Correlations between expressions of fascin-1 andkeratin 14 proteins and stage T1 gastric cancer complicated with lymph node metastasis
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摘要:目的 探讨消化内镜检查组织成束蛋白1（FSCN1）和角蛋白14（KRT14）表达与T1期胃癌伴淋巴结转移的相关性。方法 选择确诊为T1期胃癌患者120例，其中伴淋巴结转移50例为观察组，未发生淋巴结转移70例为对照组。采用免疫组化染色检测组织FSCN1和KRT14阳性表达率，Western-blot法检测组织FSCN1和KRT14相对表达量。结果 观察组肿瘤组织FSCN1和KRT14阳性表达率和相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。组织FSCN1和KRT14表达与肿瘤的分化级别有显著相关性（P < 0.05）。结论 FSCN1和KRT14表达与早期胃癌的发生和淋巴结转移相关。Abstract:Objective To explore the correlations between expressions of fascin1 (FSCN1), keratin 14 (KRT14) proteins detected by digestive endoscopy and stage T1 gastric cancer complicated with lymph node metastasis.Methods A total of 120 patients diagnosed as stage T1 gastric cancer were enrolled, 50 patients with lymph node metastasis were selected as observation group, and the other 70 patients without lymph node metastasis were selected as control group. The positive expression rates of tissue FSCN1 and KRT14 were detected by immunohistochemical staining, and relative expressions of FSCN1 and KRT14 were detected by Western-blot.Results The positive expression rates and relative expressions of FSCN1 and KRT14 in the observation group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). The expressions of FSCN1 and KRT14 were significantly correlated with differentiation grade of the tumor (P < 0.05).Conclusion Expressions of FSCN1 and KRT14 are correlated with occurrence of early gastric cancer and lymph node metastasis.
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Keywords:
- digestive endoscopy /
- fascin1 /
- keratin 14 /
- gastric cancer /
- lymph node metastasis
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据世界卫生组织(WHO)数据[1]显示，胃癌的发病率居所有恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位，其发病率和死亡率均居消化道恶性肿瘤首位。胃癌的早期临床筛查仍有一定局限性，主要是肿瘤早期无明显的临床症状和体征，患者不易察觉，多因胃部疼痛、进食不佳等就诊，确诊时30%~75%患者明确诊断为肿瘤中晚期，不能进行一期手术根治, 5年总生存率低于65%[1]。随着消化内镜在胃癌和食管癌的早期筛查和治疗中的应用和发展，早期胃癌和食管癌的检出率和根治率明显提高，也显著改善了患者的临床预后[2]。消化内镜是应用最早和最广泛的微创内镜技术，不仅可以用于疾病的早期检查，还可在内镜下实时切除肿瘤组织，具有创伤小、出血少、切除视野可实时放大、并发症少、恢复快等优点[3]。肿瘤的发生与基因突变和特异性蛋白的表达密切相关，细胞骨架对于维持细胞形态和功能具有重要意义。微丝和中间丝是形成细胞骨架的基本蛋白，微丝主要由成束蛋白1(FSCN1)构成，中间丝多由角蛋白14(KRT14)组成[4-5]。研究[6]证实，细胞骨架改变直接参与肿瘤的发生和进展, FSCN1和KRT14蛋白在胃癌和食管癌中表达上调，与临床预后不佳有关。T1期胃癌包括原位癌，有0.5%~3.5%的淋巴结转移率，早期胃癌伴淋巴结转移往往预示更高的恶性程度，决定了不同的手术方式和临床预后[7]。因此，准确评估T1期胃癌伴淋巴结转移对评估疾病切除风险有极为重要的价值。本研究探讨消化内镜检测组织FSCN1、KRT14定性和定量表达与T1期胃癌伴淋巴结转移的相关性，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选择2018年10月—2020年10月在本院确诊T1期的胃癌患者。纳入标准: ①年龄18~75岁者; ②经手术切除病理或腹部增强CT证实胃癌者，TNM分期为T1期; ③完整切除肿瘤病灶和转移淋巴结者; ④患者和家属对研究知情同意，患者信息无丢失。排除标准: ①非T1期胃癌者，其他部位原发恶性肿瘤，如肺癌; ②严重消化性溃疡、严重肝硬化者; ③严重心、肺、肾功能障碍者; ④既往接受放化疗者。共纳入120例患者，其中伴淋巴结转移50例为观察组，未发生淋巴结转移70例为对照组。观察组男、女分别为28、22例，年龄43~75岁，平均(56.8±7.4)岁; 组织分化级别为低分化22例，中高分化28例。对照组男、女分别为36、34例，年龄40~72岁，平均(56.6±7.5)岁; 低分化32例，中高分化38例。2组患者的性别、年龄和组织分化级别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 研究方法
所有患者由同一手术和护理团队进行治疗，完善术前检查，包括心电图、血常规、传染病、肝肾功能、腹部CT和超声等，主要根据CT平扫和增强扫描图像特征确定肿瘤位置、大小、最佳手术切除方案以及评估手术可能存在的风险等。结合术中内镜下实时观察肿瘤分布特征，合理选择微创术式，包括内镜下黏膜切除术(EMR)或内镜黏膜下剥离术(ESD), 术中冰冻证实切缘均为阴性。
主要手术步骤: 术前肠道准备完善后置入内镜，全面评估肿瘤的位置、直径、浸润深度等，进行实时临床分期，并与术前分期进行对照; 确定病变后，根据手术标准流程进行黏膜下注射抬举病灶，染色区分病灶并进行电凝标记，采用多点注射法直至病灶明显隆起。根据病灶大小和浸润特征采用透明帽法、套扎器法或联合应用，从活检孔道伸入一次性圈套器，完全套入圈套器内，接通电源圈套切除。针对不能一次整块切除的较大直径病灶，采用ESD法，即切开病灶周围黏膜，剥离病变，针对剥离困难者分块进行，及时电凝止血，情况严重者及时终止手术。切除病灶后使用电热止血钳对血管进行凝固止血，必要时使用金属夹将创面缝合。病变组织送快速冰冻行病理确诊，证实肿瘤完全切除，切缘阴性后退出内镜。术后常规抗感染、补液、止血等，排气后进食。若术中出现穿孔或需要金属缝合创面的患者，可以适当延迟进食时间。
1.3 免疫组化染色
采用免疫组化染色检测组织FSCN1和KRT14阳性表达，分析FSCN1和KRT14阳性表达与患者性别、年龄和组织分化级别的关系。主要步骤: ①制作切片，厚度5 μm, 并进行前期常规处理，保证成功率; ②染色，依次滴加小鼠抗人FSCN1和KRT14一抗(江苏碧云天科技有限公司提供，稀释比例为1∶2 000, 产品批号为20200216), 于湿盒内4 ℃孵育过夜; 滴加兔抗小鼠二抗(江苏碧云天科技有限公司提供，稀释比例为1∶500, 产品批号为20201546), 于湿盒中27 ℃孵育20 min; ③观察，滴加DAB显色剂于湿盒中27 ℃孵育20 min, 光学显微镜下观察; ④半定量法计算，染色强度(-)、(+)、(
1.4 Western-blot法
Western-blot法检测组织FSCN1和KRT14相对表达量。主要步骤: 加入蛋白裂解液于离心机中, 2 000转/min离心20 min, 取上清，根据BCA蛋白定量试剂盒(美国Sigma公司提供)测定; 配置4%上层胶和10%下层胶，将蛋白样本与上样缓冲液进行高温变性; 依次滴加兔抗人FSCN1、KRT14和内参蛋白GAPDH一抗(美国Sigma公司提供，稀释比例为1∶1 500, 产品批号为20204528)过夜孵育，然后滴加羊抗兔对应二抗(美国Sigma公司提供，稀释比例为1∶500, 产品批号为20203312)常温孵育4 h; ECL显色。扫描条带灰度值计算蛋白相对表达量。采用SPSS 20.0软件进行t或χ2检验; 取双侧α=0.05, 以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 FSCN1和KRT14蛋白阳性表达率
根据免疫组化染色结果计算发现，观察组肿瘤组织FSCN1和KRT14蛋白的阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1、图 1。
表 1 FSCN1和KRT14蛋白阳性表达率[n(%)]组别 n FSCNl KRT14 观察组 50 19(38.0)* 13(26.0)* 对照组 70 5(7.1) 4(5.7) FSCN1: 成束蛋白1; KRT14: 角蛋白14。
与对照组比较, *P < 0.05。2.2 FSCN1和KRT14蛋白表达量
根据Western blot法定量检测结果发现，观察组肿瘤组织FSCN1和KRT14蛋白的相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2、图 2。
表 2 FSCN1和KRT14蛋白表达量(x±s)组别 n FSCNl KRT14 观察组 50 0.58±0.13* 0.55±0.14* 对照组 70 0.29±0.08 0.26±0.07 与对照组比较, *P < 0.05。 2.3 FSCN1和KRT14蛋白与临床特征的关系
FSCN1和KRT14表达与性别和年龄无关，但与肿瘤的分化级别显著相关(P < 0.05)。见表 3。
表 3 FSCN1和KRT14蛋白与临床特征的关系[n(%)]临床特征 n FSCN1(n=24) KRT14(n=17) 性别 男 64 12(18.8) 9(14.1) 女 56 12(21.4) 8(14.3) 年龄 < 56岁 49 6(12.2) 8(16.3) ≥56岁 71 18(25.4) 9(12.7) 分化程度 低分化 54 16(29.6) 12(22.2) 中高分化 66 8(12.1)* 5(7.6)* 与低分化比较, *P < 0.05。 3. 讨论
EMR、ESD和黏膜下隧道切除术(STD)是目前临床治疗早期胃癌和食管癌的常用微创术式，利用镜像放大手术野、提高操作精细度，可避免开胸手术引起的腹壁损伤，提高手术安全性[8-9]。EMR借助内镜放大和染色技术，可同时完成胃癌病灶活检，实现早期诊断和治疗，具有创伤小、并发症少、恢复快、病变完全切除率高等优点。针对肿瘤直径>20 mm而不易一次性整块切除的病灶，可联合ESD实现分块切除[10]。
消化内镜下可同时完成肿瘤的早期筛查和治疗，明显提高了早期胃癌的检出率。T1期胃癌仍有一定的淋巴结转移率，预示肿瘤的恶性程度较高，可能需要扩大手术切除范围[11]。目前临床上关于早期胃癌的标准术式以及临床预后尚无统一意见。有研究[12]提示，胃癌根治术结合化疗是标准方案，即使早期胃癌无淋巴结转移，仍主张采用腹腔镜减轻手术创伤，促进术后快速康复。也有研究[13]认为，有无淋巴结转移对临床预后影响不大。因此，早期通过消化内镜准确预测T1期胃癌伴淋巴结转移对确定恰当的手术切除范围和评估预后风险具有重要意义。
本研究结果显示，观察组肿瘤组织FSCN1和KRT14阳性表达率和表达量均高于对照组, FSCN1和KRT14表达仅与肿瘤的分化级别有关，差异有统计学意义(P < 0.05), 提示组织FSCN1和KRT14表达上调可能参与了胃癌的早期发生和淋巴结转移，分化级别越低提示肿瘤恶性程度越高，组织FSCN1和KRT14的表达水平越高。研究[14-15]证实, FSCN1过表达可导致细胞膜突起及细胞运动，与肿瘤发生相关，在结肠癌、肝癌、肺癌等恶性肿瘤中均发现FSCN1高表达，推测与晚期肿瘤的病灶转移相关，是预后不良的重要标志。对食管鳞癌组织中FSCN1的表达研究[16]发现，免疫组化染色阳性显著强于正常食管上皮组织，随着染色强度、阳性细胞比率增高，食管癌预后不佳。细胞角蛋白属于中间丝蛋白家族，多表达于上皮细胞中，包括KRT1~20, 是上皮性肿瘤的标志物[17-18]。KRT14在任何来源的鳞癌中均有表达，是鳞癌诊断的重要标志物[19]。
综上所述, FSCN1和KRT14可能参与了早期胃癌的发生和淋巴结转移，消化内镜可同时进行疾病早期诊断和根治性切除，评估淋巴结转移风险。本研究针对T1期胃癌患者采用微创内镜下治疗，并检测肿瘤组织FSCN1和KRT14蛋白定性和定量表达，对预测早期淋巴结转移有较好的价值。本研究无法直接说明组织FSCN1和KRT14蛋白表达异常与生存预后的关系，也无法得出组织FSCN1和KRT14蛋白表达水平诊断早期胃癌和评估预后的准确性，仍需要进一步的研究论证。
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表 1 FSCN1和KRT14蛋白阳性表达率[n(%)]
组别 n FSCNl KRT14 观察组 50 19(38.0)* 13(26.0)* 对照组 70 5(7.1) 4(5.7) FSCN1: 成束蛋白1; KRT14: 角蛋白14。
与对照组比较, *P < 0.05。
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表 2 FSCN1和KRT14蛋白表达量(x±s)
组别 n FSCNl KRT14 观察组 50 0.58±0.13* 0.55±0.14* 对照组 70 0.29±0.08 0.26±0.07 与对照组比较, *P < 0.05。
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表 3 FSCN1和KRT14蛋白与临床特征的关系[n(%)]
临床特征 n FSCN1(n=24) KRT14(n=17) 性别 男 64 12(18.8) 9(14.1) 女 56 12(21.4) 8(14.3) 年龄 < 56岁 49 6(12.2) 8(16.3) ≥56岁 71 18(25.4) 9(12.7) 分化程度 低分化 54 16(29.6) 12(22.2) 中高分化 66 8(12.1)* 5(7.6)* 与低分化比较, *P < 0.05。
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1. 郑炜智，刘炳辉，杨继洲，盛玲玲，付承林. circ＿ACAP2对胃癌细胞BGC–823增殖凋亡的影响及作用机制. 中国现代医生. 2022(27): 15-20 . 
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