动脉粥样硬化是缺血性脑卒中发病的重要原因^[1]。动脉粥样硬化可造成血管严重狭窄，对应脑功能区域低灌注，还会导致病变血管内湍流，易引起粥样斑块破裂或血栓形成，从而诱发缺血性脑卒中^[2-3]。缺血性脑卒中发病早期即可出现一系列的炎症反应及免疫反应，特别是T细胞在卒中发生后24 h内就被募集至脑损伤区域，是造成急性期神经细胞损伤的主要免疫细胞^[4-6]。此外，在缺血性脑卒中的早期阶段，单核细胞在外周血中的分布也明显增多^[7]。

动脉粥样硬化斑块的形成主要是因胆固醇和胆固醇酯等脂质成分的沉积。高密度脂蛋白(HDL)可促进胆固醇从细胞内流出，清除巨噬细胞内多余的胆固醇，从而降低动脉粥样硬化的发生率^[8]。此外, HDL还具有抗炎和抗凋亡作用，在减缓动脉粥样硬化进展过程中发挥重要保护作用^[9]。本研究分析急性期缺血性脑卒中患者HDL对免疫细胞分布的影响，现将结果报告如下。

1.   资料与方法

1.1   一般资料

选取2019年4月—2020年1月就诊于首都医科大学宣武医院神经内科的急性缺血性脑卒中患者42例为研究对象。纳入标准: ①年龄18~80岁者; ②发病至医院就诊时间≤7 d者; ③磁共振弥散序列成像(MRI-DWI)确认为新发缺血性脑卒中者; ④患者发病时间已超过取栓和溶栓时间窗，需转入病房接受标准内科治疗(治疗方式参照中国缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作二级预防指南)。本研究通过了首都医科大学宣武医院伦理委员会的审查和批准，并在纳入研究前获得了患者的知情同意。排除标准: ①使用任何免疫抑制剂的患者; ②患有免疫性疾病的患者; ③合并严重心脏、肝脏及脾脏疾病患者。所有患者均在入院后次日清晨空腹采集血标本，并将所有血样本进行生化检测，明确外周血HDL的表达水平，并进一步行流式细胞分析。

1.2   流式细胞仪检测

所有患者在接受治疗前通过肘部采集外周血标本，采用EDTA抗凝采血管收集2 mL新鲜静脉血，轻轻摇匀，充分抗凝后及时送检，行流式细胞仪检测(BD LSRII, Becton Dickinson公司，美国)。

流式细胞仪检测方法: ①从每管获取的血样本中取100 μL抗凝全血放入流式管，按荧光抗体染色组合加入各自最佳使用量抗体。②将血液与荧光标记抗体均匀混合后室温避光反应20 min。③向每个样品管中加入2 mL红细胞裂解液(1x), 均匀混合后室温避光孵育10 min。④将流式样品管置于台式离心机中, 300转离心5 min, 弃上清。⑤向每个样品管中加入2 mL流式细胞洗液，混匀后放入台式离心机中300转离心5 min, 弃上清。⑥向每个样品管中加入0.5 mL流式细胞洗液，混匀后4 ℃避光，及时采用流式细胞仪检测分析。⑦采用美国BD LSR II型流式细胞仪分析细胞群，并采用FACS Diva 6.1.3软件分析细胞群数据。检测的细胞群有: CD3⁺T细胞, CD3⁺CD4⁺T细胞, CD3+CD8⁺T细胞，单核细胞, CD14⁺CD16^-单核细胞, CD14⁺CD16⁺单核细胞。本研究所使用抗体均购自BD Pharmingen (圣何塞，加利福尼亚州，美国)或BioLegend(圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。

1.3   统计学分析

本研究中所有连续变量均采用(x±s)表示。2组连续变量对比分析前，首先运用F检验进行方差齐性分析。若方差齐，采用Student′s t检验分析2组连续变量间的差异; 若方差不齐，则采用Mann Whitney检验分析2组连续变量间的差异。为减少混杂因素的影响，应用SPSS 25.0软件进行倾向性得分匹配分析，采用性别、陈旧性脑梗死病史、糖尿病作为协变量，匹配容差为0.05, 对2组进行1∶1倾向性得分匹配分析。应用卡方检验比较计数变量间的差异。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2.   结果

本研究共纳入42例符合标准的患者，根据外周血HDL水平的不同分为HDL < 1.0 mmol/L组(n=22)和HDL≥1.0 mmol/L组(n=20)。

2.1   HDL对T淋巴细胞分布的影响

本研究分析了脑卒中患者HDL的基础水平对急性期外周血中T淋巴细胞分布水平的影响，结果发现, HDL < 1.0 mmol/L组患者CD3⁺T淋巴细胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L组，差异有统计学意义(P=0.032)。进一步分析发现, HDL < 1.0 mmol/L组患者CD3⁺CD4⁺ T淋巴细胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L组，差异有统计学意义(P < 0.000 1), 但CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L组，差异有统计学意义(P=0.047)。见图 1。

图  1  T淋巴细胞在缺血性脑卒中急性期患者外周血中的比率

A、B、C、D、E: 外周血T淋巴细胞流式细胞仪检测门控策略图; F: 2组CD3⁺T淋巴细胞百分比的比较，与HDL < 1.0 mmol/L组比较, P=0.032; G: 2组CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞百分比的比较，与HDL < 1.0 mmol/L组比较, P < 0.000 1; H: 2组CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比的比较，与HDL < 1.0 mmol/L组比较, P=0.047。

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2.2   HDL对单核细胞分布的影响

本研究通过流式细胞仪分析了入组患者外周血中单核细胞的百分比，并分析了单核细胞的2种主要亚型CD14⁺CD16^-单核细胞和CD14⁺CD16⁺单核细胞的百分比。结果显示，在脑卒中急性期, HDL < 1.0 mmol/L组和HDL≥1.0 mmol/L组患者外周血中总单核细胞、CD14⁺CD16^-单核细胞和CD14⁺CD16⁺单核细胞百分比差异无统计学意义(P > 0.05)。见图 2。

图  2  单核细胞在缺血性脑卒中急性期患者外周血中的比率

A、B、C: 外周血单核细胞流式细胞仪检测门控策略图; D: 2组总单核细胞百分比的比较; E: 2组CD14⁺CD16⁺单核细胞百分比的比较; F: 2组CD14⁺CD16^-单核细胞百分比的比较。

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2.3   倾向评分匹配后2组结果比较

鉴于真实世界中女性人群平均HDL水平高于男性人群^[10], 本研究中HDL≥1.0 mmol/L组中女性患者的比率也高于男性。为了减少性别对于研究结果的影响，应用SPSS 25.0软件，以性别、陈旧性脑梗死病史、糖尿病作为协变量，匹配容差为0.05, 对2组进行1∶1倾向性得分匹配分析，匹配后2组共有13对病例完成匹配，见表 1。对于匹配后的13对患者进行统计分析，结果发现HDL < 1.0 mmol/L组患者CD3^+T淋巴细胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L组(P=0.039), CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L组(P < 0.0001), CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L组(P=0.007), 差异均有统计学意义，见图 3。HDL < 1.0mmol/L组和HDL≥1.0mmol/L组患者外围中总单核细胞、CD14⁺SD16^-单核细胞和CD14⁺CD16⁺单核细胞的百分比差异无统计学意义(P > 0.05)。

表  1  匹配前后患者临床资料比较(x±s)

临床资料	未匹配			倾向评分匹配后
	HDL < 1.0mmol/L	HDL≥1.0mmol/L	P		HDL < 1.0mmol/L	HDL≥1.0mmol/L	P
例数	22	20	—		13	13	—
女性	3	9	0.025		3	3	1.000
年龄/岁	57.45±12.79	58.10±10.54	0.860		55.62±13.05	55.54±11.82	0.988
发病时间/d	3.64±2.49	4.15±1.73	0.453		3.54±2.33	4.08±1.44	0.486
陈旧性脑梗死	3	0	0.087		0	0	—
高脂血症	12	10	0.768		6	7	0.695
高血压	16	15	0.867		9	11	0.352
糖尿病	11	5	0.096		4	4	1.000
低密度脂蛋白/(mmol/L)	2.42±0.90	2.37±0.63	0.844		2.44±1.07	2.38±0.68	0.873
同型半胱氨酸/(μmol/L)	13.44±2.37	14.08±3.90	0.520		13.40±1.73	13.90±4.57	0.716

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图  3  倾向性评分匹配后T淋巴细胞和单核细胞在缺血性脑卒中急性期患者外周血中的比率

A: 2组匹配后CD3⁺T细胞占总淋巴细胞的比率; B: 2组匹配后CD3⁺CD4⁺T细胞占总淋巴细胞的比率; C: 2组匹配后CD3⁺CD8⁺T细胞占总淋巴细胞的比率; D: 2组匹配后总单核细胞百分比; E: 2组匹配后CD14⁺CD16⁺单核细胞百分比; F: 2组匹配后CD14⁺CD16^-单核细胞百分比。

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3.   讨论

大量研究^{[9, 11]}表明, HDL水平与动脉粥样硬化和心脑血管疾病的风险呈负相关。HDL是胆固醇从细胞或外周组织中转运至肝脏内代谢的主要载体，较高水平的HDL可减少胆固醇在动脉壁内聚集，在动脉粥样硬化病变进程中发挥保护作用。目前研究^[12-13]发现HDL还具有一定的抗氧化、抗组织增生、抗血栓等作用, HDL还可能在炎症调节中发挥额外的作用，包括抑制单核细胞活化和调节免疫系统，这些功能均有利于血管的抗动脉粥样硬化作用。

缺血性脑卒中是目前导致人类高死亡和高致残风险的主要疾病之一，也是神经科学中病因机制研究的重点^[14-15]。研究^[4]发现，缺血性脑卒中患者发病早期即可出现明显的炎症反应和免疫反应。T细胞作为一类主要的免疫细胞，在缺血性脑卒中后的免疫反应中具有重要的调节作用。BRAIT V H等^[16]研究发现，缺血性脑卒中发病24h后，在脑缺血区域及周围梗死区域即可检测到CD3⁺T淋巴细胞。动物实验研究^[17]发现，在脑卒中发病后24~72 h, 在脑缺血区域可检测到CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞的招募和入侵，并且CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞在缺血性脑卒中患者发生炎症反应、脑组织损伤等过程中均发挥重要作用。本研究发现HDL < 1.0 mmol/L组患者CD3⁺T淋巴细胞及CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L组患者，但CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L组，表明HDL可减轻脑卒中患者急性期T淋巴细胞的入侵，并且主要通过减少CD3⁺T淋巴细胞、CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞的招募和入侵发挥脑保护作用，但是并不能抑制脑卒中后对CD3⁺CD8⁺T细胞的募集。

单核细胞可在急性脑卒中发生后4h入侵中枢神经系统，并在发病后7d达到高峰^[18]。单核细胞根据分化阶段不同而分为多种亚型，其中人类最常见的亚型为CD14+CD16-单核细胞、CD14⁺CD16⁺单核细胞、CD16⁺CD14^-单核细胞，这些不同亚型的单核细胞在脑卒中发生的不同阶段发挥着不同的促炎和抗炎作用^[7]。本研究发现在缺血性脑卒中急性期，HDL < 1.0 mmol/L组和HDL≥1.0 mmol/L组患者外周血中总单核细胞、CD14⁺CD16^-单核细胞和CD14⁺CD16⁺单核细胞的百分比差异无统计学意义(P > 0.05), 表明HDL对于单核细胞的调控作用较小。

既往研究^{[10, 15]}发现中国女性HDL表达水平高于男性，并且在女性绝经期后HDL水平无明显降低。此外，在真实世界研究^[19]中，中国女性人群糖尿病发病率低于男性。本研究也发现HDL≥1.0 mmol/L组中女性比率较高，糖尿病比率较低，符合目前中国人群流行病学规律。为了去除性别和糖尿病对于研究结果的影响，本研究通过倾向性评分匹配分析的方法来去除这些混杂因素的影响，然后检测2组间免疫细胞分布的差异。结果显示, HDL < 1.0 mmol/L组患者CD3⁺T淋巴细胞、CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L组患者, CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L组患者，差异均有统计学意义。HDL < 1.0 mmol/L组和HDL≥1.0 mmol/L组患者外周血中总单核细胞、CD14⁺CD16^-单核细胞和CD14⁺CD16⁺单核细胞的百分比差异无统计学意义。上述研究结果进一步验证了在缺血性脑卒中急性期患者中，较高水平的HDL常伴随有低水平的CD3⁺T淋巴细胞募集，并主要减少CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞的募集。虽然HDL≥1.0 mmol/L组患者外周血中CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比高于HDL < 1.0 mmol/L组患者，但是总CD3⁺T淋巴细胞百分比在HDL≥1.0 mmol/L组患者中偏低。由于CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞和CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞是CD3⁺T细胞发挥作用的2种主要亚型，因此HDL≥1.0 mmol/L组患者外周血CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比的增加可能是因CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞的减少引起的反馈性增加，但仍需进一步研究证实。

综上所述，在缺血性脑卒中急性期患者中，较高水平的HDL常伴有低水平的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞的募集，这种结果可能有利于减少缺血性卒中后的脑组织损伤。