Effects of Danggui Sini Decoction containing serum on mitochondrial division and RhoA/ROCK pathway of dorsal root neurons of SD rats cultured with high glucose
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摘要:目的 探讨当归四逆汤含药血清对高糖培养SD大鼠背根神经元线粒体分裂及Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)通路的影响。方法 各取6只SD大鼠，分别灌胃生理盐水、当归四逆汤后颈动脉取血分别制备正常血清及含药血清。取正常SD大鼠两侧背根神经元进行体外培养，随机分为对照组、高糖组、当归四逆汤组，高糖组和当归四逆汤组细胞以高糖处理，当归四逆汤组细胞再以10%的含药血清处理，对照组细胞正常培养。经正常血清、含药血清处理后，采用CCK-8实验检测各组细胞活力; 采用试剂盒测定各组细胞活性氧(ROS)水平、线粒体膜电位及释放乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)水平; 采用免疫印迹实验检测各组细胞线粒体分裂蛋白包括动力相关蛋白1(Drp1)与分裂蛋白1(Fis1)、融合蛋白即丝裂原融合蛋白1(MFN1)与丝裂原融合蛋白2(MFN2)、RhoA/ROCK通路蛋白RhoA与ROCK表达。结果 与对照组比较，高糖组背根神经元ROS水平及释放的LDH、IL-6、IL-18水平，细胞中Drp1、Fis1、RhoA及ROCK蛋白表达升高，细胞活力、线粒体膜电位、细胞中MFN1及MFN2蛋白表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05); 与高糖组比较，当归四逆汤组背根神经元ROS水平及释放的LDH、IL-6、IL-18水平，细胞中Drp1、Fis1、RhoA及ROCK蛋白表达降低，细胞活力、线粒体膜电位、细胞中MFN1及MFN2蛋白表达升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 当归四逆汤含药血清可下调RhoA/ROCK通路蛋白表达，抑制高糖诱导的ROS和炎性因子表达，减轻炎症反应，减弱线粒体分裂，缓解SD大鼠背根神经元损伤。
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关键词:
- 当归四逆汤 /
- 高糖 /
- 背根神经元 /
- 线粒体分裂 /
- RhoA/ROCK通路
Abstract:Objective To investigate the effects of Danggui Sini Decoction containing serum on mitochondrial division and Ras homolog gene family member A(RhoA)/Rho-associated coiled-coil containing kinase(ROCK) pathway of dorsal root neurons of SD rats cultured with high glucose.Methods Six SD rats were given intragastric administration of normal saline, and another six given Danggui Sini Decoction, the blood was taken from the carotid artery to prepare normal serum and drugs containing serum. Bilateral dorsal root neurons of normal SD rats were cultured in vitro and randomly divided into control group, high glucose group, and Danggui Sini Decoction group. The cells in high glucose group and Danggui Sini Decoction group were treated with high glucose, cells in control group were cultured normally, and cells in the Danggui Sini Decoction group were cultured with 10% drug-containing serum. After treatment with normal serum and containing serum, the cell viability of each group was detected with CCK-8 experiment; the levels of cellular reactive oxygen species (ROS), release lactate dehydrogenase (LDH), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-18 (IL-18) levels in each group were determined with kits; the expressions of mitochondrial division proteins dynamin-related protein 1(Drp1) and fission protein 1(Fis1), fusion proteins mitofusin 1(MFN1) and mitofusin 2(MFN2) and RhoA/ROCK pathway proteins such as RhoA and ROCK in each group were detected with western blotting.Results Compared with the control group, the levels of ROS, the levels of LDH, IL-6 and IL-18, and the expression of Drp1, Fis1, RhoA and ROCK proteins in the dorsal root neurons of rats in the high glucose group were significantly increased (P < 0.05), while the expressions of cell viability, mitochondrial membrane potential, MFN1 and MFN2 protein in cells were significantly reduced (P < 0.05); compared with the high glucose group, the levels of ROS, the levels of LDH, IL-6 and IL-18, and the expression of Drp1, Fis1, RhoA and ROCK proteins in the dorsal root neurons of rats in the Danggui Sini Decoction group were significantly reduced (P < 0.05), while the expressions of cell viability, mitochondrial membrane potential, MFN1 and MFN2 protein in cells were significantly increased (P < 0.05).Conclusion Danggui Sini Decoction containing serum can down-regulate the expression of RhoA/ROCK pathway proteins, inhibit the expressions of ROS and inflammatory factors induced by high glucose, reduce inflammation reaction, weaken mitochondrial division, and alleviate the damage of dorsal root neurons of SD rats. -
急性大面积缺血性脑梗死(AICI)是常见脑患者的生命健康具有较大危害。有报道[2]指出，血小板的活化以及血管内皮的损伤与AICI的发病密切相关。CD62p与CD63主要由活化血小板表达，是评价血栓风险的标志物[3]，随着临床研究的不断深入，其与脑梗死的发病机制受到更多重视，其动态表达可为临床工作者提供量化血小板功能的检测指标[4]。本研究通过探讨血小板膜糖蛋白CD62p、CD63及血小板活化因子(PAF)表达水平与AICI患者预后的关系，为临床治疗提供数据参考，现报告如下。
1. 资料和方法
1.1 一般资料
选择从2019年2月—2020年6月在本院接受治疗的AICI患者200例为观察对象并纳入观察组，选取健康体检者50例为对照组。纳入标准: 患者均符合AICI的有关诊断标准; 经CT或MRI检查确诊者; 发病至入院时间 < 48 h, 且2周内未口服抗凝和抗血小板以及溶栓药物者; 患者已知情并签署同意书。排除标准: 有恶性肿瘤者; 有其他类别的心脑血管疾病者; 有血液疾病者; 存在精神疾病者。观察组男135例，女65例; 年龄52~68岁，平均(62.33±2.14)岁。观察组根据90 d内存活情况，分为死亡组(32例)和存活组(168例)。对照组男30例，女20例; 年龄51~66岁，平均(62.40±2.23)岁。观察组和对照组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院的伦理委员会备案。
1.2 方法
抽取各组患者空腹肘关节血5 mL, 乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，选择贝克曼库尔特公司生产的EPICSXL流式细胞仪和配套的试剂，分别检测CD62p及CD63水平。另取2 mL给予3 000 r/min离心15 min, 然后通过酶联免疫法检测PAF水平，试剂盒均购于深圳的晶美工程公司。本研究观察组采用常规治疗，根据患者具体情况采取溶栓、抗血小板、抗凝、降纤、血管介入等方法进行治疗。
观察组患者出院后第90天进行门诊或电话随访。采用改良Rankin量表(mRS) 进行评分。0分为完全无症状; 1分为有症状，但无明显功能障碍; 2分为轻度残疾; 3分为中度残疾，能独立行走; 4分为中重度残疾，生活需要他人帮助; 5分为重度残疾，生活完全依赖于他人; 6分为死亡。评分为0~2分为预后良好组, 3~6分为预后不良组。
1.3 观察指标
对比不同组患者CD62p、CD63及PAF水平。
1.4 统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料用(x±s)表示，组间比较采用t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 观察组与对照组患者血清CD62p、CD63及PAF水平比较
观察组患者CD62p、CD63及PAF水平均高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。
表 1 观察组与对照组血清CD62p、CD63及PAF水平比较(x±s)组别 n CD62p/% CD63/% PAF/(ng/mL) 观察组 200 12.73±2.35* 14.58±2.82* 108.84±15.33* 对照组 50 5.36±1.30 6.50±1.58 62.83±15.29 PAF: 血小板活化因子。与对照组比较, * P < 0.05。 2.2 死亡组与存活组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平比较
死亡组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平均高于存活组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
表 2 死亡组与存活组血清CD62p、CD63及PAF水平比较(x±s)组别 n CD62p/% CD63/% PAF/(ng/mL) 存活组 168 10.26±3.18 12.58±2.27 87.23±13.29 死亡组 32 13.69±2.42* 14.67±3.04* 106.79±14.42* PAF: 血小板活化因子。与存活组比较, * P < 0.05。 2.3 预后良好组与预后不良组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平比较
预后不良组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平均高于预后良好组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。
表 3 预后良好组与预后不良组血清CD62p、CD63及PAF水平比较(x±s)组别 n CD62p/% CD63/% PAF/(ng/mL) 预后不良组 25 17.01±3.12* 19.84±2.54* 136.75±12.64* 预后良好组 175 9.83±2.19 9.32±1.13 78.42±7.53 PAF: 血小板活化因子。与预后良好组比较, * P < 0.05。 3. 讨论
临床上大面积AICI是由于脑部发生急性血管阻塞而导致血供中断的脑血管类疾病[5]。报道[6]指出，患者机体内的血小板活化以及血管内皮损伤可能参与了AICI。当发生血流状态变化或血管损伤等情况时，患者机体逐渐调节至血栓前的状态，甚至是形成血栓症状[7], 这使得受损血管壁自主地暴露胶原，同时还会释放出凝血酶以及血小板的诱导因子，导致血小板不断黏附在血管壁上，从而产生形态改变及细胞内的生化反应，最终诱发了AICI[8]。
本研究通过比较发现观察组患者血清CD62p、CD63及PAF水平均高于对照组，这提示CD62p、CD63及PAF可能参与了AICI的发生，提示血小板活化在ACI发生中发挥重要作用。分析原因, AICI患者机体内黏附型血小板能够连接相应的纤维蛋白原，并使得血小板发生聚集，致使动脉血栓产生，引起血管闭塞并导致梗死。而活化后的血小板释放出的有关活性物质能够对血管壁产生作用，促使机体的平滑肌细胞发生收缩，且血管痉挛，从而使血管闭塞的症状加重[9]。而CD62p及CD63均属于血小板的膜糖蛋白，其中前者可在α颗粒膜表达，后者主要分布在处于静止状态的溶酶体膜中[10]。在血小板发生活化后，α颗粒膜能融合血小板的有关胞浆膜，此时CD62p主要暴露在血小板的膜表层，而CD63能够脱颗粒表达于血小板的膜表层[11], 这表明二者的高表达能够标志性地反映出血小板的活化以及血栓形成。PAF和机体内花生四烯酸的代谢联系紧密[12-13], 可由血小板的内皮细胞、肥大细胞以及巨噬细胞共同参与，从而在机体变态反应或炎性反应中产生重要作用[14-15], 同时还能参与AICI患者神经功能的修复，在生理状态下还可调节脑部的兴奋型递质的释放进而影响相关突触的可塑性。同时，本研究观察组存活者的CD62p、CD63及PAF水平均明显低于死亡者，预后不良脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平均明显高于预后良好脑梗死患者，提示CD62p、CD63及PAF水平与预后有关。CD62P、CD63及PAF为最具有特征性的血小板活化分子标志物，大量释放后会启动和扩大血栓形成，进而加重病情[16], 临床上可针对上述指标实施重点监测，从而更好地评估AICI患者的临床治疗情况及预后。
综上所述, AICI患者的血小板膜糖蛋白CD62p、CD63及PAF动态表达水平升高，且这3项指标与患者的治疗及预后均呈负相关。
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表 1 各组大鼠背根神经元ROS水平及释放的LDH水平比较(x±s)
组别 ROS/(U/kg prot) LDH/(U/L) 对照组 1.01±0.13 0.49±0.07 高糖组 6.87±0.92* 1.14±0.18* 当归四逆汤组 1.12±0.15# 0.55±0.10# ROS: 活性氧; LDH: 乳酸脱氢酶。
与对照组比较, *P < 0.05; 与高糖组比较, #P < 0.05。
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表 2 各组大鼠背根神经元释放IL-6、IL-18水平(x±s)
组别 IL-6/(ng/mL) IL-18/(pg/mL) 对照组 0.31±0.05 30.07±4.95 高糖组 0.72±0.13* 62.13±10.26* 当归四逆汤组 0.34±0.07# 31.58±5.14# IL-6: 白细胞介素-6; IL-18: 白细胞介素-18。
与对照组比较, *P < 0.05; 与高糖组比较, #P < 0.05。
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表 3 各组大鼠背根神经元线粒体分裂蛋白及融合蛋白相对表达水平(x±s)
组别 Drp1/β-actin Fis1/β-actin MFN1/β-actin MFN2/β-actin 对照组 0.68±0.09 1.04±0.15 1.26±0.27 1.32±0.33 高糖组 1.57±0.30* 2.02±0.38* 0.61±0.11* 0.52±0.14* 当归四逆汤组 0.71±0.12# 1.10±0.24# 1.21±0.30# 1.27±0.29# Drp1: 兔源动力相关蛋白1; Fis1兔源分裂蛋白1; MFN1: 兔源丝裂原融合蛋白1; MFN2: 兔源丝裂原融合蛋白2。
与对照组比较, *P < 0.05; 与高糖组比较, #P < 0.05。
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表 4 各组大鼠背根神经元RhoA/ROCK通路蛋白相对表达(x±s)
组别 RhoA/β-actin ROCK/β-actin 对照组 0.71±0.10 0.92±0.17 高糖组 1.80±0.36* 2.11±0.39* 当归四逆汤组 0.76±0.14# 0.98±0.20# RhoA: Ras同源基因家族成员A;
ROCK: Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶。与对照组比较, *P < 0.05; 与高糖组比较, #P < 0.05。
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