凝血酶抑制剂亭扎肝素对肺癌血管生成的抑制作用及分子机制研究

付文娜; 吴琼; 王慧莉

doi:10.7619/jcmp.20213753

凝血酶抑制剂亭扎肝素对肺癌血管生成的抑制作用及分子机制研究

1.
辽宁省盘锦辽油宝石花医院, 辽宁盘锦, 124010
2.
中国人民武装警察部队辽宁省总队大连支队勤务保障大队卫生队, 辽宁大连, 116011

基金项目:

辽宁省卫生健康科研基金项目 20200054

详细信息

中图分类号: R734.2;R730.5
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出版历程
- 收稿日期: 2021-09-15
- 网络出版日期: 2022-04-14
- 发布日期: 2022-04-14

Study on effect of thrombin inhibitor of tinzaparin in inhibiting angiogenesis of lung cancer and its molecular mechanism

1.
Liaoyou Baoshihua Hospital of Panjin in Liaoning Province, Panjin, Liaoning, 124010
2.
Health Team of Service Support Team of Dalian Detachment of Liaoning Provincial General Corps of Chinese Armed Police Force, Dalian, Liaoning, 116011

摘要

摘要:
目的探讨凝血酶抑制剂亭扎肝素对肺癌血管生成的抑制作用及分子机制。
方法使用不同浓度(10、20、50、100 U/L)亭扎肝素处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并分组，同时设置对照组(不加亭扎肝素)，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和Transwell实验分别检测各组细胞活力和细胞迁移情况。通过体外试管形成实验、网络形成试验和主动脉环试验进一步验证亭扎肝素的体外、体内抗血管生成作用，并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测HUVEC和HCC827细胞中对照组与20 U/L亭扎肝素组的凝血酶含量和血管内皮生长因子(VEGF)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)蛋白含量。通过HCC827异种移植物进一步验证亭扎肝素的抗肿瘤和抗血管生成作用，检测对照组与20 U/L亭扎肝素组的肿瘤质量、肿瘤体积。采用免疫组化方法检测肿瘤组织中Ki-67、CD31和血管内皮生长因子A(VEGFA)表达情况，并检测肿瘤组织中的凋亡细胞。
结果 CCK-8法和Tranwell实验发现, 20 U/L亭扎肝素可有效抑制HUVEC的细胞活力和细胞迁移。网络形成试验显示，相较于对照组, 20 U/L亭扎肝素可有效抑制HUVEC的管形成，差异有统计学意义(P < 0.05)。主动脉环测定结果显示，相较于对照组, 20 U/L亭扎肝素减少了血管生成，抑制了CAM模型中的新血管形成，差异有统计学意义(P < 0.01)。Western blot检测结果显示, HUVEC和HCC827细胞中, 20 U/L亭扎肝素组的凝血酶含量均低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.01); HCC827细胞中, 20 U/L亭扎肝素组的VEGF、p-Akt和Akt蛋白含量均低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。HCC827异种移植物验证结果显示, 20 U/L亭扎肝素组的肿瘤质量、肿瘤体积均小于对照组，差异有统计学意义(P < 0.01); 与对照组比较, 20 U/L亭扎肝素可抑制肿瘤增殖，促进肿瘤细胞凋亡，并抑制血管生成。
结论亭扎肝素可降低凝血酶的表达，抑制细胞增殖和血管生成，促进肺癌细胞凋亡，其抗血管生成作用与Akt及其下游信号通路的失活有关。
- 肺癌 /
- 血管生成 /
- 凝血酶抑制剂 /
- 亭扎肝素 /
- 细胞增殖 /
- 细胞凋亡 /
- 蛋白激酶B
Abstract:
Objective To explore the inhibitory effect of thrombin inhibitors of tinzaparin on lung cancer angiogenesis and the molecular mechanism.
Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVCE) were treated with different concentrations of tinzaparin (10, 20, 50 and 100 U/L) and were divided into different groups. At the same time, cells with no addition of tinzaparin were assigned as control group. Cell counting kit-8(CCK-8) and Transwell experiments were used to detect cell viability and migration rate, respectively. The anti-angiogenesis effects of tinzaparin in vivo were further verified by in vitro test vessel formation experiment, network formation experiment and aortic loop experiment. Western blot was used to detect the protein content of thrombin, vascular endothelial-derived growth factor (VEGF), phosphorylated protein kinase B (p-AKT) and protein kinase B (AKT) in HUVEC cells and HCC827 cells of the control group and the 20 U/L tinzaparin group. The tumor quality and tumor volume of the control group and the 20 U/L timzapheparin group were measured. The anti-tumor and anti-angiogenic effects of tinzaparin were further verified by HCC827 xenograft; the tumor quality and volume of the control group and the 20 U/L timzapheparin group were measured; immunohistochemical method was used to detect expressions of Ki-67, CD31 and vascular endothelial cell A(VEGFA), proliferation and markers Ki-67 and CD31; apoptotic cells were detected in tumor tissues.
Results CCK-8 and Tranwell migration test found that timzapheparin (20 U/L) effectively inhibited the viability and migration of HUVEC cells. Compared with the control group, timzapheparin(20 U/L) effectively inhibited the formation of vessels of HUVEC cells(P < 0.05). This aortic ring measurement also showed that timzapheparin treatment at concentration of 20 U/L significantly reduced angiogenesis and inhibited the formation of new blood vessels in the CAM model (P < 0.01). Western blot detection revealed that the thrombin content in HUVEC cells and HCC827 cells of the 20 U/L timzapheparin group was significantly lower than that in control group(P < 0.01). The protein content of VEGF, p-AKT and Akt in HCC827 cells of 20 U/L timzapheparin group were lower than that of the control group(P < 0.05 or P < 0.01). HCC827 xenograft test showed that the 20 U/L timzapheparin group had lower tumor quality and volume than the control group(P < 0.01); compared with the control group, 20 U/L timzapheparin inhibited tumor proliferation, promoted tumor cell apoptosis, and inhibited angiogenesis.
Conclusion Timzapheparin reduces the expression of thrombin, inhibits cell proliferation and angiogenesis, and promotes apoptosis of lung cancer cell, and its anti-angiogenesis effect is related to the inactivation of Akt and its downstream signaling pathways.
- lung cancer /
- angiogenesis /
- thrombin inhibitors /
- timzapheparin /
- cell proliferation /
- apoptosis /
- protein kinase B

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急性大面积缺血性脑梗死(AICI)是常见脑患者的生命健康具有较大危害。有报道^[2]指出，血小板的活化以及血管内皮的损伤与AICI的发病密切相关。CD62p与CD63主要由活化血小板表达，是评价血栓风险的标志物^[3]，随着临床研究的不断深入，其与脑梗死的发病机制受到更多重视，其动态表达可为临床工作者提供量化血小板功能的检测指标^[4]。本研究通过探讨血小板膜糖蛋白CD62p、CD63及血小板活化因子(PAF)表达水平与AICI患者预后的关系，为临床治疗提供数据参考，现报告如下。

1. 资料和方法

1.1 一般资料

选择从2019年2月—2020年6月在本院接受治疗的AICI患者200例为观察对象并纳入观察组，选取健康体检者50例为对照组。纳入标准: 患者均符合AICI的有关诊断标准; 经CT或MRI检查确诊者; 发病至入院时间 < 48 h, 且2周内未口服抗凝和抗血小板以及溶栓药物者; 患者已知情并签署同意书。排除标准: 有恶性肿瘤者; 有其他类别的心脑血管疾病者; 有血液疾病者; 存在精神疾病者。观察组男135例，女65例; 年龄52~68岁，平均(62.33±2.14)岁。观察组根据90 d内存活情况，分为死亡组(32例)和存活组(168例)。对照组男30例，女20例; 年龄51~66岁，平均(62.40±2.23)岁。观察组和对照组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院的伦理委员会备案。

1.2 方法

抽取各组患者空腹肘关节血5 mL, 乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，选择贝克曼库尔特公司生产的EPICSXL流式细胞仪和配套的试剂，分别检测CD62p及CD63水平。另取2 mL给予3 000 r/min离心15 min, 然后通过酶联免疫法检测PAF水平，试剂盒均购于深圳的晶美工程公司。本研究观察组采用常规治疗，根据患者具体情况采取溶栓、抗血小板、抗凝、降纤、血管介入等方法进行治疗。

观察组患者出院后第90天进行门诊或电话随访。采用改良Rankin量表(mRS) 进行评分。0分为完全无症状; 1分为有症状，但无明显功能障碍; 2分为轻度残疾; 3分为中度残疾，能独立行走; 4分为中重度残疾，生活需要他人帮助; 5分为重度残疾，生活完全依赖于他人; 6分为死亡。评分为0~2分为预后良好组, 3~6分为预后不良组。

1.3 观察指标

对比不同组患者CD62p、CD63及PAF水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料用(x±s)表示，组间比较采用t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 观察组与对照组患者血清CD62p、CD63及PAF水平比较

观察组患者CD62p、CD63及PAF水平均高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。

表 1 观察组与对照组血清CD62p、CD63及PAF水平比较(x±s)

组别	n	CD62p/%	CD63/%	PAF/(ng/mL)
观察组	200	12.73±2.35^*	14.58±2.82^*	108.84±15.33^*
对照组	50	5.36±1.30	6.50±1.58	62.83±15.29
PAF: 血小板活化因子。与对照组比较, * P < 0.05。

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2.2 死亡组与存活组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平比较

死亡组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平均高于存活组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。

表 2 死亡组与存活组血清CD62p、CD63及PAF水平比较(x±s)

组别	n	CD62p/%	CD63/%	PAF/(ng/mL)
存活组	168	10.26±3.18	12.58±2.27	87.23±13.29
死亡组	32	13.69±2.42^*	14.67±3.04^*	106.79±14.42^*
PAF: 血小板活化因子。与存活组比较, * P < 0.05。

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2.3 预后良好组与预后不良组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平比较

预后不良组脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平均高于预后良好组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。

表 3 预后良好组与预后不良组血清CD62p、CD63及PAF水平比较(x±s)

组别	n	CD62p/%	CD63/%	PAF/(ng/mL)
预后不良组	25	17.01±3.12^*	19.84±2.54^*	136.75±12.64^*
预后良好组	175	9.83±2.19	9.32±1.13	78.42±7.53
PAF: 血小板活化因子。与预后良好组比较, * P < 0.05。

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3. 讨论

临床上大面积AICI是由于脑部发生急性血管阻塞而导致血供中断的脑血管类疾病^[5]。报道^[6]指出，患者机体内的血小板活化以及血管内皮损伤可能参与了AICI。当发生血流状态变化或血管损伤等情况时，患者机体逐渐调节至血栓前的状态，甚至是形成血栓症状^[7], 这使得受损血管壁自主地暴露胶原，同时还会释放出凝血酶以及血小板的诱导因子，导致血小板不断黏附在血管壁上，从而产生形态改变及细胞内的生化反应，最终诱发了AICI^[8]。

本研究通过比较发现观察组患者血清CD62p、CD63及PAF水平均高于对照组，这提示CD62p、CD63及PAF可能参与了AICI的发生，提示血小板活化在ACI发生中发挥重要作用。分析原因, AICI患者机体内黏附型血小板能够连接相应的纤维蛋白原，并使得血小板发生聚集，致使动脉血栓产生，引起血管闭塞并导致梗死。而活化后的血小板释放出的有关活性物质能够对血管壁产生作用，促使机体的平滑肌细胞发生收缩，且血管痉挛，从而使血管闭塞的症状加重^[9]。而CD62p及CD63均属于血小板的膜糖蛋白，其中前者可在α颗粒膜表达，后者主要分布在处于静止状态的溶酶体膜中^[10]。在血小板发生活化后，α颗粒膜能融合血小板的有关胞浆膜，此时CD62p主要暴露在血小板的膜表层，而CD63能够脱颗粒表达于血小板的膜表层^[11], 这表明二者的高表达能够标志性地反映出血小板的活化以及血栓形成。PAF和机体内花生四烯酸的代谢联系紧密^[12-13], 可由血小板的内皮细胞、肥大细胞以及巨噬细胞共同参与，从而在机体变态反应或炎性反应中产生重要作用^[14-15], 同时还能参与AICI患者神经功能的修复，在生理状态下还可调节脑部的兴奋型递质的释放进而影响相关突触的可塑性。同时，本研究观察组存活者的CD62p、CD63及PAF水平均明显低于死亡者，预后不良脑梗死患者血清CD62p、CD63及PAF水平均明显高于预后良好脑梗死患者，提示CD62p、CD63及PAF水平与预后有关。CD62P、CD63及PAF为最具有特征性的血小板活化分子标志物，大量释放后会启动和扩大血栓形成，进而加重病情^[16], 临床上可针对上述指标实施重点监测，从而更好地评估AICI患者的临床治疗情况及预后。

综上所述, AICI患者的血小板膜糖蛋白CD62p、CD63及PAF动态表达水平升高，且这3项指标与患者的治疗及预后均呈负相关。

图 1 亭扎肝素对HUVEC增殖和迁移的影响

A: 各组HUVEC细胞迁移距离比较; B: 各组HUVEC细胞活力比较。与对照组比较, *P < 0.05; 与20 U/L亭扎肝素组比较, #P < 0.05; 与50 U/L亭扎肝素组比较, △P < 0.05。

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图 2 亭扎肝素对体外和体内血管生成的影响

A: 2组HUVEC管形成的网络形成试验结果(放大倍数400倍); B: 2组相对管型长度比较; C: 主动脉环测定HUVEC血管生成结果(放大倍数400倍); D: 2组HUVEC微血管数量比较; E: CAM模型中的新血管形成结果(放大倍数400倍); F: 2组CAM模型中微血管数量比较。与对照组比较, *P < 0.05, **P < 0.01。

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图 3 亭扎肝素抑制VEGF和AKT的激活

A、B: HUVEC凝血酶含量的Western blot检测结果; C~G: HCC827细胞中VEGF、凝血酶、p-Akt、Akt蛋白含量的Western blot检测结果。与对照组比较, *P < 0.05, **P < 0.01。

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图 4 亭扎肝素抑制HCC827异种移植物中的肿瘤生长和肿瘤血管生成

A: 2组小鼠肿瘤质量比较; B: 不同给药时间2组小鼠肿瘤体积比较; C: 2组小鼠肿瘤图; D: Ki-67、凋亡细胞(TUNEL方法)、CD31和VEGFA的免疫组化检测结果。与对照组比较, **P < 0.01。

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