 DCE-MRI指标及SI-T曲线参数诊断前列腺良恶性病变的ROC曲线

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3. 讨论

前列腺癌指前列腺上皮性恶性肿瘤，是中老年男性常见恶性肿瘤疾病，随着社会老龄化程度加剧，前列腺癌发生率呈升高趋势^[5-6]。既往研究^[7-8]发现，常规超声、磁共振成像(MRI)等难以准确鉴别前列腺癌及良性病变，故需探究一种诊断准确率高的检查方法。DCE-MRI是一种常见的检查方法，主要基于病变区血供多少、血管通透性及细胞外间隙大小等参数进行检查，可反映新生血管特性^[9-11]。本研究结果显示，恶性病变患者的Ktrans、Kep、Ve值大于良性病变患者，即前列腺恶性病变患者新生血管形成较为旺盛，与相关研究结果相符。

DCE-MRI在组织和肿瘤血管生理特性的评估中表现出无创性成像的优势，在静脉团注对比剂后，可显示组织、血管中浓度的变化，进而可观察到肿瘤新生血管通透性的改变、肿瘤血管生成^[12-14]。SI-T曲线是随时间而变化的DCE-MRI信号，可反映ROI组织造影剂廓清特性。相关研究^[15-17]指出，达峰时间、强化率等SI-T曲线指标可较好地反映前列腺组织微循环特点。达峰时间主要反映对比剂流入组织的速度。前列腺癌血管密度增加，新生毛细血管基底膜不连续、管径粗细不均及管壁缺乏肌层和基底膜，导致血管通透性增加，对比剂廓清较快，故早期强化明显^[18-20]。本研究结果显示，恶性病变患者的达峰时间短于良性病变患者，强化程度、强化率高于良性病变患者，表明恶性病变存在DCE-MRI早期强化现象，这主要是因为前列腺癌组织血管较为丰富，新生血管不成熟，肿瘤血管内皮不完整，血管壁通透性增加，血管阻力较小，MRI动态增强扫描表现为达峰时间明显缩短，强化率增加，呈现为明显早期强化等特点^[21-23]。此外，本研究结果显示，联合检测诊断前列腺良恶性病变的AUC大于DCE-MRI指标及SI-T曲线参数单独检测，表明联合检查对前列腺良恶性病具有较好的诊断价值，提示或可用DCE-MRI对前列腺病变进行早期诊断。

临床研究^[24]显示，恶性肿瘤的生长、浸润及转移均依赖于新生血管生成，且新生肿瘤微血管的形态及功能均不同于正常血管。肿瘤微血管通透性增加，血管内皮细胞间隙及血管流动性也与正常血管有较大差异。SI-T曲线是一种能对肿瘤微循环生理功能状态进行“成像”的影像学方法，能得到肿瘤强化过程中更精确的信息，可量化反映病变组织血供情况。研究^[25]表明，SI-T曲线测量参数与肿瘤血管生成功能高度相关。临床资料^[26]显示，前列腺良恶性病变组织新生血管较正常前列腺组织丰富，在进行DCE-MRI扫描时，表现为早期明显强化现象，而前列腺增生组织血管密度较大，血管腔内对比剂难以进行组织间隙，故在SI-T曲线中表现为早期强化后持续性增高，或出现平台期。本研究发现，前列腺良性病变中持续缓升型、缓升平台型较多，且前列腺癌患者中SI-T曲线速升平台型、速升缓降型检出率较高，这主要与癌组织中的血管分布不均、粗细不均及新生血管壁不成熟、血管壁基底膜不连续、血管通透性增高有关。

综上所述, DCE-MRI及SI-T曲线联合检查对前列腺良恶性病变具有较好的诊断价值。

图 1 URAHP在胎盘组织中的表达

A: 子痫前期胎盘组织差异表达的lncRNA聚类分析图;
B: 子痫前期胎盘组织差异表达的mRNA聚类分析图;
C: URAHP在子痫前期、正常妊娠胎盘组织中的表达；与Control组比较, **P < 0.01。
D: URAHP在细胞系HTR-8/SVneo、JAR、JET-3的表达。与HTR-8/SVneo比较, *P < 0.05, **P < 0.01。

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图 2 差异表达基因热图

A: 78个差异表达的基因热图; B: 7个PE相关基因热图。

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图 3 Web基因本体注释图和GO富集分析图

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图 4 URAHP过表达HTR-8/SVneo细胞增殖的影响

A: 转染OE-URAHP的HT R-8/SVneo细胞中URAHP的表达；与Control比较, **P < 0.01。
B: URAHP过表达对OE-URAHP组的细胞生长影响。与Control比较, *P < 0.05, **P < 0.01。

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图 5 敲低URAHP抑制毛膜癌细胞增殖

A: shRNA-URAHP转染至JAR细胞系对URAHP的表达的影响；与NC比较, **P < 0.01。
B: shRNA-URAHP转染至JET-3细胞系中对URAHP的表达的影响；与NC比较, *P < 0.05。
C: 敲低URAHP对JAR细胞增殖能力的影响; D: 敲低URAHP对JET-3细胞增殖能力的影响;
E: 转染shRNA-URAHP对JAR细胞的影响; F: 转染shRNA-URAHP对JET-3细胞的影响。

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图 6 URAHP调控KISS1R表达

A: KISS1R在子痫前期胎盘的mRNA表达; B: KISS1R在子痫前期胎盘的蛋白表达;
C: URAHP过表达对JAR细胞系中KISS1R mRNA表达的影响;
D: URAHP过表达对JET-3细胞系中KISS1R mRNA表达的影响;
E: URAHP过表达对JAR细胞系中KISS1R蛋白表达的影响;
F: URAHP过表达对JET-3细胞系中KISS1R蛋白表达的影响。与Control比较, *P < 0.05, **P < 0.01。

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表 1 基因的特异性引物信息表

引物名称	引物序列5′→3′	扩增长度/bp
URAHP	上游引物: AGGTGTCAATGAAGTTAGTGCCA	287
	下游引物: ATCTTCCCAGCGAGATGTCC
β-actin	上游引物: GTGGCCGAGGACTTTGATTG	73
	下游引物: CCTGTAACAACGCATCTCATATT

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参考文献(14)

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施引文献(4)

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