Effect of anti-vascular endothelial growth factor in treating diabetic macular edema
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摘要: 目的 观察抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗糖尿病性黄斑水肿(DME)的效果和对血清一氧化氮合酶(NOS)、VEGF、白细胞介素-6(IL-6)水平及鼻侧睫状后动脉血流动力学参数的影响。 方法 选取98例DME患者(122眼)作为研究对象,均给予抗VEGF治疗,将治疗敏感者56例(72眼)纳入敏感组,将治疗不敏感者42例(50眼)纳入对照组,比较2组治疗前后黄斑中心凹视网膜厚度、鼻侧睫状后动脉血流动力学参数和血清NOS、VEGF和IL-6水平等。 结果 敏感组视网膜外丛状层连续性中断率为9.72%, 低于对照组的72.00%, 差异有统计学意义(P<0.05); 治疗后,敏感组黄斑中心凹视网膜厚度为(301.12±67.28)μm, 小于对照组的(410.11±52.21)μm, 差异有统计学意义(P<0.05); 治疗后,敏感组收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张末期血流速度(EDV)均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05); 治疗后,敏感组NOS水平高于对照组, VEGF、IL-6水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 抗VEGF治疗DME有一定效果,治疗敏感者的黄斑中心凹视网膜厚度、鼻侧睫状后动脉血流动力学参数和血清NOS、VEGF及IL-6水平明显优于治疗不敏感者。Abstract: Objective To observe the effect of anti-vascular endothelial growth factor(VEGF)in treating diabetic macular edema(DME)and its effects on serum nitric oxide synthase(NOS), VEGF, interleukin-6(IL-6)and hemodynamic parameters of nasal posterior ciliary artery. Methods A total of 98 patients(122 eyes)with DME treated with anti-VEGF were selected as research objects, and 56 patients(72 eyes)who were sensitive to treatment were included in the sensitive group, and 42 patients(50 eyes)who were insensitive to treatment were included in the control group. The macular fovea retinal thickness and hemodynamic parameters of nasal posterior ciliary artery, levels of NOS, VEGF and IL-6 were measured before and after treatment. Results The continuous interruption rate of extraretinal plexiform layer in the treatment sensitive group was 9.72%, which was significantly lower than 72.00% in the treatment insensitive group(P<0.05). The retinal thickness of macular fovea in the sensitive group after treatment was(301.12±67.28)μm, which was significantly lower than(410.11±52.21)μm in the control group(P<0.05). The peak systolic blood flow velocity(PSV)and end diastolic blood flow velocity(EDV)in the treatment sensitive group after treatment were significantly higher than those in the treatment insensitive group(P<0.05). After treatment, the NOS level in the sensitive group was significantly higher than that in the control group(P<0.05), while the levels of VEGF and IL-6 were significantly lower than those in the control group(P<0.05). Conclusion Anti-VEGF therapy has a certain effect in treating DME. Retinal thickness of macular fovea, hemodynamic parameters of nasal posterior ciliary artery, levels of serum NOS, VEGF and IL-6 are significantly better in sensitive patients than those without sensitivity.
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宫腔粘连(IUA)是育龄期女性常见妇科疾病，表现为月经减少、痛经、反复流产等。宫腔镜下宫腔粘连分离术(TCRA)是IUA的一线治疗方案，但术后再粘连率高达62.5%, 妊娠率仅为22.5%[1]。为避免再粘连并促进内膜修复，宫内球囊、羊膜、干细胞等材料逐渐应用于TCRA术后以辅助治疗，但部分患者的妊娠结局仍不理想[2]。富血小板纤维蛋白(PRF)是一种自体血小板浓缩物，可以促进创面愈合，在颌面外科、骨科等领域中广泛应用[3-4]。研究[3]显示，PRF含有的血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等与子宫内膜修复高度相关。本研究采用随机对照研究设计，观察PRF治疗宫腔粘连性不孕症的疗效，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2018年10月—2019年10月北京世纪坛医院收治的IUA患者44例，随机分为PRF组和对照组。纳入标准: ① 18~40岁女性; ②患者存在月经减少、闭经或反复流产等症状; ③宫腔镜确诊为IUA者; ④不孕者; ⑤有生育需求，且要求自然妊娠者; ⑥签署知情同意书者。排除标准: ①合并血液学疾病者; ②治疗前后3个月接受性激素或其他方式治疗IUA者; ③配偶因素所致不孕者; ④存在其他可能导致不孕的因素者，如生殖道畸形、输卵管梗阻或缺失、卵巢储备功能下降或排卵障碍[5]、子宫肌瘤、子宫内膜息肉、子宫内膜异位症、子宫腺肌症等; ⑤术中难以恢复宫腔解剖形态者。卵巢储备功能下降是指双侧卵巢的窦卵泡数 <6个，抗苗勒管激素(AMH)水平 <1.1 ng/mL[6]。本研究已通过伦理委员会审批(伦审新技术39号)，并在中国临床试验注册中心注册(注册号: 1900021518)。
1.2 研究方法
1.2.1 PRF制备
患者至输血科抽取同侧肘静脉血20 mL, 置于不含抗凝剂的真空采血管中。立即放入离心机，以400 g离心力离心10 min, 静置后可观察到淡黄色凝胶状PRF形成[3]。
1.2.2 同质性培训
手术医师需具备副高级职称，每年至少完成200例宫腔镜手术，其中至少30例为TCRA。研究启动前，手术医师需接受技术培训。手术录像接受其他妇科副高级医师质量评价。
1.2.3 研究过程
统计人员制作随机数字表，不了解组别含义的协调员将随机数字与组别装入信封并密封，研究者根据患者入院顺序开启信封确定分组。入组前, 2位手术医师在宫腔镜下评估患者粘连情况并评分，并于黄体期[7]进行经阴道盆腔超声检查，测定子宫内膜厚度(EMT)。入组后，手术操作和PRF置入均于早卵泡期进行。患者均行TCRA分离粘连。TCRA后, PRF组使用无菌镊从采血管取出PRF, 宫腔镜直视下将PRF置入宫腔。撤除宫腔镜，排尽膨宫液，密切观察避免PRF脱落。4周后, PRF组使用无菌镊将PRF置入宫腔，不行宫腔镜。8周后, 2组患者均行宫腔镜二次探查术，必要时分离粘连。干预8周及宫腔镜二次探查术后4周(共计12周)严格避孕，此后嘱患者尝试自然妊娠。
1.2.4 术后随访
宫腔镜二次探查术4周后每月门诊或电话随访1次，共12次。第一次随访时记录月经和盆腔超声情况，此后随访妊娠情况。超声检查由同一位超声医师进行。若随访中患者再次出现经量少或超声提示再粘连，建议患者行宫腔镜检查，必要时手术治疗。
1.3 观察指标
主要观察指标为妊娠率，次要观察指标包括IUA评分、月经、EMT。记录12个月内妊娠情况、干预至妊娠的时间。①生化妊娠: 排卵后14 d血人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)>25 U/L; ②临床妊娠: 排卵4周后宫内发现孕囊; ③持续妊娠: 临床妊娠≥12周; ④异位妊娠: β-HCG阳性、宫内未见孕囊、宫外可见孕囊，病理确诊异位妊娠; ⑤流产: 妊娠不足28周、胎儿体质量不足1 000 g而终止妊娠。采用美国生育协会(AFS)制订的标准[8]进行粘连诊断，并于基线和宫腔镜二次探查术时评分。采用月经失血图(PBAC)[9]记录基线和宫腔镜二次探查术4周后的月经情况。采用同一台超声机器记录基线和宫腔镜二次探查术4周后黄体期EMT。观察不良事件如子宫穿孔、发热、腹痛等发生情况。
1.4 统计学分析
根据文献[1, 10]及预实验结果，假定PRF组妊娠率为70%, 对照组为20%, 1∶1计数资料平行对照差异性检验，取α=0.05, 1-β=0.9, 加之20%脱落率，计算得出PRF组及对照组各需至少19例。采用SPSS 22.0分析数据，正态或近似正态的计量资料采用(x±s)描述，非正态分布采用中位数(M)和四分位数间距(QR)描述，采用t检验或非参数检验比较。计数资料采用频数和百分比进行描述，比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier和Log rank法比较2组妊娠率。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组患者一般情况比较
44例IUA患者中, 3例被排除(2例不符合入组条件, 1例拒绝参加)，最终进入全分析集41例(PRF组20例，对照组21例)。人工流产史15例，清宫史25例，内膜息肉切除史1例，其中至少2次TCRA史19例。2组患者年龄、体质量指数(BMI)、月经情况、IUA评分等基线数据差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。见表 1。对照组1例因拒绝接受宫腔镜二次探查术而脱落，脱落率为2.44%(1/41), 40例(97.56%)患者完成研究。
表 1 2组全分析集患者一般情况比较(x±s)[M(QR)]一般情况 PRF组(n=20) 对照组(n=21) 年龄/岁 32.30±4.38 32.29±4.00 BMI/(kg/m2) 23.03±3.22 22.49±3.23 孕次/次 3.00(1.75) 2.00(1.50) 产次/次 0(1.00) 0(1.00) 宫腔操作史/次 4.00(4.75) 5.00(4.00) 不孕年限/年 1.00(1.00) 2.00(1.00) AMH/(ng/mL) 4.08±1.48 3.75±1.12 月经经期/d 3.00(2.00) 3.00(2.00) 月经经量评分/分 25.00(90.50) 26.00(76.00) IUA评分/分 9.00(3.75) 9.00(4.00) EMT/mm 5.70(3.55) 5.20(2.00) BMI: 体质量指数; AMH: 抗苗勒管激素;
IUA: 宫腔粘连; EMT: 子宫内膜厚度。2.2 2组妊娠情况比较
PRF组临床妊娠14例，临床妊娠率为70.00%(14/20), 对照组临床妊娠4例，临床妊娠率为20.00%(4/20), 差异有统计学意义(P < 0.01); PRF组、对照组的中位干预至妊娠时间分别为4.5、6.5个月，差异有统计学意义(P < 0.01)。2组孕妇均自然妊娠且持续妊娠，无异位妊娠及流产。随访期间未发生胎盘植入、子宫破裂等并发症。
2.3 2组IUA情况比较
宫腔镜二次探查术显示, 2组IUA评分均较干预前降低，且PRF组干预后IUA评分低于对照组，差异均有统计学意义(P=0.01)。见表 2。PRF组干预后IUA严重程度分级低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 2 2组干预前后IUA评分比较[M(QR)]分 组别 干预前 干预后 PRF组(n=20) 9.00(3.75) 2.00(3.00)**## 对照组(n=20) 9.00(3.00) 3.00(1.75)** IUA: 宫腔粘连; PRF: 富血小板纤维蛋白。
与干预前比较, **P < 0.01; 与对照组比较, ##P < 0.01。表 3 2组干预前后IUA严重程度分级比较[n(%)]IUA程度 干预前 干预后 PRF组
(n=20)对照组
(n=20)PRF组
(n=20)对照组
(n=20)无粘连 0 0 9(45.00)* 2(10.00) 轻度粘连 2(10.00) 2(10.00) 9(45.00)* 13(65.00) 中度粘连 5(25.00) 6(30.00) 2(10.00)* 5(25.00) 重度粘连 13(65.00) 12(60.00) 0 0 IUA: 宫腔粘连; PRF: 富血小板纤维蛋白。
与对照组比较, *P < 0.05。2.4 2组月经及EMT的比较
宫腔镜二次探查术4周后, 2组月经经期、月经经量评分均较干预前改善，且PRF组干预后月经经期改善效果优于对照组，差异均有统计学意义(P < 0.05)。2组干预前后EMT变化差异无统计学意义(P> 0.05)。见表 4。2组患者均无子宫穿孔、发热、过敏、阴道分泌物异常等不良反应。
表 4 2组干预前后月经和EMT变化比较[M(QR)]指标 组别 干预前 干预后 月经经期/d PRF组(n=20) 3.00(2.00) 5.00(2.75)*# 对照组(n=20) 3.00(2.00) 4.00(1.75)* 月经经量评分/分 PRF组(n=20) 25.00(90.50) 170.50(285.00)* 对照组(n=20) 29.50(86.50) 67.00(108.75)* EMT/mm PRF组(n=20) 5.70(3.55) 5.90(3.60) 对照组(n=20) 5.35(2.08) 5.75(1.45) EMT: 子宫内膜厚度; PRF: 富血小板纤维蛋白。
与干预前比较, *P<0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。3. 讨论
IUA治疗中，分离粘连是基础手段，内膜再生是重要环节。TCRA联合辅助措施是IUA治疗的主流方向。目前药物研究集中于雌激素[11]、阿司匹林[12]等，但缺乏统一的应用方案。羊膜和干细胞对于子宫内膜的修复潜能受到临床关注[13-14], 但伦理和安全性问题是其广泛应用的瓶颈[15], 对妊娠率的提高尚无定论。
血小板可释放与细胞增殖迁移有关的生长因子而促进组织修复。第1代血小板浓缩物富血小板血浆(PRP)已经用于子宫内膜修复[16]并取得一定疗效。KIM H等[17]向反复种植失败患者宫腔内注入PRP, 并在PRP治疗后进行胚胎移植，妊娠率明显提高。但PRP需加入外源性牛凝血酶才可激活，生长因子释放时间过短[18], 且液体状态易于流失，以上均限制了PRP的推广应用。
PRF是第2代血小板浓缩物，其与PRP的重要区别是完全自体，不需要外源性物质激活。PRF含有高浓度血小板、白细胞和纤维蛋白[3], 具有促进细胞迁移、组织新生等多种特性，因此在难愈性溃疡[19]、颌骨再生[20]等疾病治疗中应用广泛。GORLERO F等[21]在10例阴道脱垂复发患者的手术治疗中给予PRF, 解剖结构恢复率达80%, 脱垂症状改善率达100%。作者前期动物实验提示，在大鼠子宫内膜损伤宫腔放置PRF可以加速内膜腺体与腔上皮再生修复，减小纤维化面积，大鼠妊娠试验提示PRF组妊娠率明显提高，预实验提示PRF应用于IUA患者的妊娠率可达75%。在此基础上，作者开展前瞻性随机对照试验，将PRF与TCRA联合，这在国内外尚属首次报道。
PRF促进内膜修复的可能机制为: ①促进细胞生长。PRF内含大量血小板[22], 血小板可释放与内膜修复相关的PDGF、VEGF、胰岛素样生长因子等[23-24]而促进修复。PRF中的白细胞也可分泌细胞因子而调节细胞生长。②作为生物支架。PRF肉眼下呈凝胶状，有利于分离创面、预防复粘，且不会过度压迫内膜。固态结构使PRF易被钳夹置入宫腔，同时也可在宫腔镜撤除后受到回缩宫颈肌层的阻隔，避免流失。电镜下PRF以纤维蛋白为骨架，呈立体网状结构[22], 有利于细胞迁移聚集; 网状空隙可以滞留生长因子，使其在7~28 d持续释放[25]。③调节炎症反应。白细胞可释放炎症因子和抗炎因子，如与创面愈合有关的白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α等，实现调节炎症的目的[26]。④抑制瘢痕形成。PRF可通过调控胶原mRNA的表达而减少纤维化，抑制瘢痕增生[27]。
文献[28]报道, 96%的IUA患者创面会在TCRA后8周内愈合，因此术后8周是内膜修复的重要时间窗。由于PRF有效时间最长不超过28 d, 本研究分别在TCRA后即刻、4周后置入PRF, 使PRF在内膜修复期连续发挥作用。研究[17]结果发现PRF对EMT改善效果不明显，但可明显改善月经情况，提示PRF可能通过改善月经发挥内膜修复作用。PRP对EMT也呈现类似的趋势，但PRF组妊娠率和IUA评分的改善程度均优于对照组，干预至妊娠时间更短，提示PRF在改善IUA产妇妊娠率方面更具潜力。
综上所述，本研究初步表明了PRF在宫腔粘连性不孕症中的治疗优势，为该类患者的治疗提供了新的思路。
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