Roles and mechanism of carnosol for mice with lipopolysaccharide-induced acute lung injury
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摘要:目的 探讨鼠尾草酚在脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）中的作用及其分子机制。方法 将40只周龄10~12周的雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、鼠尾草酚组、ALI组和治疗组（ALI+鼠尾草酚），每组10只。鼠尾草酚组和治疗组于LPS注射前1周给予鼠尾草酚20 mg/（kg·d）灌胃，持续7 d。ALI组和治疗组通过单次腹腔注射LPS（10 mg/kg）的方式构建小鼠ALI模型，对照组和鼠尾草酚组则注射等剂量生理盐水。注射LPS 12 h后，取小鼠主动脉血和肺组织，检测各组小鼠的动脉血氧分压[pa（O2）]、动脉血二氧化碳分压[pa（CO2）]、血清乳酸脱氢酶（LDH），记录肺湿干质量比值，HE染色观察各组小鼠肺组织损伤状况。采用免疫印迹法检测各组小鼠肺组织中铁死亡标志蛋白前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白的表达水平。检测小鼠肺组织中核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）/血红素氧合酶-1（HO-1）信号通路相关蛋白的表达。结果 与对照组相比，ALI组小鼠肺组织出现明显肺水肿、炎症细胞和红细胞浸润等损伤特征，肺湿干质量比值、气道压、pa（CO2）升高，pa（O2）降低，肺组织中PTSG2蛋白表达升高、GPX4蛋白降低，Nrf2、HO-1蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）；与ALI组相比，治疗组小鼠肺组织损伤减轻，肺湿干质量比值降低，pa（O2）升高，pa（CO2）降低，肺组织中PTSG2蛋白表达降低、GPX4蛋白升高，Nrf2、HO-1蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论 鼠尾草酚具有减轻小鼠ALI的作用，其可能通过调控Nrf2/HO-1抑制铁死亡而发挥肺保护作用。Abstract:Objective To explore the role of carnosol for mice with lipopolysaccharide (LPS)-induced murine acute lung injury (ALI) and its molecular mechanism.Methods A total of 40 male C57BL/6 mice aged 10 to 12 weeks were randomly divided into control group (n=10), carnosol group (n=10), ALI group(n=10) and treatment group (ALI+ carnosol, n=10). The carnosol group and the treatment group were given intragastric administration of carnosol for 20 mg/(kg·d) 1 week before LPS injection. The ALI group and the treatment group were injected with a single intraperitoneal injection of LPS (10 mg/kg) to construct a murine ALI model, while the control group and the carnosol group were injected with the same dose of normal saline. After 12 hours of LPS injection, the mouse aortic blood and lung tissues were collected, and the partial pressure of oxygen[pa(O2)], carbon dioxide[pa(CO2)]in the arterial blood, and serum lactic dehydrogenase (LDH) were measured. Lung wet-to-dry weight ratio was recorded, and the tissue damage was detected by HE staining. Western blot was used to detect the protein expression levels of ferroptosis markers including prostaglandin intraperoxidase synthase 2 (PTGS2) protein and glutathione peroxidase 4 (GPX4) protein in lung tissues of mice in each group. Finally, the expression of nuclear transcription factor red 2 related factor 2 (Nrf2)/heme oxygenase-1 (HO-1) signaling pathway related proteins in lung tissues of mice was detected.Results Compared with the control group, the ALI group showed obvious damage such as pulmonary edema, inflammatory cells and red blood cells infiltration, the wet-to-dry weight ratio, the airway pressure and pa(CO2) were significantly decreased, pa(O2)was significantly increased, the expression of PTSG2 protein in lung tissue was increased, GPX4 proteinwas decreased, and the expression levels of NRF2 and HO-1 protein were significantly reduced (P < 0.05). Compared with the ALI group, the lung injury in the treatment group was significantly reduced, the wet-to-dry weight ratio was significantly reduced, pa(O2)was significantly increased, pa(CO2) was significantly decreased, the expression of PTSG2 protein in lung tissue was decreased, GPX4 protein was increased, the expression levels of NRF2 and HO-1 protein were significantly increased (P < 0.05).Conclusion Carnosol has the potential to protect against ALI in mice, and plays the role in inhibiting ferroptosis by activating NRF2/HO-1 pathway.
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肝细胞损伤是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)进展的启动因子，有效保护肝脏细胞、抑制肝脏炎症有助于延缓疾病进程，提高治疗效果。甘草酸制剂是保肝、抗炎的常用药物，具有抗细胞凋亡、稳定肝细胞膜、预防肝纤维化、抑制炎症介质释放、抗病毒及免疫调节等作用[1-3]。复方甘草酸苷与异甘草酸镁作为甘草酸第2代和第4代制剂，临床上用于治疗各种肝病导致的急慢性肝损伤，而异甘草酸镁又因其高靶向性、高亲脂性及强抗炎活性等优势，能显著改善病毒性肝炎、自身免疫性肝病、NAFLD等慢性肝病患者谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)水平，促进组织学恢复[4]。NAFLD患者常合并脂质代谢紊乱，肝细胞内脂质过量沉积，导致其更易受到氧化应激、炎症因子等“多重打击”，多种因素对肝脏的叠加损伤加速了肝纤维化、肝硬化的进程。基础研究[5]表明，异甘草酸镁也能够通过调节相关脂质代谢基因的表达减少脂肪酸合成，改善肝细胞脂肪变性。本研究比较异甘草酸镁与复方甘草酸苷治疗NAFLD患者的临床疗效，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年1月—2019年12月本院感染科收治的60例NAFLD患者为研究对象。NAFLD诊断标准[6]: ①患者无饮酒史或饮酒折合乙醇量为男性 < 30 g/d, 女性 < 20 g/d; ②患者血清转氨酶升高，以ALT增高为主，可伴有谷氨酰转肽酶(γ-GT)、甘油三酯(TG)等指标升高; ③排除病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、甲状腺功能减退症等可导致脂肪肝的特定疾病者; ④符合脂肪肝的影像学标准者，即B超影像检查显示肝前场回声增强、远场回声衰减和肝内管道结构不清晰等弥漫性脂肪肝特征。纳入标准: ①符合NAFLD诊断标准者; ②病历资料齐全者; ③按照疗程完成治疗者。排除标准: ①药物过敏、禁忌者; ②合并心、肺、肾功能障碍或伴有其他全身系统原发性疾病者; ③妊娠期或哺乳期妇女; ④肝癌及其他恶性肿瘤患者。将60例患者随机分为2组，每组30例。对照组男18例，女12例，平均年龄(42.37±6.31)岁; 观察组男20例，女10例，平均年龄(43.77±4.30)岁。2组性别、年龄、肝功能、血脂等基线资料比较，差异无统计学意义(P > 0.05), 具有可比性。
1.2 方法
2组住院期间均对生活方式予以干预: ①制订科学膳食方案，定时、定量摄入糖类及饱和脂肪酸，适量补充膳食纤维及维生素; ②指导科学运动锻炼，采取慢跑、竞走、打乒乓球等中等运动量的有氧运动，每天锻炼时间约30 min。对照组在此基础上接受复方甘草酸苷注射液(日本米诺发源制药株式会社，注册证号H20181051)治疗, 160 mg复方甘草酸苷注射液加入250 mL 5%葡萄糖注射液中静脉滴注, 1次/d, 疗程为2周。观察组在此基础上接受异甘草酸镁注射液(正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20051942)治疗, 150 mg异甘草酸镁注射液加入250 mL 5%葡萄糖注射液中静脉滴注, 1次/d, 疗程为2周。
1.3 观察指标
① 临床症状改善情况; ②肝功能、血脂及电解质镁离子[7]变化; ③治疗过程中患者出现的药物不良反应。根据患者的临床症状及实验室检查结果评估临床疗效: 治疗后症状消失且ALT下降≥70%判定为显效; 治疗后症状好转且ALT下降30%~ < 70%判定为有效; 治疗后症状及ALT无明显改善判定为无效。总有效率=(有效例数+显效例数)/总例数×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以(x±s)表示，采用t检验分析，计数资料采用χ2检验分析, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组治疗前后肝功能、血脂及镁离子等指标比较
治疗后, 2组ALT、天门冬氨酸转氨酶(AST)、γ-GT、碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(TC)及TG水平均低于治疗前，差异有统计学意义(P < 0.05); 观察组治疗后ALT、AST、TC及TG水平低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1、2。
表 1 2组治疗前后肝功能指标比较(x±s)U/L 组别 时点 ALT AST γ-GT ALP 对照组 治疗前 188.39±143.16 102.84±70.17 162.09±234.98 97.22±37.42 治疗后 77.50±32.39* 57.47±40.05* 115.44±139.32* 93.60±47.54* 观察组 治疗前 176.43±128.23 112.30±100.66 178.60±238.78 101.33±36.65 治疗后 51.87±27.34*# 37.63±14.41*# 92.03±112.20* 79.83±24.25* ALT: 谷氨酸-丙酮酸转氨酶; AST: 天门冬氨酸转氨酶; γ-GT: 谷氨酰转肽酶; ALP: 碱性磷酸酶。
与治疗前比较, *P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。表 2 2组治疗前后血脂指标及镁离子水平比较(x±s)mmol/L 组别 时点 TC TG 镁离子 对照组 治疗前 6.41±0.96 2.90±1.28 0.92±0.13 治疗后 5.27±1.06* 2.18±1.42* 1.15±0.90 观察组 治疗前 7.09±2.93 2.66±0.96 0.92±0.10 治疗后 4.12±1.29*# 1.36±0.69*# 1.01±0.57 TC: 总胆固醇; TG: 甘油三酯。
与治疗前比较, *P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。2.2 2组患者治疗前后症状改善比较
2组患者治疗后肝区不适、疲倦乏力、食欲减退、腹部胀满症状均较治疗前改善，差异有统计学意义(P < 0.05), 但2组组间治疗前后差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 3。
表 3 2组患者治疗前后症状改善情况比较[n(%)]组别 n 时点 肝区不适 疲倦乏力 食欲减退 腹部胀满 对照组 30 治疗前 25(83.33) 29(96.67) 26(86.67) 25(83.33) 30 治疗后 7(23.33)* 6(20.00)* 15(50.00)* 8(26.67)* 观察组 30 治疗前 28(93.33) 24(80.00) 28(93.33) 25(83.33) 30 治疗后 8(26.67)* 6(20.00)* 12(40.00)* 5(16.67)* 与治疗前比较, *P < 0.05。 2.3 2组患者临床疗效比较
对照组总有效率80.00%, 观察组总有效率96.67%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 4。
表 4 2组患者临床疗效比较[n(%)]组别 n 显效 有效 无效 总有效 对照组 30 12(40.00) 12(40.00) 6(20.00) 24(80.00) 观察组 30 18(60.00) 11(36.67) 1(3.33) 29(96.67)* 与对照组比较, *P < 0.05。 2.4 2组不良反应比较
观察组发生1例眼睑水肿, 1例心悸; 对照组发生1例皮疹, 1例心悸。经对症处理后均能缓解，且患者耐受性良好。
3. 讨论
复方甘草酸苷由甘草酸、甘氨酸及盐酸半胱氨酸组成，其主要结构与肾上腺皮质激素类似，因而可通过调节胆碱能神经兴奋、调节物质代谢及激活或抑制酶的活性等机制发挥抗炎作用[8]。甘草酸类制剂因在保护肝细胞、对抗肝脏炎症等方面的广泛作用而备受关注，其中的α体甘草酸虽然含量较少，却有高肝脏靶向性、强抗炎活性及高亲脂性等优点。异甘草酸镁为甘草酸的立体异构体，为天然甘草酸经过碱催化、异构化成盐并精制而成的18-α异构体甘草酸。基础研究[9-10]表明，在各种肝毒剂诱导的肝损伤模型中，异甘草酸镁能显著抑制ALT、AST等指标的升高，逆转肝细胞的变性、坏死及纤维化程度，减轻炎性细胞浸润。异甘草酸镁的药物组织分布较少，易与受体蛋白结合，静脉给药后能够迅速分布并集中于肝脏，且体内消除半衰期较甘草酸、甘草酸氨更长，临床给药更为便利[11]。与以往的甘草酸制剂相比，异甘草酸镁避免了非活性异构引起的不良反应，并在抗炎症、抗氧化、膜稳定及调节免疫等功能方面表现出更强大的疗效。此外，转录组测序结果[12]表明，异甘草酸镁能够降低Toll样受体4的表达来调节肝脂肪变性中的能量稳态和炎症，提示其抗炎作用与抑制脂化存在密切联系。
NAFLD作为一种多系统受累的代谢应激性肝损伤疾病，与肥胖、2型糖尿病及高脂血症密切相关[13]。NAFLD的发生、发展可能涉及多种机制，包括但不限于胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、线粒体功能障碍和肠道菌群失调，由此引发的外周脂肪组织转运会加速肝脏对游离脂肪酸的摄取，促进甘油三酯合成，导致肝脏脂质过量堆积[14-15]。目前对NAFLD患者的治疗仍以改变生活方式为主，合理膳食、适当锻炼及纠正不良生活习惯等基础治疗即可减少肝脏脂肪含量，阻止肝病进展及预防心脑血管疾病[16-18]。但部分NAFLD患者的基础治疗疗效有限，且不能改善肝脏组织学异常[19]。本研究结果显示，2组患者治疗后肝功能、血脂指标及临床症状均有显著改善，且未见严重不良反应; 观察组治疗后ALT、AST、TC及TG水平低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 提示观察组降酶、降脂的功效优于对照组[20-21]; 2组临床症状改善无显著差异，与茅益民等[4]研究结果一致，分析原因可能是综合治疗加速了肝脏炎症的消除，而肝脏本身的代偿能力较强，临床症状消失更快。本研究初步表明，异甘草酸镁具有保肝、降酶、调节脂质代谢的作用，其对于肝脏慢性炎症及肝脏脂质堆积具有协同治疗作用或可有效降低NAFLD进展为肝硬化、原发性肝癌的风险[22]。
一项关于健康和营养的全国性队列研究[23]表明，镁摄入量的增加能够显著降低NAFLD患者肝病死亡风险。王松[24]通过增加NAFLD模型小鼠外源性镁离子摄入发现，镁离子参与了脂代谢基因的调控和抗炎症、促炎症因子的平衡，有效缓解模型小鼠肝细胞的脂肪变性。本研究发现, 2组治疗前后镁离子水平并无显著变化，镁离子的稳态受到肾脏的严格调节，因此短时间的干预尚不能有效升高血清镁离子水平，考虑镁在相关脂质代谢酶促反应中的重要作用[25], 可以选择其特异性靶点深入探讨异甘草酸镁中镁离子对NAFLD患者的潜在疗效。目前，不同甘草酸类制剂的使用尚无明确标准，临床疗效的比较缺少严格的随机对照研究，由于住院期间使用单一保肝药物的患者较少，因此样本量较少，但本研究初步揭示了异甘草酸镁不仅改善了NAFLD患者的炎症状态，而且能够通过调节脂质代谢逆转肝脏脂质堆积，效果优于复方甘草酸苷。此外，鉴于两种药物的疗效及价格差异，临床医生应综合考虑NAFLD患者的脂质代谢紊乱程度和经济情况，权衡利弊后合理用药。
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图 2 各组小鼠肺组织铁死亡标志物的Western blot检测结果
A: 各组Western blot蛋白条带图; B: 各组PTGS2蛋白水平; C: 各组GPX4蛋白水平。图B、图C中，与对照组比较, *P < 0.05; 与ALI组比较, #P < 0.05。
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图 3 各组小鼠肺组织NRF2、HO-1蛋白的Western blot检测结果
A: 各组Western blot蛋白条带图; B: 各组NRF2蛋白水平; C: 各组HO-1蛋白水平。图B、图C中，与对照组比较, *P < 0.05; 与ALI组比较, #P < 0.05。
表 1 各组小鼠肺湿干质量比值和血清LDH水平比较(x±s)
组别 n 肺湿干质量比值 血清LDH/(U/L) 对照组 10 3.92±0.87 37.12±4.14 鼠尾草酚组 10 3.94±0.76 38.02±4.01 ALI组 10 7.13±0.34* 79.84±4.61* 治疗组 10 4.91±0.52# 52.03±1.66# ALI: 急性肺损伤; LDH: 乳酸脱氢酶。
与对照组比较, *P < 0.05; 与ALI组比较, #P < 0.05。
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表 2 各组小鼠肺功能指标比较(x±s)
组别 n 气道压力/(cmH2O/mL) pa(O2)/mmHg pa(CO2)/mmHg 对照组 10 0.38±0.12 82.11±3.49 44.92±0.33 鼠尾草酚组 10 0.43±0.11 79.03±2.87 44.19±4.93 ALI组 10 1.02±0.12* 51.02±3.22* 65.92±3.02* 治疗组 10 0.78±0.14# 70.82±3.01# 51.02±4.82# ALI: 急性肺损伤; pa(O2): 动脉血氧分压; pa(CO2): 动脉血二氧化碳分压。
与对照组比较, *P < 0.05; 与ALI组比较, #P < 0.05。
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[1] TAO H, LI N, ZHANG Z, et al. Erlotinib protects LPS-induced acute lung injury in mice by inhibiting EGFR/TLR4 signaling pathway[J]. Shock, 2019, 51(1): 131-138. doi: 10.1097/SHK.0000000000001124
[2] DING Z, ZHONG R, XIA T, et al. Advances in research into the mechanisms of Chinese Materia Medica against acute lung injury[J]. Biomed Pharmacother, 2020, 122(4): 109706.
[3] LILLO-MOYA J, ROJAS-SOLÉ C, MUÑOZ-SALAMANCA D, et al. Targeting ferroptosis against ischemia/reperfusion cardiac injury[J]. Antioxidants: Basel, 2021, 10(5): 667. doi: 10.3390/antiox10050667
[4] CORES Á, PIQUERO M, VILLACAMPA M, et al. NRF2 regulation processes as a source of potential drug targets against neurodegenerative diseases[J]. Biomolecules, 2020, 10(6): 904. doi: 10.3390/biom10060904
[5] LIU P, FENG Y, LI H, et al. Ferrostatin-1 alleviates lipopolysaccharide-induced acute lung injury via inhibiting ferroptosis[J]. Cell Mol Biol Lett, 2020, 25(4): 10.
[6] 古丽尼歌尔·阿布都米吉提, 沙依拜·沙比提, 丛媛媛, 等. 基于Nrf2通路探讨阿里红三萜酸减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用[J]. 中国病理生理杂志, 2021, 37(1): 112-118. doi: 10.3969/j.issn.1000-4718.2021.01.017 [7] VEENSTRA J P, VEMU B, TPCMO R, et al. Pharmacokinetic analysis of carnosic acid and carnosol in standardized rosemary extract and the effect on the disease activity index of DSS-induced colitis[J]. Nutrients, 2021, 13(3): 773. doi: 10.3390/nu13030773
[8] LI N, WANG W, JIANG W Y, et al. Cytosolic DNA-STING-NLRP3 axis is involved in murine acute lung injury induced by lipopolysaccharide[J]. Clin Transl Med, 2020, 10(11): e228.
[9] LI X, ZHANG Q, HOU N, et al. Carnosol as a Nrf2 activator improves endothelial barrier function through antioxidative mechanisms[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(4): 880. doi: 10.3390/ijms20040880
[10] FERNANDO S M, ROCHWERG B, SEELY A J E. Clinical implications of the third international consensus definitions for Sepsis and septic shock (Sepsis-3)[J]. CMAJ, 2018, 190(36): E1058-E1059. doi: 10.1503/cmaj.170149
[11] FAUST H, MANGALMURTI N S. Collateral damage: necroptosis in the development of lung injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2020, 318(2): L215-L225. doi: 10.1152/ajplung.00065.2019
[12] 曾文兰, 吴朝文. 杜仲黄酮对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用及机制[J]. 广东药学院学报, 2019, 35(6): 783-788. [13] MOU Y H, WANG J, WU J C, et al. Ferroptosis, a new form of cell death: opportunities and challenges in cancer[J]. J Hematol Oncol, 2019, 12(1): 34. doi: 10.1186/s13045-019-0720-y
[14] YUAN H, PRATTE J, GIARDINA C. Ferroptosis and its potential as a therapeutic target[J]. Biochem Pharmacol, 2021, 186(7): 114486.
[15] BOO Y C. Natural Nrf2 modulators for skin protection[J]. Antioxidants (Basel), 2020, 9(9): 812. doi: 10.3390/antiox9090812
[16] LOUSSOUARN M, KRIEGER-LISZKAY A, SVILAR L, et al. Carnosic acid and carnosol, two major antioxidants of rosemary, act through different mechanisms[J]. Plant Physiol, 2017, 175(3): 1381-1394. doi: 10.1104/pp.17.01183
[17] SHI W, XU G, ZHAN X, et al. Carnosol inhibits inflammasome activation by directly targeting HSP90 to treat inflammasome-mediated diseases[J]. Cell Death Dis, 2020, 11(4): 252. doi: 10.1038/s41419-020-2460-x
[18] LIN C, ZHANG X, SU Z, et al. Carnosol improved lifespan and healthspan by promoting antioxidant capacity in Caenorhabditis elegans[J]. Oxid Med Cell Longev, 2019, 2019: 5958043.
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期刊类型引用(5)
1. 洪玫，段宏宪，杨敏. 清肝化湿活血汤联合复方甘草酸苷片治疗酒精性肝病的临床疗效及对患者肝功能的影响. 医药论坛杂志. 2023(02): 87-89+93 . 
百度学术
2. 王箭焱. 舒肝宁注射液联合复方甘草酸苷对非酒精性脂肪性肝炎患者脂代谢、肝功能的影响. 中国医学创新. 2023(22): 45-48 . 百度学术
3. 陈凯，孟祥林. 多烯磷脂酰胆碱注射液对自身免疫性肝炎患者肝功能指标的影响. 中国药物与临床. 2023(10): 665-669 . 百度学术
4. 罗萍，蒋玲，刘杨武. 甘草酸制剂治疗病毒性肝炎的效果观察. 继续医学教育. 2022(04): 145-148 . 百度学术
5. 李斌，王磊. 舒肝消癖颗粒联合复方甘草酸苷片治疗非酒精性脂肪肝的临床效果及对肝功能的影响. 反射疗法与康复医学. 2022(07): 8-10 . 百度学术
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