勃起功能障碍是指男性阴茎勃起程度无法达到和(或)维持满意的性生活^[1]。糖尿病是引起勃起功能障碍的重要危险因素，而糖尿病性勃起功能障碍(DIED)则会严重影响患者的生活质量^[2]。随着糖尿病患者年龄的增长和病程的延长, DIED发病率逐步升高，超过50%的男性糖尿病患者在确诊后10年内会发生DIED。目前，临床上DIED的治疗难度较大，可能与患者的阴茎血管内皮和平滑肌病变、神经功能障碍、性激素水平紊乱等因素有关^[3]。5型磷酸二酯酶抑制剂(PDE5i)是治疗DIED的首选方案，但仍有近1/3的DIED患者口服PDE5i治疗后无效^[4]。干细胞移植[包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)]已逐渐成为勃起功能障碍的潜在治疗方法，由于iPSC来源于自体细胞，既无伦理道德问题，也无免疫抑制问题，因此与胚胎干细胞相比具有较大的优越性。本研究探讨携带神经营养素-3基因过表达的iPSC(iPSC-NT-3)移植入DIED大鼠阴茎海绵体后对勃起功能的干预作用，现报告如下。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

1.1.1   动物

12周龄雄性无特定病原体(SPF)级SD大鼠40只，体质量350~400 g, 购自南通大学医学院实验动物中心[动物合格证号: SCXK(苏)2019-0001]。所有大鼠适应性饲喂1周，光照10~12 h/d, 湿度为(65±5)%, 温度为(25±2) ℃, 自由摄食与饮水。

1.1.2   主要药品和试剂

iPSC和NT-3基因过表达的iPSC由本课题组构建，将携带绿色荧光蛋白(GFP)单因子NT-3慢病毒转染至iPS, 免疫感染72 h后将细胞固定，进行核Hoechst染色，在荧光显微镜观察可见NT-3基因过表达的iPSC发绿色荧光, GFP呈高表达; 而iPS不带荧光。转染后纯度超过85%。链脲佐菌素、阿朴吗啡(APO)、多聚甲醛、柠檬酸和柠檬酸钠购自美国Sigma公司; HE染色试剂盒和甘油明胶封片液购自碧云天生物技术有限公司; Trizol总RNA抽提试剂、逆转录试剂盒和Super Real Pre Mix Plus试剂购自天根生化科技公司; 蛋白提取试剂、BCA蛋白定量试剂盒均购自北京华英生物技术研究所; 变性聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶快速制备试剂盒、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠抗体购自上海生工生物工程股份有限公司; NT-3抗体购自英国Abcam公司; CD31兔抗鼠抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司; 血管内皮生长因子(VEGF)购自武汉博士德生物工程有限公司; 内皮型一氧化氮合酶(eNOS)购自北京博奥森生物技术有限公司; 结蛋白(Desmin)购自美国Santa Cruz公司; α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)购自美国Proteintech Group公司。NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin、α-SMA和GAPDH引物由上海生工公司合成，引物序列见表 1。

表  1  PCR的引物序列

引物名称	引物序列
NT-3	forward: 5′- CGTGGCCATTGAACACAGCA - 3′
	reverse: 5′- CCCACTGGCGGGTAAGGAAA - 3′
CD31	forward: 5′- CATGGTGGAGCACAGTGGCA - 3′
	reverse: 5′- TGGGATGGAGCAGGACAGGTT - 3′
VEGF	forward: 5′- CCCACCCACATACATACATT - 3′
	reverse: 5′- CTCCCAACTCAAGTCCACA - 3′
eNOS	forward: 5′- CTG TGC TGG CAT ACA GAA CC - 3′
	reverse: 5′- CTG CCT TGA GTT GGC TCA TC - 3′
Desmin	forward: 5′- CTTGATGAGGCAGATGAGGGA - 3′
	reverse: 5′- AGCTTCCGGTAGGTGGCAAT - 3′
α-SMA	forward: 5′- TTCCCATCCATCGTG - 3′
	reverse: 5′- GCCTTAGG GTTCAGC - 3′
GAPDH	forward: 5′- GAG AGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′
	reverse: 5′- CAT CTG CTG GAA GGT GGA CT-3′

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1.1.3   主要仪器

微量移液器购自德国Eppendorf公司; 血糖仪和试纸购自德国Roche公司; Fresco 21型低温冷冻离心机和Multiskan Sky全自动酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司; 迈瑞BS-420全自动生化分析仪购自深圳迈瑞公司; BL420S型多通道生理记录仪购自成都泰盟有限公司; 旋转式组织脱水机、组织包埋机购自日本SAKURA公司; 9700型PCR仪购自美国ABI公司; Western-blot电泳仪、电转仪购自美国Bio-Red公司。

1.2   实验方法

1.2.1   模型制备^[5]

32只大鼠造模前禁食不禁水12 h, 腹腔注射链脲佐菌素溶液(50 mg/kg), 注射后第7、14天尾静脉取血测血糖，随机血糖>16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。大鼠颈部皮下注射APO(100 μg/kg), 记录30 min内大鼠阴茎勃起次数，阴茎勃起次数≥1次视为造模成功。本实验DIED的造模成功率为81.25%(26/32), 剩余8只大鼠注射同体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，并设为正常对照组。

1.2.2   分组和给药

选择24只造模成功的DIED大鼠，随机分为模型对照组、iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组，每组8只。各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg进行麻醉, iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组分别将iPSC和iPSC-NT-3按1×10⁶/只用微量注射针注射入大鼠阴茎海绵体内，正常对照组和模型对照组大鼠阴茎注射同体积的磷酸缓冲液。

1.3   观察指标

治疗后第4周观察各组大鼠的一般情况，评估性功能和阴茎勃起功能。取阴茎组织于-70 ℃下保存，分别采用定量聚合酶链反应(q-PCR)和Western blot实验检测NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin、α-SMA基因和蛋白的表达。

1.3.1   一般情况评估

治疗前和治疗4周后，分别测量各组大鼠的体质量和血糖。

1.3.2   性功能评估

各组大鼠治疗4周后分别皮下注射苯甲酸雌二醇20 μg(评估前48 h)和黄体酮500 μg(评估前4 h)以诱导雌鼠发情，将各组大鼠与发情的雌鼠合笼，正常实验室常规照明灯光下，通过摄像头远距离观察大鼠性行为，观察时间为30 min, 包括阴茎勃起潜伏期、勃起次数，记录首次爬背时间, 30 min内舔嗅次数、骑跨次数和插入次数。灯光和近距离观察不会对其性行为造成影响。

1.3.3   勃起功能评估

各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg, 固定后分离其右侧颈总动脉，随后将PE-50导管(含250 IU/mL肝素溶液)置入颈总动脉，并连接多通道生理记录仪测定颈总动脉平均动脉压(MAP)。暴露大鼠下腹正中切口，游离其海绵体神经，剪开阴茎根部上覆盖的皮肤，暴露双侧阴茎脚，分离阴茎根部，将22G针头(含250 IU/mL肝素溶液)置入一侧阴茎海绵体后，通过PE-50导管连接多通道生理记录仪，测定阴茎海绵窦内压(ICP)。将双钩银丝电极勾住海绵体神经进行刺激(5 ms、5 V、15 Hz, 刺激时间1 min, 间隔时间5 min), 记录ICP和MAP。

1.3.4   阴茎海绵体目标mRNA表达水平检测

取出-70 ℃保存的待测阴茎在室温下解冻，用滤纸吸干水分，称取50 mg, 剪碎后加入Trizol试剂，迅速研磨成组织匀浆，转入RNAase-free EP管中，室温下放置10 min。加三氯甲烷后离心，取上清液，加异丙醇，离心，弃上清液，清洗，加焦碳酸二乙酯(DEPC)水20 μL, 采用ZS-2型板式酶标仪测定RNA浓度，控制RNA在260 nm处的吸光值与在280 nm处的吸光值的比值(A260/A280)在1.9~2.1。采用逆转录试剂盒，以所提取的RNA为模板，加入逆转录引物，合成互补DNA(cDNA)。配制反应体系: SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL, 上游引物1.0 μL, 下游引物1.0 μL, cDNA模板1.0 μL, 纯化水7.0 μL。采用PIKORed 96型实时荧光定量PCR仪进行扩增，条件为: 95 ℃, 10 min; 95 ℃, 15 s; 60 ℃, 1 min; 共40个循环。以GAPDH作为内参照，运用PCR仪分析实验结果，得到样品的Ct值，并计算△Ct, 利用2^-△△Ct法计算目标基因NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA的mRNA相对表达量。

1.3.5   阴茎海绵体目标蛋白表达水平检测

取出-70 ℃保存的待测阴茎在室温下解冻，用滤纸吸干水分，称取50 mg, 加入RIPA裂解液，迅速研磨成组织匀浆，离心，分离得上清液, BCA法测定蛋白浓度。配制SDS-PAGE分离胶(12%)和浓缩胶(5%)。取5 μL蛋白样品上样，进行电泳(60 V下30 min, 90 V下90 min)。电泳结束后将凝胶置于转膜夹中，并在4 ℃下转膜。转膜结束后将膜取出并立即置于5%牛血清白蛋白室温封闭。加入稀释好的NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA一抗，于4 ℃下孵育过夜。滴加稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5~2.0 h, 置于显色剂中进行显色。采用凝胶成像及分析系统进行成像，采用Image J软件分析条带灰度值。以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为统计量，比较各组目的蛋白NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA表达的差异。

1.4   统计学分析

应用SPSS 22.0对数据进行统计分析。计量资料采用(x±s)表示，组间分析采用ANOVA检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   各组大鼠治疗前后体质量和血糖比较

治疗后4周，正常对照组大鼠体质量较治疗前增加，差异有统计学意义(P < 0.05); 治疗前和治疗后4周，模型对照组、iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组大鼠体质量均低于正常对照组，血糖水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P < 0.05); 治疗前和治疗后4周，模型对照组、iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠体质量和血糖水平的组内、组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表  2  各组大鼠治疗前后血糖和体质量比较(x±s)

组别	治疗前			治疗后
	体质量/g	血糖/(mmol/L)		体质量/g	血糖/(mmol/L)
正常对照组(n=8)	424.27±45.28	7.48±1.51		486.82±47.50*	7.63±1.65
模型对照组(n=8)	305.62±37.51#	28.39±4.67#		297.89±41.35#	28.79±4.56#
iPSC治疗组(n=8)	298.35±41.15#	29.05±4.25#		291.46±39.71#	29.47±4.47#
iPSC-NT-3治疗组(n=8)	302.40±39.67#	28.86±4.49#		295.73±42.55#	29.34±4.38#
iPSC: 诱导多能干细胞; iPSC-NT-3: 神经营养素-3基因过表达的iPSC。与治疗前比较, *P < 0.05; 与正常对照组比较, #P < 0.05。

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2.2   各组大鼠治疗后性功能比较

在大鼠首次爬背时间比较中，模型对照组较正常对照组延长, iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组缩短, iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组缩短，差异均有统计学意义(P < 0.05); 在舔嗅次数、骑跨次数和插入次数的比较中，模型对照组均较正常对照组减少, iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组增加, iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组增加，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。

表  3  各组大鼠治疗后性功能比较(x±s)

组别	首次爬背时间/min	舔嗅次数/次	骑跨次数/次	插入次数/次
正常对照组(n=8)	42.15±4.85	39.72±5.29	15.61±2.72	9.41±1.75
模型对照组(n=8)	114.47±23.57*	13.45±2.17*	4.58±1.21*	0*
iPSC治疗组(n=8)	76.21±17.24#	21.86±3.63#	6.62±1.67#	2.79±0.52#
iPSC-NT-3治疗组(n=8)	51.39±15.26#△	27.54±3.75#△	8.95±2.12#△	5.79±0.67#△
与正常对照组比较, *P < 0.05; 与模型对照组比较, #P < 0.05; 与iPSC治疗组比较, △P < 0.05。

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2.3   各组大鼠治疗后勃起功能比较

在ICP和ICP/MAP的比较中，模型对照组较正常对照组降低, iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高, iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 4。

表  4  各组大鼠治疗后勃起功能的比较(x±s)

组别	ICP/mmHg	ICP/MAP/%
正常对照组(n=8)	83.15±5.27	75.39±4.75
模型对照组(n=8)	47.38±3.44*	39.50±3.31*
iPSC治疗组(n=8)	62.61±4.56#	52.75±4.78#
iPSC-NT-3治疗组(n=8)	73.46±5.39#△	66.32±5.17#△
ICP: 海绵窦内压; ICP/MAP: 海绵窦内压占平均动脉压的 比率。与正常对照组比较, *P < 0.05; 与模型对照组比较, #P < 0.05; 与iPSC治疗组比较, △P < 0.05。

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2.4   各组大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA的mRNA表达水平比较

在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA的mRNA表达水平比较中，模型对照组较正常对照组降低, iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高, iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 5。

表  5  各组大鼠治疗后阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA的mRNA表达水平比较(x±s)

组别	NT-3	CD31	VEGF	eNOS	Desmin	α-SMA
正常对照组(n=8)	0.87±0.05	1.12±0.07	1.27±0.09	0.78±0.07	1.34±0.12	1.04±0.07
模型对照组(n=8)	0.25±0.03*	0.51±0.04*	0.65±0.05*	0.24±0.03*	0.67±0.05*	0.47±0.04*
iPSC治疗组(n=8)	0.39±0.05#	0.65±0.05#	0.78±0.07#	0.49±0.05#	0.85±0.07#	0.69±0.05#
iPSC-NT-3治疗组(n=8)	0.64±0.06#△	0.78±0.06#△	0.94±0.06#△	0.62±0.04#△	1.09±0.06#△	0.85±0.05#△
NT-3: 神经营养素-3; VEGF: 血管内皮生长因子; eNOS: 内皮型一氧化氮合酶; Desmin: 结蛋白; α-SMA: α-平滑肌肌动蛋白。 与正常对照组比较, *P < 0.05; 与模型对照组比较, #P < 0.05; 与iPSC治疗组比较, △P < 0.05。

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2.5   各组大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin、α-SMA蛋白水平比较

在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin、α-SMA蛋白水平比较中，模型对照组较正常对照组降低, iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高, iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 6、图 1。

表  6  各组大鼠治疗后阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA蛋白水平比较(x±s)

组别	NT-3	CD31	VEGF	eNOS	Desmin	α-SMA
正常对照组(n=8)	0.53±0.05	0.74±0.06	0.68±0.06	0.43±0.04	0.81±0.07	0.57±0.05
模型对照组(n=8)	0.16±0.03*	0.24±0.02*	0.31±0.03*	0.13±0.02*	0.34±0.03*	0.21±0.03*
iPSC治疗组(n=8)	0.32±0.04#	0.37±0.05#	0.44±0.04#	0.21±0.04#	0.47±0.06#	0.32±0.04#
iPSC-NT-3治疗组(n=8)	0.44±0.06#△	0.51±0.04#△	0.53±0.05#△	0.35±0.04#△	0.63±0.05#△	0.41±0.04#△
与正常对照组比较, *P < 0.05; 与模型对照组比较, #P < 0.05; 与iPSC治疗组比较, △P < 0.05。

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图  1  各组大鼠阴茎海绵体蛋白电泳图

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3.   讨论

DIED的发病机制涉及血管内皮功能障碍、神经病变、平滑肌障碍等，但具体机制尚未完全阐明^[6]。DIED发病起始于阴茎海绵体血管内皮功能障碍，并由此引发神经、平滑肌等一系列病理变化^[7]。临床上ED的首选治疗方案是磷酸二酯酶抑制剂(PDE5i)类药物，其是通过减少一氧化氮合酶(NOS)/环磷酸鸟苷(cGMP)通路上cGMP的降解而发挥对ED的治疗作用。然而, DIED患者阴茎组织释放一氧化氮(NO)显著减少，但是PDE5i药物未能增加阴茎组织中NO的释放，因此约35%的DIED患者口服PDE5i治疗无效。随着干细胞在组织工程领域研究的不断深入，目前已有将脂肪源性干细胞用于DIED的研究^[8-9]报道，并且PEDF转染的脂肪源性干细胞也表现出治疗勃起功能障碍的潜在价值。iPSC不仅具有自我更新与分化为三胚层细胞的能力，而且可以避免干细胞研究中遇到的伦理道德和免疫排斥等问题，在医学研究及临床应用中有着广阔的前景。NT-3是神经营养因子家族的重要成员，对神经元和功能恢复具有重要作用，可改善内源性神经营养因子不足的微环境^[10-11]。

本研究结果显示, iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠首次爬背时间缩短，而舔嗅次数、骑跨次数和插入次数均较模型对照组增加，并且iPSC-NT-3治疗组首次爬背时间较iPSC治疗组缩短，舔嗅次数、骑跨次数和插入次数均增加，上述差异均有统计学意义(P < 0.05), 说明iPSC和iPSC-NT-3可显著提高DIED大鼠的性功能，并且iPSC-NT-3作用优于iPSC。此外, iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠ICP和ICP/MAP均较模型对照组升高, iPSC-NT-3治疗组大鼠ICP和ICP/MAP均较iPSC治疗组升高，差异均有统计学意义(P < 0.05), 说明iPSC和iPSC-NT-3可显著提高DIED大鼠的勃起功能，并且iPSC-NT-3作用优于iPSC。

氮能神经、内皮和平滑肌是阴茎正常勃起的关键。阴茎勃起是在各种刺激作用下中枢和外周神经元中NOS激活，引起阴茎海绵体内皮细胞合成和分泌NO，NO刺激cGMP的产生，并与平滑肌细胞中的cGMP结合，阴茎海绵体平滑肌细胞松弛，动脉血充满海绵体，使阴茎体积增大而勃起^[12]。因此, NOS对NO的合成在阴茎勃起中具有重要作用。研究^[13]发现, NOS有eNOS、神经性一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)共3种亚型，其中eNOS在勃起中起主要作用。本研究结果显示, iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠阴茎海绵组织中eNOS mRNA和其蛋白表达水平均较模型对照组升高，并且iPSC-NT-3治疗组大鼠阴茎海绵组织中eNOS mRNA和其蛋白表达水平均较iPSC治疗组升高，差异有统计学意义(P < 0.05), 说明iPSC和iPSC-NT-3可显著提高DIED大鼠海绵体内eNOS的表达，并且iPSC-NT-3作用优于iPSC。因此, iPSC-NT-3可能通过提高DIED大鼠海绵体内eNOS的表达而促进海绵体NO生成，从而发挥治疗作用。

阴茎海绵体小梁间的腔隙是海绵体窦，海绵体窦的螺旋动脉直接开口于海绵体窦，在阴茎勃起中发挥重要作用。CD31在发育成熟个体的所有血管内皮细胞都有高度表达，主要位于内皮细胞之间的连接部，参与血管内皮细胞单层结构完整性的维持^[14]。作为促血管生成因子, VEGF具有多种功能，包括刺激增殖、抑制凋亡和促进细胞存活, VEGF可通过促进血管内皮细胞表达而改善内皮功能，增加平滑肌数量，从而改善ED大鼠的勃起功能^[15]。本研究结果显示, iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠阴茎海绵组织中CD31、VEGF的mRNA及其蛋白表达水平均较模型对照组升高，并且iPSC-NT-3治疗组大鼠阴茎海绵组织中CD31、VEGF的mRNA及其蛋白表达水平均较iPSC治疗组升高，差异均有统计学意义(P < 0.05), 说明iPSC和iPSC-NT-3可显著提高DIED大鼠海绵体内CD31和VEGF的表达，并且iPSC-NT-3作用优于iPSC。因此, iPSC-NT-3可能通过提高DIED大鼠海绵体内CD31和VEGF的表达而促进海绵体血管生成，从而发挥治疗作用。

平滑肌细胞是阴茎海绵体的主要组成成分，占阴茎海绵体的40%~50%, 而阴茎内神经调控的主要效应器分布在平滑肌，性兴奋时平滑肌松弛，海绵体窦充血，阴茎变硬而勃起。本研究结果显示, iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠阴茎海绵组织中Desmin、α-SMA的mRNA及其蛋白表达水平均较模型对照组升高，并且iPSC-NT-3治疗组大鼠阴茎海绵组织中Desmin、α-SMA的mRNA及其蛋白表达水平均较iPSC治疗组升高，差异均有统计学意义(P < 0.05), 说明iPSC和iPSC-NT-3可显著提高DIED大鼠海绵体内Desmin和α-SMA的表达，并且iPSC-NT-3作用优于iPSC。因此, iPSC-NT-3可能通过提高DIED大鼠海绵体内Desmin和α-SMA的表达而促进海绵体平滑肌生成，从而发挥治疗作用。

综上所述，iPSC-NT-3可通过促进海绵体组织eNOS、血管内皮及平滑肌的生成而改善DIED大鼠的性功能和勃起功能，是一种潜在的治疗DIED的方法。