Value of miRNA-93 in early diagnosis of patients with type 2 diabetes mellitus complicated with acute myocardial infarction
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摘要:目的 探讨miRNA-93对2型糖尿病(T2DM)合并急性心肌梗死(AMI)患者的早期诊断价值。方法 本研究纳入2018年10月—2021年1月因胸痛在徐州医科大学附属宿迁医院心血管内科住院的T2DM患者147例，经冠状动脉造影后分为AMI组76例和非AMI组71例。收集患者一般临床资料、发病6 h内心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测患者发病6 h内血清miRNA-93表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，评估miRNA-93对T2DM合并AMI的早期诊断价值。采用多因素Logistic回归模型分析T2DM合并AMI患者的危险因素。结果 2组男性比率、吸烟史、高血压史、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、cTnI、miRNA-93比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。本研究结果显示, miRNA-93预测AMI的曲线下面积(AUC)为0.884, 高于cTnI的AUC 0.786, 差异有统计学意义(P < 0.05)。多因素Logistic回归分析显示, miRNA-93和吸烟史分别是AMI发生的独立危险因素(OR=3.285、1.864, P均 < 0.05)。结论 miRNA-93对T2DM合并AMI患者具有良好的早期诊断价值, miRNA-93是T2DM患者发生AMI的独立危险因素，可能参与T2DM患者AMI的病理生理过程。Abstract:Objective To investigate the value of miRNA-93 in early diagnosis of patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) complicated with acute myocardial infarction (AMI).Methods A total of 147 hospitalized T2DM patients with chest pain from October 2018 to January 2021 in Department of Cardiovascular Medicine in Suqian Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University were collected, and all the patients were divided into AMI group (n=76) and non-AMI group (n=71) after coronary angiography. The general clinical materials and the cardiac troponin I (cTnI) level within 6 h after onset were collected. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the serum expression level of miRNA-93 within 6 h after onset in patients. Receiver operator characteristic (ROC) curve was drawn to evaluate the value of miRNA-93 in the early diagnosis of T2DM complicated with AMI. Multivariate Logistic regression model was used to analyze the risk factors of T2DM patients complicated with AMI.Results There were significant differences in ratio of male cases, history of smoking, history of hypertension, low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), cTnI and miRNA-93 between the two groups (P < 0.05). The results showed that the area under the curve (AUC) of miRNA-93 in predicting AMI was 0.884, which was significantly higher than 0.786 of cTnI (P < 0.05). Multivariate Logistic regression analysis showed that miRNA-93 and history of smoking were the independent risk factors for AMI (OR=3.285, 1.864, P < 0.05).Conclusion The miRNA-93 has a good value in early diagnosis of T2DM patients complicated with AMI. As an independent risk factor for AMI in T2DM patients, miRNA-93 may be involved in the pathophysiological process of AMI in T2DM patients.
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2型糖尿病(T2DM)是最常见的内分泌代谢疾病，中国T2DM患病率已高达11.6%, 且发病率仍呈持续增高趋势[1]。T2DM已被证实是冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的影响因素[2]。急性心肌梗死(AMI)是CHD最危重的类型，患者病死率高，整体预后差。与非糖尿病患者相比, T2DM合并AMI患者的发病年龄较小，症状不典型，冠状动脉病变更加严重，预后更差。快速、准确地诊断AMI并予以有效的治疗对改善患者预后至关重要[3]。目前，心肌损伤标志物中以心肌肌钙蛋白(cTn)的敏感性和特异性最高，胸痛发作4~12 h即可在血清中检测到cTn水平升高，但在AMI发病的早期仍不够敏感; 同时, cTn在终末期肾功能衰竭、心力衰竭、快速心律失常等疾病患者中亦可升高[4—5]。因此，临床上迫切需要寻找一种在T2DM合并AMI时变化更早、敏感性和特异性更高的新型生物学标志物[6]。微小核糖核酸(miRNA)是非编码小分子RNA中的一种，研究[7—8]证实外周血中miRNA不仅存在稳定，而且随疾病类型改变和持续时间变化出现表达种类和表达量的改变。作者的前期研究[9]发现miRNA-93可以作为糖尿病视网膜病变的早期诊断标志物，表明miRNA-93参与AMI心肌损伤过程，可能在AMI发病早期即发生表达改变。本研究探讨miRNA-93在T2DM合并AMI患者中的表达水平，评估其在T2DM合并AMI中的早期诊断价值，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
本研究纳入2018年10月—2021年1月因胸痛在徐州医科大学附属宿迁医院心血管内科住院治疗的T2DM患者147例，所有患者均在发病6 h内到达医院，经冠状动脉造影后明确诊断为AMI, 分为AMI组76例和非AMI组71例(包括稳定型心绞痛、心力衰竭、主动脉夹层、反流性食管炎等)，年龄37~92岁，平均(56.7±11.1)岁。纳入标准: ①年龄≥18岁者; ②病历资料数据齐全者; ③签署知情同意书者。排除标准: ①严重的肝肾功能衰竭、恶性肿瘤、严重感染、合并自身免疫性疾病者; ②近期有冠状动脉溶栓、支架植入或搭桥病史者。本研究获得徐州医科大学附属宿迁医院伦理委员会审批。
参考中华医学会相关指南[10—11]的AMI诊断标准, cTn至少1次超过正常参考值上限，同时有急性心肌缺血的临床证据: ①急性心肌缺血症状; ②新的缺血性心电图改变; ③新发病理性Q波; ④新的存活心肌丢失或室壁节段运动异常的影像学证据; ⑤冠状动脉造影或腔内影像学检查证实冠状动脉血栓。T2DM的诊断标准参照中国2型糖尿病防治指南: ①具有典型糖尿病症状(口干、多饮、多尿、伴体质量下降)且随机静脉血糖≥11.1 mmol/L; ②空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L; ③口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果显示葡萄糖负荷后2 h血糖≥ 11.1 mmol/L。
1.2 研究方法
采用电化学发光仪(Beckmall Coulter, 美国)检测所有患者发病6 h内的心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌红蛋白(Mb)水平。采用全自动生化免疫分析仪测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。
1.3 血清miRNA-93检测
应用实时荧光定量PCR(qPCR)仪(ABI, 美国, 7500)自带分析软件检测所有入组患者发病6 h内血清miRNA-93水平。该qPCR为加尾法，以u6为内参，采用miRNeasy血清血浆纯化试剂盒(Qiagen, 德国，应用生物系统)进行小RNA提取，按试剂盒说明书(Qiagen, 德国)提取血浆总核糖核酸300 μL, 根据试剂盒说明书(Qiagen, 德国)合成cDNA。使用Premier Primer 5.0软件，根据GenBank和miRBase中公布的基因序列设计引物。设置3个复孔，记录每孔的CT值，以3个复孔的平均值作为最终结果。引物序列见表 1。
表 1 qPCR引物序列引物 序列 miRNA-93 正义: ACACTCCAGCTGGGCAAAGTGCTGTTCGT 反义: TGGTGTCGTGGAGTCG U6 正义: CTCGCTTCGGCAGCACA 反义: AACGCTTCACGAA TTTGCGT 1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行数据处理及分析。计数资料以构成比表示，组间比较采用χ2检验。正态分布的计量资料以平均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验; 采用多因素Logistic回归模型对有意义的单因素变量及传统危险因素进行分析。采用双侧检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组患者基线资料比较
2组男性比率、吸烟史、高血压史、LDL-C、cTnI、miRNA-93比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
表 2 2组患者临床资料比较(x±s)[n(%)]临床资料 AMI组(n=76) 非AMI组(n=71) 年龄/岁 59.12±10.24 57.89±9.48 男 47(61.3) 35(49.2)* 体质量指数/(kg/m2) 25.24±3.24 24.83±2.39 吸烟史 30(38.6) 19(25.8)* 冠心病史 50(66.3) 44(61.9) 高血压史 51(67.1) 30(42.2)* TG/(mmol/L) 1.87±0.99 1.79±0.97 TC/(mmol/L) 4.66±1.12 4.37±0.96 HDL-C/(mmol/L) 1.05±0.25 0.99±0.23 LDL-C/(mmol/L) 3.96±0.60 3.17±0.67* cTnI/(ng/mL) 0.18±0.07 0.03±0.02** miRNA-93 5.95±2.39 4.48±1.41* AMI: 急性心肌梗死; TG: 甘油三酯; TC: 总胆固醇; HDL-C: 高密度脂蛋白胆固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇; cTnI: 心肌肌钙蛋白I。与AMI组相比, *P < 0.05, **P < 0.01。 2.2 MiRNA-93对AMI的早期诊断价值
应用受试者工作特征(ROC)曲线分析miRNA-93、cTnI对AMI的早期诊断价值，结果显示, miRNA-93预测AMI的曲线下面积(AUC)为0.884，高于cTnI的AUC 0.786, 差异有统计学意义(P < 0.05), 提示miRNA-93具有良好的敏感性和特异性。见表 3。
表 3 MiRNA-93、cTnI对AMI的诊断价值指标 AUC 95%CI 标准误 敏感度/% 特异度/% miRNA-93 0.884 0.918~0.945 0.031 92.0 82.5 cTnI 0.786 0.689~0.899 0.034 88.0 76.0 2.3 AMI发生的危险因素
以是否发生AMI为因变量，以性别、吸烟史、高血压病史及LDL-C为自变量，结果显示, miRNA-93和吸烟史分别是AMI发生的独立危险因素(OR=3.285、1.864, P均 < 0.05)。见表 4。
表 4 AMI发生的危险因素的Logistic回归分析变量 回归系数 标准误 P OR 95%CI miRNA-93 1.197 0.293 < 0.01 3.285 1.869~5.721 吸烟史 1.547 0.345 < 0.01 1.864 1.254~2.851 高血压史 0.805 0.304 0.120 1.722 1.024~3.564 LDL-C 0.594 0.398 0.262 1.538 0.858~3.134 LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇。 3. 讨论
心血管事件是T2DM患者最重要的终点事件，也是T2DM患者死亡的最常见原因，其中AMI的死亡率最高[12]。合并T2DM的AMI患者或可合并其他多种糖尿病慢性并发症，其发病早期可能出现症状不典型，甚至无痛性AMI, 且cTnI也可能因其他合并症导致敏感性和特异性下降，对T2DM合并AMI患者的早期精准诊断提出了挑战，临床上急需一种在T2DM患者AMI发病时变化更快、敏感性和特异性更高的新型生物学标志物。MiRNA因其独特的表达方式和代谢特点，已成为多种疾病早期诊断的生物标志物，作者的前期研究[13]发现miRNA-93可以作为糖尿病视网膜病变(DR)的早期诊断标志物，表明miRNA-93参与AMI的发病过程。本研究发现T2DM患者中，合并AMI的患者miRNA-93表达显著高于非AMI患者; ROC曲线显示，与cTnI相比, miRNA-93对T2DM合并AMI患者具有良好的早期诊断价值; 多因素Logistic回归分析显示, miRNA-93是T2DM发生AMI的独立危险因素。
近年来研究[14]发现, miRNA参与了生物体内复杂的生理过程，并与多种人类疾病如糖尿病、心血管疾病和癌症等密切相关。MiRNA是非编码小分子RNA中的一种，其长度约为22个核苷酸，通过促进靶基因的降解或者抑制翻译，在转录后水平对基因的表达进行调控。研究[15]已经证实，外周血中miRNA不但可以稳定存在，而且随疾病类型和持续时间而出现表达种类和表达量的改变; 同时, miRNA还表现出了极强的稳定性和抗降解能力，在多种疾病的早期诊断中展示出良好的潜力。AMI为CHD最危重的类型，若同时合并T2DM则死亡率明显升高，且由于临床表现的不典型，目前的诊断方法存在一定的局限性。目前，外周血miRNA在T2DM中的作用已有报道，另有研究者提出外周血miRNA可以作为CHD的诊断标志物，但研究结果并不一致，这可能是由于miRNA在不同类型CHD, 甚至发病不同时期的表达也不一致，例如稳定型和不稳定型心绞痛患者的miRNA表达谱就具有显著差异[16—17]。在T2DM合并AMI的早期诊断方面，尚无相关报道。
本课题组长期聚焦于miRNA对T2DM慢性并发症的早期诊断价值，前期研究发现miRNA-93可作为糖尿病性视网膜病变(DR)的早期诊断生物标志物。在人群研究中, ZHONG Z等[18]发现miRNA-93在AMI患者中表达同样呈上调表现，提示miRNA-93可能参与AMI发病; 在基础研究方面, LIU J W等[19]明确了miRNA-93参与了心肌损伤过程。SOHRABIFAR N等[20]进一步区分了冠心病患者中是否合并T2DM, 发现在冠心病合并T2DM患者中, miRNA-93的表达升高，提示miRNA-93可能共同参与了T2DM和冠心病的重要病理生理过程。本研究发现，与非AMI患者相比, AMI患者中血清miRNA-93水平明显升高，与cTn相比, miRNA-93对T2DM合并AMI患者具有更好的早期诊断价值。本研究进一步对发生AMI的危险因素行Logistic回归分析，发现miRNA-93是AMI发生的独立危险因素，提示miRNA-93可能促进了T2DM合并AMI患者重要的病理生理过程。
本研究尚存在一定的局限性: ①本项目为病例对照研究，有可能导致纳入人群的选择存在偏倚; ②由于受研究时间限制，本研究纳入的样本量较小，可能导致miRNA-93对T2DM合并AMI患者的早期诊断价值产生一定的差异，后续将扩大样本量并进行前瞻性的队列试验来进一步验证本研究结论。
综上所述，本研究发现在T2DM合并AMI患者中, miRNA-93可作为一个良好的早期诊断生物标志物，能够识别一些早期临床表现不典型患者，避免临床漏诊而导致不良后果。
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表 1 qPCR引物序列
引物 序列 miRNA-93 正义: ACACTCCAGCTGGGCAAAGTGCTGTTCGT 反义: TGGTGTCGTGGAGTCG U6 正义: CTCGCTTCGGCAGCACA 反义: AACGCTTCACGAA TTTGCGT 
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表 2 2组患者临床资料比较(x±s)[n(%)]
临床资料 AMI组(n=76) 非AMI组(n=71) 年龄/岁 59.12±10.24 57.89±9.48 男 47(61.3) 35(49.2)* 体质量指数/(kg/m2) 25.24±3.24 24.83±2.39 吸烟史 30(38.6) 19(25.8)* 冠心病史 50(66.3) 44(61.9) 高血压史 51(67.1) 30(42.2)* TG/(mmol/L) 1.87±0.99 1.79±0.97 TC/(mmol/L) 4.66±1.12 4.37±0.96 HDL-C/(mmol/L) 1.05±0.25 0.99±0.23 LDL-C/(mmol/L) 3.96±0.60 3.17±0.67* cTnI/(ng/mL) 0.18±0.07 0.03±0.02** miRNA-93 5.95±2.39 4.48±1.41* AMI: 急性心肌梗死; TG: 甘油三酯; TC: 总胆固醇; HDL-C: 高密度脂蛋白胆固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇; cTnI: 心肌肌钙蛋白I。与AMI组相比, *P < 0.05, **P < 0.01。
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表 3 MiRNA-93、cTnI对AMI的诊断价值
指标 AUC 95%CI 标准误 敏感度/% 特异度/% miRNA-93 0.884 0.918~0.945 0.031 92.0 82.5 cTnI 0.786 0.689~0.899 0.034 88.0 76.0
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表 4 AMI发生的危险因素的Logistic回归分析
变量 回归系数 标准误 P OR 95%CI miRNA-93 1.197 0.293 < 0.01 3.285 1.869~5.721 吸烟史 1.547 0.345 < 0.01 1.864 1.254~2.851 高血压史 0.805 0.304 0.120 1.722 1.024~3.564 LDL-C 0.594 0.398 0.262 1.538 0.858~3.134 LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇。
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1. 孙佩佩，马丽丽，丁露碟，张浙恩. 应激性高血糖比值与伴2型糖尿病的急性心肌梗死患者急诊PCI术后预后的关系. 心电与循环. 2024(06): 594-597 . 
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