肠系膜淋巴结炎是儿科常见疾病，常继发于急性上呼吸道感染或肠道炎症，其典型症状包括发热、恶心、呕吐、转移性右下腹痛以及白细胞计数升高等^[1]。目前，肠系膜淋巴结炎的常用治疗方法包括广谱抗生素疗法、支持疗法及对症治疗，病情严重时则需通过手术清除淋巴结脓肿和腹腔内脓液。然而，这些治疗方法往往副作用较大或疗效欠佳，因此，探索其他辅助治疗手段具有重要意义^[2]。针灸作为传统中医疗法之一，通过疏通经脉、调理气血、调和脏腑功能达到防治疾病的目的，具有绿色、安全、副作用小等优势，可作为多种疾病的辅助治疗手段^[3]。研究^[4]发现，针刺足三里能够激活脾气虚证大鼠的肠系膜淋巴结免疫应答，从而增强其肠道免疫功能，并改善脾虚症状。肠系膜淋巴结炎主要由病原微生物感染引发，因此炎症是其重要病理特征之一^[5]。自噬指细胞内的溶酶体降解自身细胞器和其他大分子的过程，研究^[6]发现激活自噬能够减轻机体的炎症反应。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子-κB(NF-κB)信号通路与免疫应答及炎症反应密切相关，抑制该通路可减轻炎症反应^[7]。本研究通过构建肠系膜淋巴结炎小鼠模型，探讨针刺足三里是否通过调控p38 MAPK/NF-κB信号通路减轻小鼠的炎症反应，现报告如下。

1.   材料与方法

1.1   药物及试剂

戊巴比妥钠(上海瀚香生物科技有限公司)，苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司), Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、GAPDH一抗(天津伊特生命科学研发有限公司), p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2   实验动物

42只雄性昆明种小鼠, 4周龄，体质量18~22 g, 饲养于温度(23±2) ℃、相对湿度60%~70%的环境中。小鼠自由摄食饮水，适应性喂养7 d后进行实验。

1.3   实验分组及治疗方法

随机选取12只小鼠作为空白对照组，其余30只小鼠进行肠系膜淋巴结炎造模。造模结束后，随机选取6只小鼠进行HE染色实验，以评估造模是否成功。将造模成功的小鼠随机分为模型组和针刺足三里组，每组12只。造模方法(处理分为单日和双日)^[8]: 单日时，上午将小鼠置于冷水中游泳至力竭(水温20 ℃, 室温25 ℃, 力竭判断标准为小鼠四肢滑动无力、身体竖立且头部完全浸入水中超过3 s), 下午喂食生甘蓝; 双日时，给予小鼠猪油脂(0.03 mL/g)灌胃，且灌胃后继续提供正常饲料。上述处理连续进行16 d。

针刺足三里组小鼠接受电针足三里治疗，空白对照组及模型组则不进行处理。针刺足三里方法^[9]: 使用电针刺激足三里，参数为疏密波2 Hz/15 Hz交替，电流强度1 mA, 30 min/次, 1次/d, 持续4 d。

1.4   行为学观察

治疗期间，观察小鼠的食量变化; 治疗结束后，观察小鼠的精神状态、大便颜色及质地、腹痛弓背情况。

1.5   标本采集

治疗结束后，小鼠禁食(不禁水)12 h, 随后腹腔注射戊巴比妥钠(5 μL/g)进行麻醉。采用摘眼球法采集静脉血，离心处理(4 ℃, 3 000 r/min, 5 min), 收集上层血清并储存于-20 ℃冰箱中，用于后续ELISA检测。取血后，立即获取小鼠肠系膜淋巴结组织，部分组织用4%(体积分数)多聚甲醛固定，用于HE染色; 其余组织冻存于-80 ℃冰箱中，用于蛋白质印迹法(Western blot)实验。

1.6   HE染色实验

取4%多聚甲醛固定的肠系膜淋巴结组织，脱水，石蜡包埋，切取4 μm厚的切片。切片经脱蜡、复水、HE染色、脱水和透明处理后，使用中性树脂封片，在倒置显微镜下观察小鼠肠系膜淋巴结组织的病理损伤情况。

1.7   ELISA检测

使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的表达水平，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.8   Western blot实验

将肠系膜淋巴结组织加入RIPA裂解液，于4 ℃条件下放置20 min，随后进行离心处理(4 ℃, 15 000 g, 20 min), 收集上清液。加样、电泳、转膜、封闭2 h后，加入Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH一抗孵育过夜，再与二抗孵育1 h。使用化学发光试剂显影，并通过ImageJ软件进行半定量分析。

1.9   统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA), 组间两两比较采用LSD检验, P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   各组小鼠行为学观察结果比较

相较于空白对照组，模型组小鼠食量减少，精神萎靡，大便软溏，偶尔出现弓背现象; 相较于模型组，针刺足三里组小鼠食量增加，精神状态有所恢复，大便成形，弓背次数减少。

2.2   各组小鼠肠系膜淋巴结组织病理学改变比较

HE染色结果显示，空白对照组小鼠肠系膜淋巴结组织结构完整，网架结构清晰，淋巴小结与周围组织界限清楚，未见萎缩现象; 模型组小鼠肠系膜淋巴结组织结构散乱，网架结构破坏，淋巴小结等结构不完整，淋巴结窦隙狭窄且不清晰; 与模型组相比，针刺足三里组小鼠肠系膜淋巴结组织的病理学改变有所改善，见图 1。

图  1  各组小鼠肠系膜淋巴结组织HE染色图(放大200倍)

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2.3   各组小鼠血清促炎因子水平比较

ELISA检测结果显示，模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于空白对照组，针刺足三里组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于模型组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。

表  1  各组小鼠血清促炎因子水平比较(x±s)  pg/mL

组别	n	肿瘤坏死因子-α	白细胞介素-1β	白细胞介素-6
空白对照组	12	95.76±12.17	57.42±6.94	48.50±4.67
模型组	12	217.32±18.67*	139.63±11.34*	124.85±11.34*
针刺足三里组	12	143.76±17.34#	107.09±7.17#	86.74±13.74#
F		169.249	269.486	153.258
P		< 0.001	< 0.001	< 0.001
与空白对照组比较, * P < 0.05; 与模型组比较, #P < 0.05。

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2.4   各组小鼠肠系膜淋巴结组织自噬相关蛋白表达比较

Western blot检测结果显示，模型组小鼠肠系膜淋巴结组织中Beclin1蛋白相对表达量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低于空白对照组, p62蛋白相对表达量高于空白对照组，差异有统计学意义(P < 0.05); 针刺足三里组小鼠肠系膜淋巴结组织中Beclin1蛋白相对表达量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于模型组, p62蛋白相对表达量低于模型组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 2、表 2。

图  2  各组小鼠肠系膜淋巴结组织中自噬相关蛋白表达的Western blot检测结果

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表  2  各组小鼠肠系膜淋巴结组织中自噬相关蛋白表达比较(x±s)

组别	n	Beclin1	LC3Ⅱ/LC3Ⅰ	p62
空白对照组	12	0.95±0.05	0.91±0.03	0.26±0.02
模型组	12	0.43±0.07*	0.64±0.06*	0.92±0.07*
针刺足三里组	12	0.88±0.06#	0.79±0.03#	0.43±0.04#
F		217.182	101.667	510.580
P		< 0.001	< 0.001	< 0.001
与空白对照组比较, * P < 0.05; 与模型组比较, #P < 0.05。

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2.5   各组小鼠肠系膜淋巴结组织p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达比较

Western blot检测结果显示，模型组小鼠肠系膜淋巴结组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65高于空白对照组，针刺足三里组小鼠肠系膜淋巴结组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65低于模型组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 3、表 3。

图  3  各组小鼠肠系膜淋巴结组织中p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的Western blot检测结果

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表  3  各组小鼠肠系膜淋巴结组织中p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达比较(x±s)

组别	n	p-p38 MAPK/p38 MAPK	p-NF-κB p65/NF-κB p65
空白对照组	12	0.33±0.04	0.49±0.04
模型组	12	1.04±0.08*	1.12±0.09*
针刺足三里组	12	0.43±0.05#	0.63±0.03#
F		422.000	309.717
P		< 0.001	< 0.001
MAPK: 丝裂原活化蛋白激酶; NF-κB: 核因子-κB。 与空白对照组比较, *P < 0.05; 与模型组比较, #P < 0.05。

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3.   讨论

肠系膜淋巴结炎常继发于上呼吸道感染，临床症状包括腹痛、发热、恶心、呕吐、腹泻或便秘等^[10-12]。该病多发于7岁以下儿童，好发于冬春季节，且与饮食习惯密切相关^[13]。研究^[14]表明，中医刺灸法治疗小儿肠系膜淋巴结炎具有疗效确切、复发率低、副作用小、家长易于接受等优点。费小琴等^[15]通过临床随机对照研究发现，回旋灸法联合中药治疗儿童气滞血瘀型肠系膜淋巴结炎具有良好疗效。王恩杰等^[16]发现，酒灸联合西药治疗中寒型小儿肠系膜淋巴结炎的总有效率高达97.8%, 能显著缩短腹痛持续时间，且复发率较低。颜晓等^[17]研究发现，针刺尺腹及公孙穴配合隔药灸脐法治疗26例小儿肠系膜淋巴结炎的总有效率高达100%，其中15例患儿痊愈。足三里为足阳明胃经的合穴，具有健脾和胃、止泻止痛、通调肠道的功效，刺激此穴能增强肠系膜淋巴结的免疫应答功能^{[4, 18]}。本研究构建了肠系膜淋巴结炎小鼠模型，行为学观察结果显示，模型小鼠食量减少、精神萎靡、大便软溏，偶尔弓背(主要由腹部疼痛引起)，针刺足三里后小鼠的这些病理性行为学特征显著改善。此外，HE染色实验结果显示，针刺足三里同样显著改善了肠系膜淋巴结炎小鼠肠系膜淋巴结组织结构散乱、网架结构破坏、淋巴小结等结构不完整、淋巴结窦隙狭窄且不清晰等病理学特征，表明针刺足三里对肠系膜淋巴结炎具有良好疗效。

炎症是肠系膜淋巴结炎的重要病理特征之一。ZHENG Y等^[19]通过网络药理学研究发现，人参、葛根治疗肠系膜淋巴结炎的机制与炎症、氧化应激相关，涉及NF-κB、TNF-α等信号通路。TNF-α、IL-1β、IL-6是常见的促炎因子，其表达上调可促进炎症反应的发生^[20]。LAO J等^[21]研究发现，抑制结肠炎小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，能显著缓解炎症反应。本研究结果显示，肠系膜淋巴结炎小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达显著上调，而针刺足三里后这些促炎因子的表达显著下调，表明针刺足三里能有效缓解肠系膜淋巴结炎小鼠的炎症反应。自噬是一种基于溶酶体的降解过程，用于回收衰老的细胞成分并清除受损的细胞器和易聚集的蛋白质^[22]。研究^[6]显示，自噬可对免疫系统产生多种影响，并具有调节炎症的潜在能力，能调控促炎因子的表达并抑制过度的炎症反应。JI Z等^[23]发现，抑制自噬会促进骨髓来源的巨噬细胞的炎症反应。邓双娇等^[24]研究发现，激活自噬可有效减轻结肠炎小鼠的炎症反应和病理性损伤。Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62与细胞自噬密切相关。Beclin1在自噬过程中与自噬前体结合，启动自噬体的形成; LC3是自噬的标志物，在自噬过程中发挥重要作用，自噬形成时，胞浆型LC3(LC3Ⅰ)会转变为膜型LC3(LC3Ⅱ), LC3Ⅱ/LC3Ⅰ越高，提示自噬水平越高; p62作为将被自噬作用降解的小泡的受体和将被清除的泛素化蛋白聚集物的受体，其水平升高通常被认为是自噬活性受到抑制的标志^[25]。本研究结果显示，肠系膜淋巴结炎小鼠的肠系膜淋巴结组织中Beclin1蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著下调, p62蛋白表达显著上调，而针刺足三里后，小鼠肠系膜淋巴结组织中Beclin1蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著上调, p62蛋白表达显著下调。由此表明，针刺足三里能够显著提升肠系膜淋巴结炎小鼠的自噬水平，进而减轻其炎症反应。

MAPK是一组能被多种细胞外刺激(如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等)激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，主要包括4个特征性亚家族(ERK1/2、JNK、p38和ERK5)。研究^[26]表明，在信号通路水平阻断p38 MAPK的表达，能够抑制过度炎症反应性疾病的进展。NF-κB是一种核转录因子，在促进炎症方面发挥关键作用^[27]。p38 MAPK被细胞外炎症因子、细菌脂多糖(LPS)等因素激活后，会转化为其磷酸化形式p-p38 MAPK, p-p38 MAPK可调节Th1/Th12细胞因子的分泌，并激活其下游信号NF-κB。磷酸化的NF-κB p65(p-NF-κB p65)是NF-κB p65的激活形式，其转运至细胞核中启动促炎因子的转录，介导炎症反应的发生^[28]。因此, p38 MAPK/NF-κB在炎症性疾病的进展中扮演重要角色。WEN X等^[29]研究发现，麦麸多酚通过抑制MAPK/NF-κB信号通路减轻葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎。HUANG C等^[30]研究发现，乌头生物碱通过抑制MAPK/NF-κB信号通路缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎。此外, SUN J等^[31]研究发现，日本参通过阻断MAPK/NF-κB信号通路促进M2巨噬细胞极化，进而预防溃疡性结肠炎。本研究发现，肠系膜淋巴结炎小鼠的肠系膜淋巴结组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65显著升高，针刺足三里后，小鼠肠系膜淋巴结组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65显著降低，表明针刺足三里能够抑制肠系膜淋巴结炎小鼠p38 MAPK/NF-κB信号通路的激活。

综上所述，针刺足三里通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路减轻肠系膜淋巴结炎小鼠的炎症反应，其机制可能与提升自噬水平相关。