Correlations between LncRNA CRNDE and prognosis, immune infiltration of papillary thyroid carcinoma
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摘要:目的 探讨LncRNA CRNDE和甲状腺乳头状癌（PTC）之间的关系。方法 采用T检验、Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon秩和检验和卡方检验评估临床病理特征与CRNDE表达的关系。受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）描述CRNDE对PTC的敏感性及特异性。Kaplan-Meier法和Cox回归分析评估影响PTC预后的因素；免疫浸润分析描述CRNDE与免疫细胞的相关性。结果 PTC中CRNDE表达增加，BRAF V600E突变与PTC中CRNDE高表达相关。ROC分析表明CRNDE具有显著诊断能力（AUC=0.839 7）。CRNDE高表达的总生存（OS）较差（P=0.012 6），且CRNDE表达与PTC患者的OS独立相关（HR=2.131；P=0.001 6）。CRNDE的表达与B细胞、CD8+T细胞及巨噬细胞的浸润水平呈正相关（P＜0.05），与CD4+T细胞的浸润水平呈负相关（P＜0.000 1）。结论 CRNDE的表达与PTC的生存率和免疫浸润显著相关，其可能是PTC中一种有前景的预后生物标志物。Abstract:Objective To investigate the relationship between LncRNA CRNDE and thyroid papillary carcinoma (PTC).Methods T-test, Kruskal-Wallis test, Wilcoxon rank-sum test and Chi-square test were used to evaluate the relationship between clinicopathological characteristics and CRNDE expression. The sensitivity and specificity of CRNDE to PTC were described by area under receiver operating characteristic (ROC) curve (AUC). Kaplan-Meier method and Cox regression analysis were used to evaluate factors that affect prognosis. The correlation between CRNDE and immune cells was described by immunoinfiltration analysis.Results CRNDE expression was increased in PTC, and BRAF V600E mutation was associated with high CRNDE expression in PTC. ROC analysis showed that CRNDE had significant diagnostic ability (AUC=0.839 7). The overall survival (OS) of high CRNDE expression was poor (P=0.012 6), and the expression of CRNDE was independently correlated with the overall survival (OS) of PTC patients (HR=2.131; P=0.001 6). The expression of CRNDE was positively correlated with the infiltration level of B cells, CD8+ T cells and macrophages (P < 0.05), and negatively correlated with the infiltration level of CD4+ T cells (P < 0.000 1).Conclusion The expression of CRNDE is significantly related to the survival rate and immune infiltration in PTC, and it may be a promising prognostic biomarker in PTC.
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Keywords:
- papillary thyroid carcinoma /
- CRNDE /
- prognosis /
- immune infiltration
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甲状腺癌是最常见的内分泌系统肿瘤[1], 受该病影响最严重的是中年妇女，其中约85%为甲状腺乳头状癌(PTC)[2-3]。PTC的分化良好，周边的侵犯性低，通过手术切除通常可以治愈，并且5年生存率超过95%[4]。但是, PTC有时会分化为更具侵袭性和致命性的甲状腺癌。另外，约30%的PTC患者中观察到复发[5]。因此，有必要对该疾病的分子特征进行进一步分析。目前，已经在大多数PTC病例中发现了高频率激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中编码效应子的基因的体细胞变化，这些基因在细胞凋亡中起重要作用[6]。目前，已鉴定出许多与PTC致癌相关的潜在生物标志物[包括金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、血小板衍生生长因子(PDGF)和上皮muctin-1(MUC-1)], 但有关其分子机制仍存在不确定性[7-9]。本研究通过公共数据库及本院甲状腺细针穿刺数据探索LncRNA CRNDE在PTC中的表达情况及其与预后及免疫浸润的关系。
1. 资料与方法
1.1 RNA测序数据和生物信息学分析
使用TCGA数据库，从395例甲状腺癌(THCA)项目(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/studied-cancers/thyroid)中收集PTC RNA序列(RNA-seq)数据和临床信息，其中58例有匹配的邻近组织。下载的数据格式为每百万千碱基(FPKM) 3级高通量测序片段，然后转换为每百万转录本(TPM)格式以供后续分析。同时下载了GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE60542数据集的33例PTC组织和29例癌旁组织，以及基因型-组织表达数据库(GTEx, https://gtexportal.org/home/eqtls/tissuetissueName=Thyroid)中653例正常甲状腺组织的TPM格式的RNA-seq数据。本研究中执行的所有程序均符合赫尔辛基宣言(2013年修订)。
1.2 样本CRNDE和BRAF V600E突变检测
标本来源: 选取2020年8月—2020年12月在本院内分泌科行甲状腺结节细针穿刺(FNA)的标本，按甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统(TBSRTC), 选取良性结节及PTC各40例。
CRNDE检测: 使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)提取总RNA并进行逆转录。在Applied Biosystems 7500进行实时定量聚合酶链式反应(qPCR), 使用2-△△Ct法计算相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达的mRNA表达。BRAF V600E突变检测: 检测采用qPCR检测人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒(艾得生物，中国厦门)。所有测量均根据标准方案进行。
1.3 免疫浸润分析
PTC的免疫浸润分析是通过来自R包ggstatsplot方法[10]进行的，描述了CRNDE与B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及髓样树突状细胞免疫评分之间的相关性。
1.4 统计分析
所有统计分析均使用R(v.4.0.3)进行。使用Wilcoxon秩和检验分析CRNDE在各数据集中的表达情况, t检验及卡方检验分析临床病理特征与CRNDE之间的关系。使用Kaplan-Meier方法计算TCGA患者的存活率。使用Cox比例风险模型进行单变量和多变量分析，以估计临床和遗传临床特征与总生存率(OS)之间的关联。Spearman分析CRNDE与免疫细胞评分之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 CRNDE在PCT中高表达
首先分析了CRNDE在TCGA泛癌中的表达，可以确认THCA数据集中有显著表达差异(P＜0.001, 图 1A)。CRNDE在58个PTC组织中表达水平为(2.062±0.942), CRNDE在58个配对癌旁组织中表达水平为(1.550±0.560), CRNDE在PTC中高表达，差异有统计学意义(P＜0.001, 图 1B)。同时还分析了TCGA中395个PTC组织及GTEx数据库中653个正常甲状腺组织中的CRNDE表达, CRNDE在PTC组织中显著高表达(P＜0.000 1, 图 1C)。受试者工作特征(ROC)曲线分析CRNDE表达水平，区分PTC与非肿瘤组织的有效性及敏感性, CRNDE的曲线下面积(AUC)为0.839 7(P＜0.000 1, 图 1D)。
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图 1 CRNDE在泛癌及PTC中的表达情况A: CRNDE在TCGA泛癌中的表达情况; B: CRNDE在PTC组织及配对癌旁组织中的表达水平; C: TCGA中PTC组织及GTEx中正常甲状腺组织中的CRNDE中的表达水平; D: CRNDE表达水平对PTC预测的ROC曲线分析。
ns: 无差异; *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001; ****P＜0.000 1。通过Wilcoxon秩和检验分析GEO数据库中GSE60542数据集中33例PTC组织及29例癌旁组织中CRNDE的表达，发现CREND在PTC中显著高表达(P=0.000 6, 图 2A)。非配对样本t检验对FNA数据分析显示, CRNDE在PTC组织中表达为(2.797±0.168), 在Ⅱ级分类良性结节中表达为(2.661±0.147), 差异有统计学意义(t=2.938, P=0.003 8, 图 2B)。Spearman相关性分析显示, CRNDE与BRAF V600E显著相关(r=0.714, P＜0.000 1, 图 2C)。
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图 2 GSE60542与FNA标本中CRNDE的表达情况A: GSE60542中PTC组织及癌旁组织中CRNDE的表达水平; B: FNA中CRNDE在PTC组织及良性结节中的表达水平; C: CRNDE与BRAF V600E的相关性分析。**P＜0.01, ***P＜0.001。2.2 CRNDE表达与PTC的临床病理特征的关系
从TCGA数据库收集了395个具有临床和基因表达数据的原发性PTC。根据CRNDE相对表达的平均值，将PTC患者分为高表达组(n=198)和低表达组(n=197), 评估CRNDE的表达水平与PTC患者临床病理特征之间的关联。卡方检验显示CRNDE表达与T分期、N分期、M分期、TNM分级无相关性(P＞0.05)。见表 1。
表 1 CRNDE表达与PTC的临床病理特征(x±s)病理特征 高表达组(n=198) 低表达组(n=197) 年龄/岁 45.7±16.3 48.5±15.6 女 135 151 T1及T2 123 111 N0 83 80 M0期 127 120 TNM Ⅰ级 119 104 2.3 CREND表达与PTC患者OS之间的关系
CREND的表达与PTC患者的OS呈正相关(P=0.012 6)。见图 3。
2.4 PTC预后因素的Cox单因素和多因素分析
Cox单因素回归模型中(图 4A)显示, CRNDE (P＜0.000 1)、年龄(P＜0.000 1)、T分期(P=0.000 7)、TNM分期(P＜0.000 1)与PTC预后相关。多因素分析进一步显示(图 4B), CRNDE(P=0.001 6)、年龄(P＜0.000 1)是PTC患者OS的独立预后因素。
2.5 CRNDE表达与免疫浸润的相关性
CRNDE的表达与B细胞、CD8+ T细胞及巨噬细胞的浸润水平呈正相关(P＜0.05, 图 5A、C、D), 与CD4+ T细胞的浸润水平呈负相关(P＜0.000 1, 图 5B)。
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图 5 CRNDE表达与免疫浸润的相关性A: CRNDE的表达与B细胞浸润水平的相关性; B: CRNDE的表达与CD4+ T细胞浸润水平的相关性; C: CRNDE的表达与CD8+ T细胞浸润水平的相关性; D: CRNDE的表达与巨噬细胞浸润水平的相关性。3. 讨论
PTC被认为是遗传背景和预后极为不同的癌症，特征是多种生物学行为，从轻微到极具侵略性，这些是由于癌症亚型的基因突变不同导致[11-13]。随着qPCR及高通量测序技术的成熟，大量的PTC基因数据呈现在公共数据库中。目前，研究[14]认为PTC的基因表达谱足够稳定，可用于诊断，即使癌细胞未超过肿瘤基质，也很容易检测到。
lncRNA可调节包括PTC在内的各种癌症的进展，促进癌细胞的增殖、侵袭、迁移和耐药[15]。体外实验[16]表明, CRNDE通过竞争性结合miR-384, 在PTC中促进细胞增殖、侵袭和迁移。本研究表明, lncRNA CRNDE在PTC中上调, CRNDE高表达与PTC患者较差的生存期相关。研究[17]认为, lncRNA CRNDE产生的有效危险因素评分能够评估PTC患者的预后，且将其分组后，高风险组的预后不佳，这与本研究结果相似。肿瘤浸润免疫细胞已被证明与PTC的肿瘤进展和预后相关[18]。研究[19]表明, T细胞和B细胞对甲状腺进行淋巴浸润的细胞免疫反应，以及导致特异性抗体产生体液免疫反应。本研究结果显示, CRNDE与B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞及巨噬细胞的浸润水平相关, CRNDE可能参与PTC发生的免疫反应，导致PTC患者预后不良。免疫反应参与PTC, 导致其预后不良的机制尚不明确，目前认为有以下几种可能: 先前存在的免疫炎性反应导致恶性肿瘤; 免疫围绕先前存在的肿瘤细胞，导致特定的免疫反应; 免疫耐受导致恶性肿瘤。本研究表明，在THCA中, CRNDE与患者的肿瘤分期无关。目前研究[1]显示, PTC中BRAF V600E突变等位基因的平均百分比为25.3%, 80.0%的肿瘤BRAF V600E呈阳性，本研究显示BRAF V600E突变样本中在CRNDE呈现高表达，提示CRNDE与BRAF V600E突变可能存在相关性，但目前大样本量的相关研究较少。
本研究基于TCGA数据库，验证样的GEO及实验样本为小样本资料; TCGA的主要目的不是获得全面的临床数据，一些重要的临床因素，如TMN分期及预后数据受到限制，故存在一定局限性，需要进一步的前瞻性临床试验来验证结果。Lnc CRNDE在PTC中的分子机制并未完全阐明，也仍需进一步验证。
综上所述, LncRNA CRNDE在PTC中高表达，与PTC的BRAF V600E突变、不良预后、免疫浸润存在相关性。LncRNA CRNDE可能是评估PTC的一种有前景的预后生物标志物。
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图 1 CRNDE在泛癌及PTC中的表达情况
A: CRNDE在TCGA泛癌中的表达情况; B: CRNDE在PTC组织及配对癌旁组织中的表达水平; C: TCGA中PTC组织及GTEx中正常甲状腺组织中的CRNDE中的表达水平; D: CRNDE表达水平对PTC预测的ROC曲线分析。
ns: 无差异; *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001; ****P＜0.000 1。![]()
图 2 GSE60542与FNA标本中CRNDE的表达情况
A: GSE60542中PTC组织及癌旁组织中CRNDE的表达水平; B: FNA中CRNDE在PTC组织及良性结节中的表达水平; C: CRNDE与BRAF V600E的相关性分析。**P＜0.01, ***P＜0.001。
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图 5 CRNDE表达与免疫浸润的相关性
A: CRNDE的表达与B细胞浸润水平的相关性; B: CRNDE的表达与CD4+ T细胞浸润水平的相关性; C: CRNDE的表达与CD8+ T细胞浸润水平的相关性; D: CRNDE的表达与巨噬细胞浸润水平的相关性。
表 1 CRNDE表达与PTC的临床病理特征(x±s)
病理特征 高表达组(n=198) 低表达组(n=197) 年龄/岁 45.7±16.3 48.5±15.6 女 135 151 T1及T2 123 111 N0 83 80 M0期 127 120 TNM Ⅰ级 119 104 
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