Effects of sevoflurane on renal function and endothelial nitric oxide synthase of rats with renal ischemia reperfusion injury
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摘要:目的 探讨七氟醚（Sev）对肾脏缺血再灌注损伤（IRI）大鼠肾功能、肾小管坏死率及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的影响。方法 将45只健康大鼠随机分为MB组（假手术组）、YB组（IRI模型组）、ZL组（Sev+IRI），每组15只。比较3组大鼠血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cr）水平，肾脏组织形态学表现，肾小管坏死率评分，eNOS、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性表达以及肾小管上皮细胞凋亡率。结果 与MB组大鼠相比，YB组、ZL组大鼠4、12、24 h的BUN、Cr水平均升高，且YB组大鼠12、24 h的BUN、Cr水平均高于ZL组，差异有统计学意义（P < 0.05）。MB组大鼠肾脏组织细胞排列整齐、细胞间距均匀；YB组大鼠肾小管有扩张表现，组织排列混乱，细胞扁平且多坏死，病变处为片状，间质充血明显，出现中粒细胞侵润；ZL组上述病灶范围、充血等病理均有一定改善。YB组、ZL组大鼠4、12、24 h肾小管Paller评分均高于MB组，且YB组大鼠4、12、24 h肾小管Paller评分均高于ZL组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与MB组相比，YB组大鼠肾组织eNOS强阳性表达降低，iNOS强阳性表达增强，差异有统计学意义（P < 0.05）；与YB组相比，ZL组大鼠肾组织eNOS强阳性表达增强，iNOS强阳性表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。YB组、ZL组大鼠肾组织中肾小管上皮细胞凋亡率高于MB组，且YB组大鼠肾组织中肾小管上皮细胞凋亡率高于ZL组，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论 Sev干预可改善肾脏IRI大鼠的肾功能，降低肾小管坏死率，对肾脏起保护作用，其机制可能与上调eNOS表达有关。Abstract:Objective To investigate the effects of sevoflurane (Sev) on renal renal function, renal tubular necrosis rate and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) of rats with renal ischemia reperfusion injury (IRI).Methods Forty-five healthy rats were randomly divided into MB group (sham operation group), YB group (IRI model group) and ZL group (SEV plus IRI), with 15 rats in each group. The levels of blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (Cr), expression of renal histomology, score of renal tubular necrosis rate, positive expressions of eNOS and inductive nitric oxide synthase (iNOS) and apoptosis rate of renal tubular epithelial cells were compared among the three groups.Results Compared with the MB group, the levels of BUN and Cr at 4, 12 and 24 h in the YB group and the ZL group increased significantly, and the levels of BUN and Cr at 12 and 24 h in the YB group were significantly higher than those in the ZL group (P < 0.05). In the MB group, the renal tissue cells were arranged neatly and the spacing of cells was uniform. In the YB group, the renal tubules showed dilatation, disorganized tissues, flat cells with multiple necrosis, flaky lesions, obvious interstitial hyperemia and granulocyte invasion. In the ZL group, the lesion range and hyperemia were improved. The Paller scores of renal tubules at 4, 12 and 24 h in the YB and ZL groups were significantly higher than that in the MB group, and the Paller scores of renal tubules at 4, 12 and 24 h in the YB group were significantly higher than that in the ZL group (P < 0.05). Compared with the MB group, the positive expression of eNOS was decreased while the positive expression of iNOS was increased in the YB group, and there were significant differences (P < 0.05). Compared with the YB group, the positive expression of eNOS was increased while the positive expression of iNOS was decreased in the ZL group, and there were significant differences (P < 0.05). The apoptosis rates of renal tubular epithelial cells in the YB group and the ZL group were significantly higher than that in the MB group, and the apoptosis rate of renal tubular epithelial cells in the YB group was significantly higher than that in the ZL group (P < 0.05).Conclusion Sev intervention can improve the renal function of renal IRI rats, reduce the necrosis rate of renal tubule, protect renal function, and the mechanism may be related to the up-regulation of eNOS expression.
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肾脏缺血再灌注损伤(IRI)是临床上较为常见的缺血性损伤病变，肾脏是血供较为丰富的器官，其在发生缺血或缺血再灌注时引发IRI的概率更高[1]。七氟醚(Sev)是临床儿科全身麻醉中常用的新型吸入麻醉药，其在诱导期及维持期的麻醉效果良好[2]。研究[3]证实Sev在心、肝等机体重要器官的缺血性损伤中发挥了较好的保护作用，但在肾脏IRI中的作用机制尚不明确。研究[4]表明一氧化氮(NO)在IRI中发挥重要作用，而内皮型一氧化氮合酶(eNOS)则是NO在肾组织中表达最高的分型。本研究采用Sev对IRI模型大鼠进行干预，观察其肾功能及肾组织病理变化，检测大鼠肾脏组织中eNOS、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达水平，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 实验分组
选取45只健康的无特定病原体(SPF)级雄性大鼠[购自上海杰思捷有限公司，许可证号: SYXK(沪)2018-0004], 体质量为(221±18) g, 饲养环境保持清洁，室温22~26 ℃, 相对湿度55%~65%。采用数字随机表法将大鼠分为MB组(假手术组)、YB组(IRI模型组)、ZL组(Sev+IRI), 每组15只。本研究内容经本院动物伦理委员会审核批准。
1.2 仪器、试剂
Sev挥发罐(湖北新鸣泰有限公司); Sev(雅培, US); 免疫组化试剂盒(上海雅吉有限公司); 乌拉坦(武汉卡布达有限公司), iNOS/eNOS兔抗人多克隆抗体(杭州华安有限公司), TUNEL试剂盒(瑞士, Roche)。
1.3 动物模型制备
大鼠术前禁食8 h、禁饮4 h, 采用2%戊巴比妥钠盐麻醉后给予呼吸器(60次/min), 潮气量为13~15 mL。MB组经腹部开口找到左、右肾脏，肾蒂游离后缝合; YB组、ZL组采用MB组方法找到双肾后，避开输尿管夹闭肾动、静脉，肾脏变暗红色代表缺血完成, 45 min后放开恢复血流供应，肾脏恢复鲜红色代表血流恢复; ZL组建立IRI模型后，在有机玻璃麻醉箱内，通过气体挥发管输入O2和Sev, 测定Sev浓度维持在2.2%, 持续3 h后恢复大鼠自由饮食。
1.4 血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)测定
大鼠建模成功后4、12、24 h时，多次采集眼眶全血3 mL, 放置20 min(25 ℃), 2 000转/min离心10 min, 收集血清于-70 ℃冻存。采用生化分析仪测定BUN、Scr水平。
1.5 大鼠肾脏组织形态学观察
给予大鼠100 g/L乌拉坦注射麻醉处死后，取肾组织甲醛溶液固定、石蜡包埋后切片4 μm, 然后将切片进行HE染色，显微镜下观察其病理形态。
1.6 Paller法评估肾小管坏死率评分
根据Paller法对肾小管损害进行评分(由病理专业人员采用单盲法进行): 光镜随机选取5个视野，每个视野选择10个肾小管计分，其中细胞脱落坏死为1分; 管型、碎片型为2分; 上皮细胞颗粒变性为1分; 空泡变性为1分; 细胞核固缩为1分; 肾小管扩张、细胞扁平为1分。
1.7 免疫组化检测eNOS、iNOS水平
将各组大鼠肾组织样本脱蜡水化, H2O2失活，低火加热1 min修复抗原并加血清封闭，加eNOS、iNOS一抗(稀释比例1∶250), PBS冲洗，再加入二抗(山羊抗鼠IgG抗体，稀释比例1∶500), 最后加入DAB显色剂染色。染色时，以PBS代替一抗。显微镜观察结果, eNOS为每例标本观察5~10个小血管的内皮细胞表达, iNOS为每例标本观察10~20个肾小球的毛细血管的内皮细胞，标本制备、指标测定由不同人员操作。判断标准为无染色，记录为阴性(-); 染色为黄色、棕黄色，记录为阳性(+); 染色为棕褐色，记录为强阳性(╫)。
1.8 TUNEL染色法检测细胞凋亡
肾组织进行浸蜡、包埋、石蜡切片, 2 μm厚度切片5张，而后进行TUNEL染色，凋亡细胞的胞核染色为棕黄色，采用光学显微镜在单张切片的5个不重复点进行观察。凋亡率=凋亡细胞/总细胞×100%。
1.9 统计学分析
采用SPSS 23.0软件对本研究数据进行分析，肾功能、肾小管坏死率及eNOS水平等数据采用(x±s)表示, 3组比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 MB组、YB组及ZL组大鼠肾功能指标变化
与MB组大鼠相比, YB组、ZL组大鼠4、12、24 h的BUN、Cr水平均升高，且YB组大鼠12、24 h的BUN、Cr水平均高于ZL组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 MB组、YB组及ZL组大鼠肾功能指标比较(x±s)组别 n BUN/(mmol/L) Cr/(μmol/L) 4 h 12 h 24 h 4 h 12 h 24 h MB组 15 6.75±0.65 6.59±0.67 7.32±0.76 73.46±7.18 75.59±7.52 73.93±6.92 YB组 15 14.89±1.36* 34.64±3.32* 45.42±4.06* 105.58±10.52* 191.36±18.69* 209.16±20.29* ZL组 15 14.23±1.45* 15.65±1.58*# 12.90±1.15*# 101.85±10.07* 99.29±9.49*# 98.28±9.65*# BUN: 血尿素氮; Cr: 肌酐。与MB组比较, *P < 0.05; 与YB组比较, #P < 0.05。 2.2 MB组、YB组及ZL组大鼠肾脏组织形态学比较
MB组大鼠肾脏组织细胞排列整齐、细胞间距均匀。YB组大鼠肾小管有扩张表现，组织排列混乱，细胞扁平且多坏死，病变处为片状，间质充血明显，出现中粒细胞侵润。ZL组上述病灶范围、充血等病理均有一定改善。见图 1。
2.3 Paller氏评分评估MB组、YB组及ZL组大鼠肾小管坏死率
YB组、ZL组大鼠4、12、24 h肾小管Paller评分均高于MB组，且YB组大鼠4、12、24 h肾小管Paller评分均高于ZL组，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
表 2 MB组、YB组及ZL组大鼠肾小管坏死率评分比较(x±s)分 组别 n Paller评分 4 h 12 h 24 h MB组 15 2.42±0.45 2.35±0.23 2.56±0.25 YB组 15 29.53±2.62* 31.26±2.89* 33.96±3.26* ZL组 15 18.26±1.25*# 13.85±1.37*# 12.95±1.23*# 与MB组比较, *P < 0.05; 与YB组比较, #P < 0.05。 2.4 MB组、YB组及ZL组大鼠肾脏组织eNOS、iNOS比较
与MB组相比, YB组大鼠肾组织eNOS强阳性表达降低, iNOS强阳性表达增强，差异有统计学意义(P < 0.05); 与YB组相比, ZL组大鼠肾组织eNOS强阳性表达增强, iNOS强阳性表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3、图 2。
表 3 MB组、YB组及ZL组大鼠肾组织eNOS、iNOS水平比较组别 n eNOS iNOS 阴性 阳性 强阳性 阴性 阳性 强阳性 MB组 15 1 6 8 10 3 2 YB组 15 6* 7 2* 3 4 8* ZL组 15 2*# 4# 6# 7*# 5 3# eNOS: 内皮型一氧化氮合酶; iNOS: 诱导型一氧化氮合酶。
与MB组比较, *P < 0.05; 与YB组比较, #P < 0.05。2.5 MB组、YB组及ZL组大鼠细胞凋亡率比较
YB组、ZL组大鼠肾组织中肾小管上皮细胞凋亡率高于MB组，且YB组大鼠肾组织中肾小管上皮细胞凋亡率高于ZL组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 3。
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图 3 3组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况A: MB组凋亡表现(放大倍数400倍); B: YB组凋亡表现(放大倍数400倍); C: ZL组凋亡表现(放大倍数400倍); D: 3组肾小管上皮细胞凋亡率(与MB组相比, *P < 0.05; 与YB组相比, #P < 0.05)。3. 讨论
研究[5]发现肾小管上皮细胞损伤及功能丧失在肾脏IRI进程中发挥重要作用。该症一般发生在肾移植、切除术、肾部分血管形成术、需要暂时阻断肾脏血流的创伤性外科手术过程中，当血流灌注恢复后，肾组织出现功能障碍、结构损伤，从而引起肾小管坏死、肾小球堆积堵塞致使肾脏形态发生不同程度的改变，这也是造成部分患者急性肾衰竭及恢复延迟的主要原因[6]。Sev是临床常用的刺激性较小的麻醉药物，其能够降低心、肺等器官术后发生IRI的概率，有研究[7]显示Sev在减轻肾脏IRI中有良好的效果，但其作用机制尚无定论。
BUN、Cr是现阶段临床中普遍应用的肾功能诊断指标，能有效反映肾功能的损伤程度。研究[8]发现经Sev干预后缺血再灌注大鼠肾功能显著改善，表明Sev在缓解大鼠肾脏缺血再灌注损伤中效果确切，其作用机制与调节Nrf2信号通路相关。本研究结果显示, Sev干预12、24 h时，ZL组大鼠BUN、Cr水平低于YB组，提示Sev对缺血再灌注后肾损伤具有缓解作用。杨柳等[9]建立肾脏IRI小鼠模型并给予Sev干预，结果发现小鼠BUN、Cr及细胞凋亡数量较IRI小鼠明显降低，证实Sev能够减轻肾脏IRI大鼠的肾功能损伤，对肾脏起到保护作用。周文涛等[10]在其研究中同样证实了Sev干预可以缓解肾脏IRI大鼠肾功能损伤。李苗等[11]通过敲除小鼠HIF-2α基因后，建立肾缺血再灌注损伤模型，给予Sev干预后结果显示, Sev预处理可降低肾脏IRI大鼠BUN、Cr表达水平，激活HIF-2α蛋白，提示Sev对肾脏IRI具有保护作用，其作用机制可能与调控HIF-2α信号通路有关。本研究结果表明，给予Sev干预后，ZL组肾组织病理状态得到一定改善，且ZL组大鼠肾小管Paller评分较YB组显著降低，说明Sev能够减轻大鼠肾脏IRI，具有保护机制。研究[12]表明肾脏缺血再灌注的过程中，细胞凋亡与肾功能降低关系密切。本研究结果提示，在肾缺血再灌注过程中，肾小管上皮细胞凋亡加剧，而Sev干预后的肾小管上皮细胞凋亡数量则明显减少。
NO合成与NOS关系密切, eNOS分布较为广泛，在肾小球、血管中均有表达，既往研究[13]证实NO作为血管内皮舒张因子在免疫功能调节、肾脏血流稳定和肾小球滤过功能以及内皮损伤缓解方面发挥重要作用。研究[14]显示, eNOS参与肾脏IRI的发生发展，当其表达升高时，可缓解肾脏IRI, 对肾脏起保护作用; 肾脏损伤时, iNOS在炎性细胞介导下表达升高，可引发细胞毒性反应，间接促进了肾损伤的发展。有学者[15]建立肾脏IRI大鼠模型，发现大鼠肾组织的iNOS表达明显升高，给予不同浓度的Sev干预后，肾脏IRI大鼠iNOS的表达降低，从而减轻了肾脏缺血再灌注损伤。本研究结果显示，与YB组相比, ZL组大鼠肾组织eNOS强阳性表达升高, iNOS的强阳性表达降低，提示Sev能够提高肾脏eNOS水平，抑制iNOS表达，进而在肾脏缺血再灌注中发挥保护作用。聂阳等[16]给予心肌缺血再灌注损伤大鼠甘木通总黄酮干预，结果显示，药物干预组大鼠机体内eNOS表达升高，且大鼠病症有效缓解，因此推测Sev对肾脏IRI大鼠的保护作用可能与激活eNOS活性表达相关。
综上所述, Sev干预可改善肾脏IRI大鼠的肾功能，降低肾小管坏死率，对肾脏起保护作用，其机制可能与上调eNOS表达有关。本研究因成本、样本量受限制、未加入阳性药物对照组等问题，存在一定的局限性，后续应采用更多的实验方法为肾脏缺血再灌注损伤的治疗提供可靠依据。
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图 3 3组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况
A: MB组凋亡表现(放大倍数400倍); B: YB组凋亡表现(放大倍数400倍); C: ZL组凋亡表现(放大倍数400倍); D: 3组肾小管上皮细胞凋亡率(与MB组相比, *P < 0.05; 与YB组相比, #P < 0.05)。
表 1 MB组、YB组及ZL组大鼠肾功能指标比较(x±s)
组别 n BUN/(mmol/L) Cr/(μmol/L) 4 h 12 h 24 h 4 h 12 h 24 h MB组 15 6.75±0.65 6.59±0.67 7.32±0.76 73.46±7.18 75.59±7.52 73.93±6.92 YB组 15 14.89±1.36* 34.64±3.32* 45.42±4.06* 105.58±10.52* 191.36±18.69* 209.16±20.29* ZL组 15 14.23±1.45* 15.65±1.58*# 12.90±1.15*# 101.85±10.07* 99.29±9.49*# 98.28±9.65*# BUN: 血尿素氮; Cr: 肌酐。与MB组比较, *P < 0.05; 与YB组比较, #P < 0.05。 
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表 2 MB组、YB组及ZL组大鼠肾小管坏死率评分比较(x±s)
分 组别 n Paller评分 4 h 12 h 24 h MB组 15 2.42±0.45 2.35±0.23 2.56±0.25 YB组 15 29.53±2.62* 31.26±2.89* 33.96±3.26* ZL组 15 18.26±1.25*# 13.85±1.37*# 12.95±1.23*# 与MB组比较, *P < 0.05; 与YB组比较, #P < 0.05。
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表 3 MB组、YB组及ZL组大鼠肾组织eNOS、iNOS水平比较
组别 n eNOS iNOS 阴性 阳性 强阳性 阴性 阳性 强阳性 MB组 15 1 6 8 10 3 2 YB组 15 6* 7 2* 3 4 8* ZL组 15 2*# 4# 6# 7*# 5 3# eNOS: 内皮型一氧化氮合酶; iNOS: 诱导型一氧化氮合酶。
与MB组比较, *P < 0.05; 与YB组比较, #P < 0.05。
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