Study on potential markers protein for diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection
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摘要:目的 比较结核分枝杆菌标准株与休眠株蛋白质组差异表达情况，探讨结核潜伏性感染相关的诊断标志物。方法 选取结核分枝杆菌标准株H37Rv和由标准株诱导的潜伏性感染菌株模型（休眠株）的样本，每个样本各培养3皿。对2组样本中的菌株进行裂解并抽提蛋白，进行同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）检测与分析，获得标准株与休眠菌株中相关蛋白质组的表达数据，并利用蛋白富集、信号通路分析等生物信息学技术将差异蛋白进行分类，进一步确定参与能量代谢通路的相关蛋白。结果 所检测的187个蛋白质中，64个蛋白质具有差异性表达，其中40个蛋白质表达上调，24个蛋白质表达下调。P9WPC9蛋白在休眠菌株与标准株中表达量比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论 P9WPC9蛋白主要参与细菌的能量代谢通路，可能成为结核潜伏性感染的潜在诊断标志物。
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关键词:
- 结核分枝杆菌 /
- 蛋白质组学 /
- 同位素标记相对和绝对定量 /
- 潜伏性感染 /
- 诊断标志物
Abstract:Objective To compare differential expression of proteome in standard Mycobacterium tuberculosis strains and dormant Mycobacterium tuberculosis strains so as to explore diagnostic markers related to latent Mycobacterium tuberculosis infection.Methods The samples of standard Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain and latent Mycobacterium tuberculosis infection strain induced by standard strain (dormant strains) were selected, and each sample was cultured for three dishes. The strains of two sets of samples were cracked and proteins were extracted, isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) detection and quantitative analysis was performed, expression data of related proteome in standard strains and dormant strains were obtained, and bioinformatics techniques such as protein enrichment and signal pathway analysis were used to classify the differential proteins and further identify the related proteins involved in the energy metabolism pathway.Results A total of 64 proteins were differently expressed in the 187 detected proteins, of which 40 proteins were up-regulated and 24 proteins were down-regulated. Differently expressed proteins were mainly related to bacterial energy metabolism. P9WPC9 expression had a significant difference between dormant strains and standard strains.Conclusion P9WPC9 protein is mainly involved in the energy metabolism pathway of bacteria and may be a potential diagnostic marker for tuberculosis latent infection. -
金黄色葡萄球菌(SA)在自然界中分布十分广泛，是医院感染和社区感染的重要病原菌之一[1-2]。SA感染常见于皮肤黏膜受损和免疫力低下的人群，能够引起皮肤软组织感染、血流感染、局部化脓性感染及全身多脏器感染等[3]。根据对苯唑西林敏感性的不同, SA可分为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)。近年来，随着临床抗菌药物的广泛应用, SA耐药菌株不断增加，给临床抗感染治疗带来了巨大挑战。因此，定期监测病原菌的流行情况及药物敏感试验结果，有助于临床合理选用抗菌药物，提高患者的治愈率。本研究分析中国人民解放军海军军医大学第一附属医院(下称本院)2016—2020年SA的临床分布特点及其对抗菌药物的耐药情况，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 菌株来源
SA菌株来源于2016年1月—2020年12月本院1 575例患者送检的各类临床样本，包括痰液、支气管肺泡灌洗液、血液、分泌物、中段尿、组织和脓液等。
1.2 仪器与试剂
菌株鉴定使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪(法国梅里埃公司)或microflex基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(德国布鲁克公司)。细菌药物敏感试验使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪及其配套的GP67药敏卡。
1.3 病原菌培养与鉴定
菌株的接种、培养、分离和鉴定严格按照《全国临床检验操作规程》[4]中不同样本的技术规范要求进行操作。
1.4 体外药物敏感试验
对培养出的所有病原菌进行体外药物敏感试验，结果分为敏感、中介和耐药。药物敏感试验结果按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100文件[5]标准进行判读，质控菌株为SA菌株ATCC25923、ATCC29213。
1.5 统计学分析
采用WHONET 5.6软件和SPSS软件对SA菌株的科室分布、样本来源和耐药情况进行统计学分析。
2. 结果
2.1 患者一般资料
1 575例患者中，男1 066例(67.7%), 女509例(32.3%); 年龄0~92岁，平均(55.2±22.1)岁; 61~80岁患者占比最高(612例，占38.9%)，其后依次为41~60岁患者(426例, 27.0%)、20~40岁患者(245例，占15.6%)、>80岁患者(162例，占10.3%)和 < 20岁患者(130例，占8.2%)。
2.2 菌株来源样本分析
送检样本中共分离出1 784株SA菌株，来源样本分析结果显示，痰液、支气管肺泡灌洗液等呼吸道样本中检出796株SA菌株(44.6%), 分泌物检出543株(30.4%), 血液检出100株(5.6%), 脓液检出78株(4.4%), 中段尿检出66株(3.7%)、组织检出41株(2.3%), 其他样本检出160株(9.0%), 见图 1。SA菌株主要来源于烧伤科(277株，占15.5%)、呼吸科(130株，占7.3%)、整形外科(106株，占5.9%)、急救ICU(99株，占5.5%)和儿科(84株，占4.7%), 见图 2。
2.3 不同年度菌株分布情况
1 575例患者送检样本中共分离出1 784株SA, 其中MRSA 926株，占51.9%。2016—2020年，随着年度的推移, MRSA占比呈缓慢下降又上升的趋势(2018年度占比最低)，各年度SA和MRSA的分布情况见图 3。
2.4 SA耐药情况分析
SA对青霉素的总体耐药率最高，达93.3%, 对利福平的总体耐药率仅4.1%, 对庆大霉素的总体耐药率为19.1%。2016—2020年, SA对苯唑西林的耐药率维持在50%左右，对四环素、环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率为29.2%~44.1%，对红霉素和克林霉素的耐药率为44.1%~62.4%, 未检出对替加环素、利奈唑胺和万古霉素耐药的菌株。SA对常见抗菌药物的总体耐药率及不同年度耐药率见表 1。
表 1 2016—2020年SA对常见抗菌药物的耐药率% 抗菌药物 总体 2016年 2017年 2018年 2019年 2020年 青霉素 93.3 94.4 94.5 92.4 94.4 90.6 苯唑西林 51.9 53.4 52.2 46.8 53.7 54.2 红霉素 58.7 58.4 61.7 53.4 62.4 57.4 克林霉素 53.0 44.1 56.9 49.2 59.0 54.8 庆大霉素 19.1 20.6 17.2 15.0 21.3 22.3 四环素 37.1 38.8 35.4 31.3 44.1 36.8 环丙沙星 38.5 40.9 39.5 31.6 41.9 39.4 左氧氟沙星 38.3 40.6 39.5 31.3 41.6 39.4 莫西沙星 35.5 36.9 35.2 29.2 39.0 38.4 利福平 4.1 7.2 4.5 3.9 4.5 0.3 替加环素 0 0 0 0 0 0 利奈唑胺 0 0 0 0 0 0 万古霉素 0 0 0 0 0 0 2.5 MRSA耐药情况分析
MRSA对常见抗菌药物的总体耐药率均高于SA。2016—2020年, MRSA对青霉素和苯唑西林的耐药率均为100.0%, 对庆大霉素的耐药率维持在30%左右，对四环素、环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率为50.6%~67.5%, 对红霉素和克林霉素的耐药率较高(>60%), 未发现对替加环素、利奈唑胺和万古霉素耐药的菌株。MRSA对抗菌药物的总体耐药率及不同年度耐药率见表 2。
表 2 2016—2020年MRSA对常见抗菌药物的耐药率% 抗菌药物 总体 2016年 2017年 2018年 2019年 2020年 青霉素 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 苯唑西林 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 红霉素 78.6 77.2 77.1 77.0 84.3 77.4 克林霉素 73.5 61.4 72.9 74.7 83.2 74.4 庆大霉素 33.0 33.9 27.1 29.8 38.7 36.9 四环素 56.8 57.9 55.5 52.2 67.0 50.6 环丙沙星 61.8 64.9 60.6 55.6 67.5 60.1 左氧氟沙星 61.6 64.3 60.6 55.6 67.0 60.1 莫西沙星 59.6 62.6 57.3 53.4 65.4 59.5 利福平 7.5 12.9 8.3 7.3 8.4 0 替加环素 0 0 0 0 0 0 利奈唑胺 0 0 0 0 0 0 万古霉素 0 0 0 0 0 0 3. 讨论
SA是一种致病力较强的革兰阳性菌，具有共生菌和致病菌的双重特性，在人鼻前庭、腋窝、腹股沟和胃肠道等部位均有定植[6-7], 可经皮肤伤口、汗腺、毛囊等多种途径进入体内，引起化脓性感染、食物中毒、烫伤样皮肤综合征等，严重者还可随血液循环至全身，导致血流感染[8]。MRSA是导致医院感染的一种重要病原菌，患者常因外置导管、应用广谱抗生素、透析、免疫抑制性疾病等而发生感染[9]，此外医务人员也能在一定程度上导致该菌的院内感染。
本研究结果显示, SA菌株检出率排名前3位的科室为烧伤科(15.5%)、呼吸科(7.3%)和整形外科(5.9%)。烧伤患者皮肤黏膜屏障受损，机体免疫功能受抑制，且创面大量渗液，为SA的侵入和生长繁殖提供了有利条件[10]。SA菌株分离率排名前3位的样本分别是痰液和支气管肺泡灌洗液等呼吸道样本(44.6%)、分泌物(30.4%)和血液(5.6%)。由此提示，SA主要引起呼吸道感染、皮肤软组织或伤口感染、血流感染等，其中呼吸道感染占总感染量近一半，提示临床应加强对呼吸道感染的控制。
自从1961年MRSA被首次分离以来, MRSA分离率(MRSA在SA中的占比)呈现不断上升趋势[11-12]。全国细菌耐药监测网(CARSS)2016—2020年数据均显示MRSA分离率呈逐步下降趋势，其中上海市的MRSA分离率每年均高于全国平均水平[13-14]。本研究结果显示, 2016—2020年，本院总体MRSA分离率高达51.9%, 随着年度的推移，本院MRSA分离率呈缓慢下降又上升的趋势，且本院各年度的MRSA分离率均高于全国MRSA分离率以及上海市MRSA分离率。分析原因，这可能与本院烧伤科收治的重症患者人数较多、抗菌药物使用种类及强度不同有关。此外，本院2018年度MRSA分离率降至最低，这可能与烧伤科2018年正逢成立60周年加强了创面管理、手卫生、消毒隔离等感染控制措施有关[15]。
本研究发现, 2016—2020年, SA菌株对青霉素的耐药率均持续高于90%, 对红霉素和克林霉素的耐药率持续高于40%, 对利福平的耐药率总体呈下降趋势，对庆大霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率呈现为先下降又上升的趋势，这可能与2018年MRSA分离率较低有关。本研究结果显示, MRSA菌株对各类抗菌药物的耐药率普遍高于SA, 但尚未发现对替加环素、利奈唑胺和万古霉素耐药的菌株。万古霉素是治疗MRSA感染的首选药物，但目前已有少量耐万古霉素金黄色葡萄球菌的报道[16], 因此临床医生应重视万古霉素的合理使用，根据药物敏感试验结果优先选用敏感药物，避免诱导耐万古霉素菌株的产生。
综上所述，本院SA菌株和MRSA菌株的检出率较高，医院管理者及医务工作者需引起充分重视。防治SA感染，不仅需要合理选用抗菌药物，还需要加强病房管理、手消毒和环境消毒等。
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表 2 质谱数据分析相关参数设置
酶切方式 漏切位点数 肽段最小长度氨基酸残基/个 肽段最大修饰数 First search一级母离子质量误差容忍度 Main search一级母离子质量误差容忍度 二级碎片离子的质量误差容忍度 Trypsin/P 2 7 2 20 ppm 5 ppm 0.02 Da 
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表 4 蛋白及相关通路信息
通路分类 蛋白名称 比例数值 上调及下调 变异系数 基因名称 蛋白长度 [J]Translation，ribosomal structure and biogenesis Q53538 4.752 5 Up 0.001 3677 rpsL 13.849 P9WHC7 2.422 Up 0.090 0083 rplA 24.756 P9WNU1 3.099 5 Up 0.065 0105 dnaN 42.113 P9WGD5 1.334 Up 0.029 2354 ssb 17.353 [T]Signal transduction mechanisms P9WHP5 1.33 Up 0.077 4436 Rv2744c 29.258 [M]Cell wall/membrane/envelope biogenesis P9WJC0 2.211 5 Up 0.000 6783 espK 73.909 [N]Cell motility P9WI01 1.463 Up 0.035 5434 PPE36 27.48 [U]Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport P9WGP1 1.847 5 Up 0.064 682 secD 60.266 [O]Posttranslational modification, protein turnover, chaperones P9WPD1 2.346 5 Up 0.033 8802 clpB 92.567 P9WPC9 2.197 5 Up 0.098 066 clpC1 93.551 P9WPB9 4.203 Up 0.021 4133 clpX 46.782 [C]Energy production and conversion P9WPV5 1.258 5 Up 0.058 4029 atpF 18.325 P9WK13 2.877 5 Up 0.050 5647 mdh 34.321 P9WIS7 1.619 Up 0.029 0303 dlaT 57.087 P9WP71 1.609 Up 0.093 8471 ctaD 63.672 O06159 1.212 5 Up 0.080 4124 bkdC 41.061 O53166 1.436 Up 0.091 922 acn 102.45 [G]Carbohydrate transport and metabolism P9WG25 1.349 Up 0.089 6961 tkt 75.588
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[1] 朱小红, 胡颖君. 肺结核潜伏期和活动期外周血miR-29a和IFN-γ水平变化[J]. 现代诊断与治疗, 2019, 30(2): 302-303. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XDZD201902062.htm [2] SANTOS-PEREIRA A, MAGALHES C, PMM ARAUJO, et al. Evolutionary Genetics of Mycobacterium tuberculosis and HIV-1: "The Tortoise and the Hare"[J]. Microorganisms, 2021, 9(1): 147. doi: 10.3390/microorganisms9010147
[3] LÓPEZ-AGUDELO V A, MENDUM T A, LAING E, et al. A systematic evaluation of Mycobacterium tuberculosis Genome-Scale Metabolic Networks[J]. PLoS Comput Biol, 2020, 16(6): e1007533. doi: 10.1371/journal.pcbi.1007533
[4] KANG W L, WANG G R, WU M Y, et al. Interferon-gamma release assay is not appropriate for the diagnosis of active tuberculosis in high-burden tuberculosis settings: a retrospective multicenter investigation[J]. Chin Med J: Engl, 2018, 131(3): 268-275. doi: 10.4103/0366-6999.223860
[5] 唐洁, 陈策, 查成, 等. 基于结核杆菌耐热抗原小分子多肽刺激人外周血T细胞产生TNF-α和IFN-γ鉴别肺结核和潜伏性结核感染[J]. 南方医科大学学报, 2017, 37(11): 1442-1447. doi: 10.3969/j.issn.1673-4254.2017.11.03 [6] XUAN W X, LU T T, WANG Z, et al. Diagnostic significance of Mycobacterium tuberculosis T-cell assays for active tuberculosis[J]. Chin Med J: Engl, 2017, 130(7): 811-816. doi: 10.4103/0366-6999.202738
[7] BOEHME C C, NABETA P, HENOSTROZA G, et al. Operational feasibility of using loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(6): 1936-1940. doi: 10.1128/JCM.02352-06
[8] TORNHEIM J A, INTINI E, GUPTA A, et al. Clinical features associated with linezolid resistance among multidrug resistant tuberculosis patients at a tertiary care hospital in Mumbai, India[J]. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis, 2020, 20: 100175. doi: 10.1016/j.jctube.2020.100175
[9] 陈晶, 张裕娴, 芮勇宇. γ干扰素释放试验在结核病诊断中的应用价值[J]. 中国感染与化疗杂志, 2020, 20(3): 255-258. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-KGHL202003004.htm [10] 张会强, 文政芳, 张冬杰, 等. IFN-γ及血清炎症因子水平变化与肺结核发病相关性及作用机制分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2019, 29(2): 184-187. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZHYY201902006.htm [11] 莫胜林, 黄小红, 覃锦玉, 等. 艾滋病合并肺结核与单纯肺结核临床特征及胸部CT差异性研究[J]. 中国CT和MRI杂志, 2021, 19(4): 64-67. doi: 10.3969/j.issn.1672-5131.2021.04.021 [12] 陆恩词, 朱颖蔚. 肺结核合并糖尿病患者T淋巴细胞亚群及红细胞免疫功能的变化及意义[J]. 中国老年学杂志, 2017, 37(3): 648-649. doi: 10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.055 -
期刊类型引用(4)
1. 胡婷婷，曹成瑛，赵文兴，王生元，何莹. 基于冠状动脉CT血管造影的血流储备分数对高原高海拔环境下冠心病的诊断价值. 现代生物医学进展. 2024(11): 2173-2176+2191 . 
百度学术
2. 徐磊，尹浩，黄飞，赵渊，和旭，何永福. 分析亚高原地区人群发生冠状动脉性心脏病的影响因素. 大医生. 2024(16): 99-102 . 百度学术
3. 赵志伟，邢志政，孙晨格，崔梁瑜，任聪，李玉坤，罗玮伯，吕诚，韩学杰，刘大胜. 高原地区冠心病的中医辨证与证素分布规律研究. 中医药导报. 2024(10): 96-102 . 百度学术
4. 刘斌，张敏，李显刚，林仁华，杨洁，张亮，何跃，王显昆，潘娅楠. 边疆少数民族彝族人群rs1333049单核苷酸多态性与冠心病的联系. 检验医学与临床. 2023(02): 160-165 . 百度学术
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