Clinical study of electroacupuncture combined with supplemented Sangpiaoxiao Decoction in treatment of female overactive bladder
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摘要:目的 观察电针结合加味桑螵蛸汤治疗女性膀胱过度活动症(OAB)的临床疗效。方法 选取64例符合OAB诊断标准的患者为研究对象, 随机分为治疗组和对照组，每组32例。对照组采用口服酒石酸托特罗定片治疗，治疗组在对照组基础上加用电针穴位治疗及口服加味桑螵蛸汤，每周治疗3次，共治疗6周。比较治疗前和治疗3、6周后, 2组膀胱过度活动症评分(OABSS)、生活质量评估表(QOL)评定情况。比较2组治疗前、治疗6周后排尿日志，并进行中医疗效评价。结果 治疗3、6周后，治疗组OABSS、QOL评分均低于对照组，临床总有效率高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。治疗6周后，治疗组夜尿次数和急迫性尿失禁(UUI)次数少于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 电针结合加味桑螵蛸汤治疗女性OAB患者，可在一定程度上改善其临床症状及生活质量。Abstract:Objective To observe the clinical effect of electroacupuncture combined with supplemented Sangpiaoxiao Decoction in treatment of female overactive bladder (OAB).Methods Sixty-four patients who met OAB diagnostic criteria were selected as the study subjects, and randomly divided into treatment group and control group, with 32 cases in each group. The control group was treated with oral treatment of tolterodine tartrate tablets, and the treatment group was additionally treated with electric acupuncture point treatment and oral treatment of supplemented Sangpiaoxiao Decoction, the patients were treated three times a week for a total of 6 weeks. The overactive bladder symptom score (OABSS) and quality of life (QOL) score before treatment were compared with 3, 6 weeks after treatment in the two groups. The urination logs of the two groups were compared before treatment and 6 weeks after treatment, and the TCM efficacy was evaluated.Results After 3 and 6 weeks of treatment, OABSS and QOL scores in the treatment group were significantly lower, and the total clinical response rate was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). After 6 weeks of treatment, the nocturnal urination times and urge urinary incontinence (UUI) times in the treatment group were significantly less than those in the control group (P < 0.05).Conclusion Electroacupuncture combined with supplemented Sangpiaoxiao Decoction can improve the clinical symptoms and quality of life in female patients with OAB to certain extent.
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尿道致病性大肠杆菌(UPEC)是尿路感染最主要的致病菌，能够造成80%~90%的社区感染和30%~50%的医源性感染[1-2]。UPEC感染机制复杂，能够利用一系列毒力因子发挥致病性，常见的毒力因子有黏附素、铁摄取系统、细胞毒素以及毒力岛等。UPEC借助这些毒力因子黏附并定植于宿主细胞，在尿道及其他肠道外环境中存活繁殖，分泌细胞毒素损伤宿主细胞，导致尿道感染等多种肠道外感染[3-5]。此外, UPEC生物被膜形成能力在感染过程中也发挥着重要作用[6]。生物被膜是细菌黏附于介质表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等成分，包裹菌体形成的大量细菌聚集膜样物[7]。生物被膜是细菌为适应宿主内环境而采取的一种生存策略，能够阻断机体分泌的抗菌肽、抗生素以及免疫细胞对细菌的杀伤作用。生物被膜中也存在着一些抗生素灭活酶如β-内酰胺酶，从而增强了细菌的耐药性。了解UPEC临床分离株的生物被膜形成能力以及毒力基因分布情况，对于明确菌株致病力进而采取有效防控措施具有重要意义。本研究检测UPEC临床分离株的种系分型、毒力基因分布及生物被膜形成能力，并分析三者间的关联性，旨在为UPEC分子流行病学特点、致病机制的研究以及临床防控措施的制订提供参考。
1. 材料与方法
1.1 菌株来源
采集2019年10月—2020年11月扬州大学临床医学院收治的临床尿路感染患者的尿样进行细菌培养，对菌落计数>105 CFU/mL的样品再进行挑选，挑取疑似大肠杆菌的粉红色菌落进行质谱检测，经微生物及蛋白快速鉴定质谱仪(MALDI Biotyper)鉴定出UPEC分离株。
1.2 试剂与耗材
聚合酶链反应(PCR)预混液(2×Taq PCR Master Mix-Vazyme), 100 bp DNA标记物(100 bp DNA Marker-TakaRa), 西班牙琼脂糖(Biowest); 乙二胺四乙酸(EDTA)、结晶紫、麦康凯培养基、胰酶大豆肉汤(TSB)培养基、聚苯乙烯96孔板，购自上海国药集团化学试剂有限公司。
1.3 PCR引物
参考ZHAO L X等[8]研究设计，分别设计大肠杆菌种系分型和毒力基因检测引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，见表 1。
表 1 PCR扩增基因引物信息引物名称 引物序列(5′-3′) 片段大小/bp 目的基因 种系分型 chuA-F GACGAACCAACGGTCAGGAT 279 chuA chuA-R TGCCGCCAGTACCAAAGACA yjaA-F TGAAGTGTCAGGAGACGCTG 211 yjaA yjaA-R ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC TspE4.C2-F GAGTAATGTCGGGGCATTCA 152 TspE4.C2 TspE4.C2-R CGCGCCAACAAAGTATTACG 毒力基因 fimH-F TCGAGAACGGATAAGCCGTGG 508 fimH fimH-R GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA tonB-F AGCCGATTTCTGTCACGA 360 tonB tonB-R GATACTGCGGCTGATTAC ireA-F GATGACTCAGCCACGGGTAA 254 ireA ireA-R CCAGGACTCACCTCACGAAT fyuA-F TGATTAACCCCGCGACGGGAA 787 fyuA fyuA-R CGCAGTAGGCACGATGTTGTA cnf-F ATCTTATACTGGATGGGATCATCTTGG 1 105 cnf-1 cnf-R GCAGAACGACGTTCTTCATAAGTATC vat-F GTTGGTGGCAACAATCCT 549 vat vat-R ATACAGCTGAATGCCTTC hlyD-F CTCCGGTACGTGAAAAGGAC 904 hlyD hlyD-R GCCCTGATTACTGAAGCCTG ompR-F AAGGCTTCCAGGTTCGAA 441 ompR ompR-R TGACCAGTGCCTTCAGTA phoU-F GAGCAGCAGCTTTCTGAT 610 phoU phoU-R CTGCCAGCAGTTTATCGA 1.4 种系分型检测
利用多重PCR方法检测UPEC分离株的chuA、yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2, 根据三者的检测结果判定分离株的种系分型[9]。种系分型标准: chuA(+)、yjaA(+)和TspE4.C2(+/-)菌株属于B2型; chuA(+)、yjaA(-)和TspE4.C2(+/-)属于D型; chuA(-)、yjaA(+/-)和TspE4.C2(+)属于B1型; chuA(-)、yjaA(+/-)和TspE4.C2(-)属于A型。
1.5 毒力基因检测
利用PCR对UPEC分离株的9个毒力基因进行检测，引物序列见表 1。PCR反应体系: 2×Taq Mix PCR反应液12.5 μL, 0.2 mmol/L上下游引物各1 μL, 菌液模板2 μL, 最后补加灭菌超纯水至25 μL终体积，混匀后进行PCR扩增。PCR反应条件: 94 ℃预变性4 min; 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 25个循环; 72 ℃ 10 min。各取10 μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中90 V电压下电泳1 h, 于紫外光下观察结果。
1.6 生物被膜检测
参考JAVED S等[9]和夏乐[10]的结晶紫染色生物被膜检测方法，挑取各菌株单菌落至LB液体培养基过夜振荡培养，次日取100 μL母液加至10 mL LB液体培养基中，转速220转/min, 37 ℃温度下振摇培养至600 nm波长处光密度(OD)值约为0.2。于96孔培养板中每孔加入200 μL菌液，每株菌株重复3个样，放入37 ℃培养箱中静置培养48 h后，小心弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗掉浮游菌，自然风干，加入0.1%结晶紫染液室温染色30 min, PBS清洗自然风干后加入95%酒精200 μL脱色10 min, 脱色液用酶标仪测定595 nm处OD值。孔中加入200 μL培养基作为阴性对照。
生物被膜形成能力判定标准: 将阴性对照平均OD值加上其3倍的标准差定义为临界值ODc。以临界值ODc为基准，菌株生物被膜可以分成无形成能力(-)(OD值≤ODc)、弱形成能力(+)(OD值>ODc~2 ODc)、中等形成能力(++)(OD值>2 ODc~4 ODc)和强形成能力(+++)(OD值>4 ODc)。
2. 结果
2.1 UPEC的分离鉴定结果
采集182例有泌尿系统感染症状患者的尿样，取10 μL无菌涂布于麦康凯培养基中进行细菌培养, 24 h后进行细菌计数。结果显示, 61例患者尿样的细菌计数≥105 CFU/mL, 说明存在尿路细菌感染。挑取麦康凯培养基上疑似大肠杆菌的粉红色菌落进行质谱检测，经鉴定共获得42株UPEC分离株。
2.2 种系分型检测结果
按照大肠杆菌种系分型鉴定方法，利用PCR检测chuA、yiaA和TspE4.C2在UPEC分离株中的分布情况，根据3种基因的分布组合确定菌株的种系分型。结果显示, UPEC分离株种系分型以B2型为主(占40.5%), 其次为D型(占31.0%), 而B1型和A型分别占16.7%和11.9%, 见表 2。
表 2 42株UPEC分离株种系分型检测结果[n(%)]种系分型 UPEC分离株 chuA yiaA TSPE4.C2 A型 5(11.9) - +/- - B1型 7(16.7) - +/- + B2型 17(40.5) + + +/- D型 13(31.0) + - +/- n为菌株计数。 2.3 毒力基因检测结果
42株UPEC分离株的9种毒力基因检测结果显示, 92.9%的分离株携带Ⅰ型菌毛编码基因fimH基因，分别有90.5%、66.7%和76.2%的分离株携带tonB、ireA和fyuA基因; 在受检的3种毒素相关基因中，编码细胞坏死因子的cnf-1基因检出率最高(52.4%), 溶血素基因hlyD和空泡化毒素基因vat的检出率分别为21.4%和28.6%; 其余毒力基因ompR和phoU的检出率均低于30.0%。对42株UPEC分离株的毒力基因携带数量进行分析发现, 9株菌株携带6种以上毒力基因(其中4株菌株同时携带8种毒力基因), 5株菌株携带毒力基因数量少于3种，其余28株菌株携带的毒力基因数量为3~6种，表明所分离的UPEC菌株携带毒力基因数量普遍较多，提示临床分离株的致病性较强，见表 3。
表 3 42株UPEC分离株中毒力基因检出结果毒力基因 阳性 n 占比/% fimH 39 92.9 tonB 38 90.5 ireA 28 66.7 fyuA 32 76.2 cnf-1 22 52.4 vat 12 28.6 hlyD 9 21.4 ompR 11 26.2 phoU 8 19.0 n为菌株计数。 2.4 生物被膜检测结果
通过结晶紫染色法对UPEC生物被膜形成能力进行定量分析，测定OD595 nm值反映菌株生物被膜形成能力。结果显示，所有受检菌株均能生成生物被膜，其中生物被膜具有强形成能力(+++)的菌株有16株(占38.1%), 生物被膜具有中等形成能力(++)的菌株有15株(占35.7%), 生物被膜具有弱形成能力(+)的菌株有11株(占26.2%)。
2.5 生物被膜形成能力与种系分型之间的关系
进一步分析UPEC分离株生物被膜形成能力与其种系分型之间的关联发现，大多数B2型和D型菌株都具有强或中等生物被膜形成能力，而B1型和A型菌株主要表现为弱生物被膜形成能力，表明UPEC菌株的生物被膜形成能力与其种系分型存在一定关联，见表 4。
表 4 UPEC不同种系分型菌株的生物被膜形成分布情况生物被膜形成能力 种系分型 A型(n=5) B1型(n=7) B2型(n=17) D型(n=13) 强 0 0 11(64.7) 5(38.5) 中等 1(20.0) 2(28.6) 6(35.3) 6(46.2) 弱 4(80.0) 5(71.4) 0 2(15.3) 2.6 生物被膜形成与毒力基因型之间的关系
UPEC强生物被膜形成能力菌株所携带的毒力基因数量大多在5种以上，而弱生物被膜形成能力菌株所携带的毒力基因数量一般低于4种。强生物被膜形成能力菌株中fimH、tonB和ireA基因的检出率高于弱生物被膜形成能力菌，差异有统计学意义(P < 0.05), 提示这些毒力基因在生物被膜形成过程中发挥着重要作用，见图 1。
3. 讨论
UPEC引起的尿道感染是临床最常见的细菌性疾病之一，严重威胁患者健康。不同基因型、血清型以及毒力型的UPEC菌株分布广泛，造成复杂的临床病型，增加了防治难度。UPEC的致病作用很大程度上依赖于其携带的毒力因子，如黏附素、摄铁系统、外毒素和生物被膜等。这些毒力因子协助UPEC定植黏附、入侵宿主细胞，抵抗压力应激、免疫逃逸，造成组织细胞损伤，从而引发尿道感染[11]。及时有效的治疗对于控制尿道感染至关重要，但前提是充分了解UPEC临床菌株的生物学特征，如基因型、毒力基因分布和生物被膜形成能力等。
种系分型是肠道外大肠杆菌分子流行病学的重要特征，根据TspE4.C2、yjaA、chuA这3个基因的不同组合，可以将大肠杆菌分为A型、B1型、B2型和D型这4个种系分型。chuA编码外膜血红素受体，参与血红素转运; yjaA编码基因负责细胞对过氧化氢和酸应激反应; TspE4.C2编码脂肪酶酯酶。EWERS C等[12]和张德宝[13]分析不同来源的UPEC菌株种系分型发现, 61.5%和21.5%的菌株分别属于B2和D型。RODRIGUEZ-SIEK K E等[14]分离的200株UPEC中, 130株为B2型, 37株为D型。本研究42株UPEC分离株中, B2和D型分离株分别为17株和13株，合计占分离株总数的71.4%, 与国外报道[12, 14]结论一致，表明不同地区、不同来源的UPEC分离株的种系分型均以B2型和D型为主。
本研究检测了9种与UPEC致病性密切相关的毒力基因，这些毒力基因对UPEC在泌尿道的定植和感染中起着重要作用。检测结果显示，几乎所有UPEC分离株(90%以上)都携带黏附素基因fimH和摄铁相关基因tonB, 提示黏附定植和铁摄取在UPEC抵御尿液冲刷以及适应尿液贫铁内环境至关重要; 其他毒力基因如铁载体ireA(66.7%)、耶尔森毒力岛基因fyuA(76.2%)和毒素相关基因cnf-1(52.4%)的检出率也相对较高，表明UPEC临床分离株毒力基因分布较广，具有较强的致病性。
UPEC的生物被膜形成能力与其引发的尿道感染密切相关。UPEC形成生物被膜后可黏附于泌尿道上皮细胞或导尿管壁，在分泌的多糖基质、蛋白的保护下，抵御抗菌药物和免疫细胞的杀伤作用。本研究中所有受检菌株均能生成生物被膜，但形成能力强弱有所差异，其中大多数强生物被膜形成能力菌株属于B2型。强生物被膜形成能力菌株所携带的毒力基因数量多于弱生物被膜形成能力菌株，且fimH、tonB和ireA基因的检出率显著高于弱生物被膜形成能力菌株，提示这些毒力基因在生物被膜形成过程中发挥着重要作用。菌株的强生物被膜形成能力可能与其携带强毒力岛以及表达更多的毒力基因有关，如黏附素、表面亲水性蛋白、铁摄取复合物以及外毒素。另外, B2型菌株也是造成持续性尿路感染最常见的毒力克隆群，这可能与其具有较强的生物被膜形成能力有关。
综上所述, UPEC临床分离株生物被膜形成能力与其种系分型和毒力基因分布具有一定关联性，这可以为更好地理解生物被膜形成和开发针对性治疗方法提供参考。
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表 1 治疗前后2组患者OABSS比较(x±s)
分 组别 n 治疗前 治疗3周后 治疗6周后 对照组 32 10.32±0.64 8.12±1.31* 7.61±1.41 治疗组 32 10.75±0.88 7.32±1.84* 4.89±1.25**##△ 与治疗前比较, * P＜0.05, * * P＜0.01; 与治疗3周后比较, ##P＜0.01; 与对照组比较, △P＜0.05。 
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表 2 治疗前后2组患者排尿日志相关评分比较(x±s)
次 组别 n 夜尿次数 急迫性尿失禁次数 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗组 32 3.38±0.37 0.95±0.16*# 2.35±1.26 0.95±0.41*# 对照组 32 3.42±0.45 1.51±0.22* 2.40±1.33 1.34±0.62* 与治疗前比较, * P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05。
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表 3 治疗前后2组患者生活质量相关评分比较(x±s)
分 组别 n 治疗前 治疗3周后 治疗6周后 对照组 32 5.37±0.25 3.81±0.23* 3.25±0.47** 治疗组 32 5.41±0.13 3.43±0.11* 2.03±0.15**# 与治疗前比较, * P＜0.05, * * P＜0.01; 与对照组比较, #P＜0.05。
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表 4 治疗前后2组患者临床疗效比较[n(%)]
组别 时点 n 痊愈 显效 有效 无效 总有效 对照组 治疗3周后 32 7(21.88) 12(37.50) 5(15.63) 8(25.00) 24(75.00) 治疗6周后 32 11(34.38) 11(34.38) 5(15.63) 5(15.63) 27(84.38)# 治疗组 治疗3周后 32 10(31.25) 14(43.75) 2(6.25) 6(18.75) 26(81.25)* 治疗6周后 32 15(46.88) 9(28.13) 6(18.75) 2(6.25) 30 (93.75)*# 与对照组比较, * P＜0.05; 与治疗3周后比较, #P＜0.05。
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