长链非编码RNA01139靶向调控微小RNA-300对口腔鳞癌顺铂耐药细胞增殖、迁移和侵袭的影响

邓琳; 谢陆莉; 李鲲

doi:10.7619/jcmp.20214197

长链非编码RNA01139靶向调控微小RNA-300对口腔鳞癌顺铂耐药细胞增殖、迁移和侵袭的影响

四川省成都市龙泉驿区第一人民医院口腔科, 四川成都, 610100

详细信息

通讯作者:
李鲲, E-mail: 1745620905@qq.com

中图分类号: R739.8;R730.2
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出版历程
- 收稿日期: 2021-10-25
- 网络出版日期: 2022-03-28
- 发布日期: 2022-03-14

Effects of long non-coding RNA LINC01139 in regulating proliferation, migration and invasion of oral squamous cell carcinoma cisplatin-resistant cells by targeting microRNA-300

Department of Stomatology, the First People's Hospital of Longquanyi District of Chengdu in Sichuan Province, Chengdu, Sichuan, 610100

摘要

摘要:
目的探讨长链非编码RNA01139 (LINC01139)调控微小RNA-300(miR-300)对口腔鳞癌顺铂(DDP)耐药细胞(CAL-27/DDP)增殖、迁移和侵袭的影响。
方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CAL-27/DDP及其亲本细胞株CAL-27中LINC01139和miR-300的表达水平。将CAL-27/DDP分为DDP+si-NC组、DDP+si-LINC01139组、DDP+miR-NC组、DDP+miR-300组、DDP+si-LINC01139+ anti-miR-NC组、DDP+si-LINC01139+anti-miR-300组。采用噻唑兰(MTT)法检测细胞增殖抑制率; Transwell实验检测迁移和侵袭细胞数。采用双荧光素酶报告实验和qRT-PCR确定LINC01139与miR-300的靶向关系。
结果与CAL-27细胞比较, CAL-27/DDP中LINC01139的表达升高, miR-300的表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与DDP+si-NC组比较，DDP+si-LINC01139组CAL-27/DDP增殖抑制率升高，迁移和侵袭细胞数减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。与DDP+miR-NC组比较, DDP+miR-300组CAL-27/DDP增殖抑制率升高，迁移和侵袭细胞数减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。与DDP+si-LINC01139+anti-miR-NC组比较, DDP+si-LINC01139+ anti-miR-300组CAL-27/DDP增殖抑制率降低，迁移和侵袭细胞数增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论抑制LINC01139可通过上调miR-300抑制CAL-27/DDP的增殖、迁移和侵袭。
- 长链非编码RNA01139 /
- 微小RNA-300 /
- 口腔鳞癌顺铂耐药细胞 /
- 增殖 /
- 迁移 /
- 侵袭
Abstract:
Objective To investigate the effect of long intergenic non-coding RNA LINC01139 (LINC01139) in regulating the proliferation, migration and invasion of oral squamous cell carcinoma cisplatin(DDP)-resistant cells(CAL-27/DDP) by regulating microRNA-300 (miR-300).
Methods Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression levels of LINC01139 and miR-300 in CAL-27/DDP and its parental cell line CAL-27. CAL-27/DDP was divided into DDP+si-NC, DDP+si-LINC01139, DDP+miR-NC, DDP+miR-300, DDP+ si-LINC01139 +anti-miR-NC, DDP+si-LINC01139+anti-miR-300 groups. The methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the cell proliferation inhibition rate; Transwell assay was used to detect the number of migrating and invading cells. The dual luciferase reporting experiment and qRT-PCR were used to detect the targeting relationship between LINC01139 and miR-300.
Results Compared with CAL-27 cells, the expression of LINC01139 in CAL-27/DDP was increased, while the expression of miR-300 was decreased (P < 0.05). Compared with the DDP+si-NC group, the proliferation inhibition rate of CAL-27/DDP in the DDP+si-LINC01139 group was increased, and the migrating and invading cells were reduced (P < 0.05). Compared with the DDP+miR-NC group, the proliferation inhibition rate of CAL-27/DDP in the DDP+miR-300 group was increased, and the number of migrating and invading cells was reduced (P < 0.05). Compared with the DDP+ si-LINC01139+anti-miR-NC group, the proliferation inhibition rate of CAL-27/DDP in the DDP+si-LINC01139+anti-miR-300 group was decreased, the migrating and invading cells were increased (P < 0.05).
Conclusion Inhibition of LINC01139 inhibits the proliferation, migration and invasion of oral squamous cell carcinoma cisplatin-resistant cells by up-regulating miR-300.
- long non-coding RNA LINC01139 /
- microRNA-300 /
- oral squamous cell carcinoma cisplatin-resistant cells /
- proliferation /
- migration /
- invasion

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口腔鳞状细胞癌(OSCC)约占所有头颈部肿瘤的90%, 是全球重要的公共卫生问题^[1]。尽管包括外科手术、放化疗在内的治疗策略大大优化，但OSCC患者总体5年生存率仍低于60%^[2]。顺铂(DDP)化疗是晚期OSCC患者局部治疗的重要组成部分，可显著提高生存率，但70%~80%的复发患者表现出对DDP的耐药性^[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类内源性非编码RNA, 通过在表观遗传、转录前、转录后水平调控基因表达多种细胞过程中发挥作用。目前，多种lncRNA已被证实可通过抑制细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡增加DDP耐药细胞系对DDP的敏感性^[4-5]。长链非编码RNA01139(LINC01139)是一种肿瘤相关lncRNA, 肝癌中LINC01139表达上调，敲减LINC01139可抑制肝癌细胞恶性生物学行为^[6]。生物信息学分析发现, LINC01139可能与微小RNA-300(miR-300)存在相互作用。研究^[7]证实, miR-300-5p高表达可降低卵巢癌细胞的DDP耐药性，但LINC01139是否通过靶向调控miR-300表达影响OSCC细胞的DDP耐药性尚未可知。本研究探讨LINC01139、miR-300对DDP耐药OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及分子机制，以期为OSCC化疗提供有效靶点。

1. 材料与方法

1.1 实验材料

CAL-27细胞购于美国模式培养物保藏中心; DDP(纯度≥99.9%)、噻唑蓝(MTT)试剂盒购于美国Sigma公司; LINC01139小干扰RNA(si-LINC01139) 及其阴性对照(si-NC)、LINC01139过表达载体(pcDNA-LINC01139)、质粒空载体(pcDNA)、miR-300模拟物(miR-300 mimics)及其阴性对照(miR-NC)、miR-300抑制物(anti-miR-300)及其阴性对照(anti-miR-NC)和聚合酶链反应(PCR)引物均由上海吉玛制药公司提供; Lipofectamine^TM 2000购自美国Invitrogen公司; Transwell小室、基质胶购于美国BD公司; 兔源细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体以及山羊抗兔二抗购于上海艾博抗公司。

1.2 细胞培养、药物处理

参照文献[8]建立口腔鳞癌DDP耐药细胞株(CAL-27/DDP)。将对数期CAL-27细胞、CAL-27/DDP分别接种96孔板，当细胞贴壁后，分别加入终浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL的DDP并干预处理48 h, 采用MTT实验检测细胞增殖抑制率。

1.3 实验分组

将对数期CAL-27/DDP分为DDP+si-NC(转染si-NC)组、DDP+si-LINC01139(转染si-LINC01139)组、DDP+miR-NC(转染miR-NC)组、DDP+miR-300(转染miR-300 mimics)组、DDP+ si-LINC01139+anti-miR-NC(转染si-LINC01139和anti-miR-NC)组、DDP+si-LINC01139+anti-miR-300组(转染si-LINC01139和anti-miR-300)。以上各组在转染后均采用0.25 μg/mL的DDP干预处理48 h。将pcDNA-LINC01139、pcDNA、si-LINC01139、si-NC转染至细胞中，记为pcDNA-LINC01139组、pcDNA组、si-LINC01139组、si-NC组，使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-300表达情况。细胞转染参照脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 2000说明书进行。

1.4 qRT-PCR检测LINC01139和miR-300表达

收集CAL-27细胞和各组CAL-27/DDP, 以Trizol法提取细胞总RNA, 采用逆转录试剂盒合成cDNA, 采用SYBR Green Mix试剂进行qRT-PCR反应^[9]。采用2^-△△Ct法检测LINC01139和miR-300表达水平。

1.5 MTT法检测细胞增殖抑制率

收集各组CAL-27/DDP细胞，按照1×10⁴个/孔接种到96孔板, 24 h后每孔加入20 μL的MTT试剂，培养箱孵育4 h, 弃去上清液，加入150 μL的DMSO, 振荡10 min溶解后，酶标仪测定490 nm波长处的光密度(OD)值^[10-11]。

1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移: 收集各组CAL-27/DDP细胞，采用无血清DMEM将培养基调整为5×10⁴个/mL的单细胞悬液。取200 μL细胞悬液、500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基分别加入Transwell上室、24孔板下室。细胞培养箱孵育24 h, 棉拭子擦去上室内未穿膜细胞，甲醇固定20 min, 结晶紫染色10 min, 倒置随机选择5个视野计数、拍照，取均值^[12-13]。细胞侵袭: 采用均匀包被基质胶的Transwell小室，实验前30 min水化后备用。

1.7 Western blot检测CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表达

细胞裂解缓冲液提取各组CAL-27/DDP总蛋白, Nanodrop 2000测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯膜。将膜置于5%的脱脂牛奶中封闭后，稀释的一抗溶液室温孵育膜2 h, 稀释的二抗溶液室温孵育膜2 h, 增强型化学发光显色试剂盒暗室显色。目的蛋白表达水平采用灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示。

1.8 双荧光素酶报告基因实验

将野生型/突变型(WT/MUT)LINC01139序列连接到PmirGLO双荧光素酶表达载体以构建WT/MUT-LINC01139, 该步骤由北京华大基因公司完成。利用Lipofectamine 2000将WT-LINC01139、MUT-LINC01139分别与miR-300(miR-300 mimics)、miR-NC共转染至CAL-27/DDP, 转染48 h收集细胞，根据双荧光素酶检测试剂盒进行荧光素酶活性测定。同时将pcDNA、pcDNA-LINC01139、si-NC、si-LINC01139分别转染CAL-27/DDP, 48 h后测定各组细胞miR-300表达水平。

1.9 统计学分析

每组设置3个平行实验，重复3次，所有数据均以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0软件进行统计分析, 2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组内两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 DDP对CAL-27细胞和CAL-27/DDP增殖抑制率的影响

与CAL-27比较，同一DDP浓度对CAL-27/DDP的抑制率较低, CAL-27/DDP的IC₅₀值升高，差异有统计学意义(P＜0.05), 见表 1。

表 1 顺铂对CAL-27细胞和CAL-27/DDP增殖抑制率的影响(x±s)

细胞	DDP浓度							IC₅₀/(μg/mL)
细胞	0.125 μg/mL	0.25 μg/mL	0.5 μg/mL	1 μg/mL	2 μg/mL	4 μg/mL	8 μg/mL	IC₅₀/(μg/mL)
CAL-27(n=9)	11.32±1.14	22.45±2.27	34.62±3.55	45.86±4.31	59.33±5.12	73.21±7.56	86.22±8.13	1.17±0.19
CAL-27/DDP(n=9)	3.41±0.35^*	7.11±0.72^*	13.24±1.25^*	19.83±1.74^*	31.02±3.17^*	39.65±3.88^*	53.14±5.28^*	6.65±0.51^*
CAL-27: 口腔鳞癌细胞; CAL-27/DDP: 口腔鳞癌顺铂耐药细胞; DDP: 顺铂。与CAL-27细胞比较, * P＜0.05。

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2.2 CAL-27、CAL-27/DDP中LINC01139和miR-300的表达

与CAL-27比较, CAL-27/DDP中LINC01139的表达升高, miR-300的表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05), 见表 2。

表 2 LINC01139和miR-300在CAL-27细胞和CAL-27/DDP细胞中的表达(x±s)

细胞	LINC01139	miR-300
CAL-27(n=9)	1.00±0.06	1.00±0.05
CAL-27/DDP(n=9)	2.93±0.27^*	0.34±0.03^*
LINC01139: 长链非编码RNA01139; miR-300: 微小RNA-300; CAL-27: 口腔鳞癌细胞; CAL-27/DDP: 口腔鳞癌顺铂耐药细胞。与CAL-27细胞比较, * P＜0.05。

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2.3 抑制LINC01139表达联合DDP(0.25 μg/mL)对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与DDP+si-NC组比较, DDP+si-LINC01139组CAL-27/DDP中LINC01139表达降低，增殖抑制率和p21蛋白表达升高，迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05), 见表 3、图 1。

表 3 抑制LINC01139表达联合DDP对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响(x±s)

组别	LINC01139	抑制率/%	迁移细胞数/个	侵袭细胞数/个	CyclinD1蛋白	p21蛋白	MMP-2蛋白	MMP-9蛋白
DDP+si-NC组(n=9)	1.00±0.08	6.41±0.63	105.23±10.22	88.14±8.42	0.61±0.06	0.33±0.03	0.72±0.07	0.66±0.06
DDP+si-LINC01139组(n=9)	0.51±0.05^*	42.15±4.13^*	56.39±5.21^*	41.65±4.55^*	0.20±0.02^*	0.79±0.07^*	0.30±0.03^*	0.27±0.03^*
LINC01139: 长链非编码RNA01139; CyclinD1: 兔源细胞周期素D1; MMP-2: 基质金属蛋白酶-2; MMP-9: 基质金属蛋白酶-9。与DDP+si-NC组比较, * P＜0.05。

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图 1 增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

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2.4 miR-300过表达联合DDP(0.25 μg/mL)对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与DDP+miR-NC组比较, DDP+miR-300组CAL-27/DDP中miR-300表达显著升高，增殖抑制率和p21蛋白表达升高，迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05), 见表 4和图 2。

表 4 miR-300过表达联合DDP对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响(x±s)

组别	miR-300	抑制率/%	迁移细胞数/个	侵袭细胞数/个	CyclinD1蛋白	p21蛋白	MMP-2蛋白	MMP-9蛋白
DDP+miR-NC组(n=9)	1.00±0.06	7.12±0.77	101.25±9.84	86.14±8.63	0.63±0.06	0.32±0.03	0.71±0.07	0.68±0.06
DDP+miR-300组(n=9)	2.57±0.24^*	35.48±3.55^*	60.55±6.31^*	53.47±5.33^*	0.28±0.03^*	0.75±0.07^*	0.37±0.03^*	0.30±0.03^*
miR-300: 微小RNA-300; CyclinD1: 兔源细胞周期素D1; MMP-2: 基质金属蛋白酶-2; MMP-9: 基质金属蛋白酶-9。与DDP+miR-NC组比较, * P＜0.05。

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图 2 增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

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2.5 LINC01139靶向调控miR-300的表达

靶基因预测工具LncBase Predicted v. 2分析显示, LINC01139与miR-300存在特异性结合的核苷酸序列，见图 3。miR-300 mimics和WT-LINC01139共转染CAL-27/DDP细胞荧光素酶活性较miR-NC和WT-LINC01139共转染细胞降低，差异有统计学意义(P＜0.05); miR-300 mimics和MUT-LINC01139共转染CAL-27/DDP细胞荧光素酶活性与miR-NC和MUT-LINC01139共转染细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表 5。pcDNA-LINC01139组CAL-27/DDP细胞miR-300表达较pcDNA组降低, si-LINC01139组CAL-27/DDP细胞miR-300表达较si-NC组升高，差异有统计学意义(P＜0.05), 见表 6。

图 3 LINC01139序列中含有与miR-300互补的核苷酸序列

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表 5 双荧光素酶报告实验(x±s)

组别	WT-LINC01139	MUT-LINC01139
miR-NC组(n=9)	1.00±0.06	1.02±0.08
miR-300组(n=9)	0.57±0.05^*	0.99±0.07
与miR-NC组比较, * P＜0.05。

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表 6 LINC01139调控miR-300的表达(x±s)

组别	miR-300
pcDNA组(n=9)	1.00±0.07
pcDNA-LINC01139组(n=9)	0.53±0.05^*
si-NC组(n=9)	1.02±0.06
si-LINC01139组(n=9)	2.68±0.27^#
F	381.236
P	＜0.001
与pcDNA组比较, * P＜0.05; 与si-NC组比较, #P＜0.05。

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2.6 干扰miR-300表达逆转了抑制LINC01139表达对CAL-27/DDP细胞DDP耐药性的作用

与DDP+si-NC组比较, DDP+si-LINC01139组CAL-27/DDP中miR-300表达显著升高，增殖抑制率、p21蛋白表达显著升高，迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低; 与DDP+si-LINC01139+anti-miR-NC组比较, DDP+si-LINC01139 +anti-miR-300组CAL-27/DDP中miR-300表达显著降低，增殖抑制率、p21蛋白表达显著降低，迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著升高(P＜0.05)。见表 7和图 4。

表 7 干扰miR-300表达逆转了抑制LINC01139表达对CAL-27/DDP细胞DDP耐药性的作用(x±s)

组别	miR-300	抑制率/%	迁移细胞数/个	侵袭细胞数/个	CyclinD1蛋白	p21蛋白	MMP-2蛋白	MMP-9蛋白
DDP+si-NC组(n=9)	1.00±0.08	7.06±0.71	106.24±9.56	85.14±8.36	0.62±0.06	0.31±0.03	0.73±0.07	0.67±0.06
DDP+si-LINC01139组(n=9)	2.84±0.27^*	43.25±4.31^*	57.14±5.33^*	43.51±4.33^*	0.22±0.03^*	0.77±0.07^*	0.33±0.03^*	0.29±0.03^*
DDP+si-LINC01139+anti-miR-NC组(n=9)	2.86±0.28	44.69±4.52	55.86±5.52	42.69±4.74	0.21±0.02	0.78±0.06	0.32±0.03	0.28±0.02
DDP+si-LINC01139+anti-miR-300组(n=9)	1.53±0.15^#	21.36±2.54^#	83.47±8.35^#	69.71±6.33^#	0.51±0.05^#	0.40±0.04^#	0.64±0.06^#	0.56±0.05^#
miR-300: 微小RNA-300; CyclinD1: 兔源细胞周期素D1; MMP-2: 基质金属蛋白酶-2; MMP-9: 基质金属蛋白酶-9。与DDP+si-NC组比较, * P＜0.05; 与DDP+si-LINC01139+anti-miR-NC组比较, #P＜0.05。

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图 4 4组增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

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3. 讨论

近年来研究^[15]发现, lncRNA在OSCC耐药过程中起着重要的作用。lncRNA浆细胞瘤转化迁移基因1( PVT1 )在DDP耐药组织和细胞系中经常被上调，并且与较差的总体生存密切相关。在DDP耐药OSCC细胞中同源框基因11反义RNA( HOXA11-AS )亦表达上调，敲减 HOXA11-AS 能够降低DDP耐药OSCC细胞的增殖，增加DDP诱导的细胞毒性，抑制小鼠移植瘤的生长，为改善OSCC化疗提供了潜在靶点^[16]。干扰HOX转录反义RNA(HOTAIR)表达可抑制OSCC细胞自噬，促进细胞凋亡，增加对DDP的敏感性^[17]。本研究发现, OSCC的DDP耐药细胞株CAL-27/DDP中LINC01139表达升高，提示LINC01139异常表达可能与OSCC DDP耐药有关。功能分析发现，抑制LINC01139表达可降低CAL-27/DDP的增殖、迁移和侵袭能力。p21是细胞周期的负调控因子，通过与CyclinD1、细胞周期依赖性激酶(CDKs)、CyclinD1/CDKs复合物结合导致细胞周期阻滞，阻断细胞增殖过程^[18]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成员，几乎能够降解细胞外基质中所有蛋白成分，改变细胞间黏附，破坏肿瘤细胞侵袭转移的组织学屏障^[19]。本研究发现，抑制LINC01139表达后CAL-27/DDP中CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平降低, p21表达水平升高，提示LINC01139在CAL-27/DDP增殖、迁移和侵袭中发挥促进作用。

lncRNA与miRNA的相互作用是调控肿瘤生物学功能的重要机制^[20-21]。本研究发现miR-300为LINC01139下游候选靶点。miR-300的异常表达已被报道参与OSCC的发生和发展, OSCC患者miR-300水平降低，过表达miR-300可抑制OSCC细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化过程^[22]。miR-300通过靶向淋巴样增强子结合因子1调节肝细胞癌的生长和转移^[23]。lncRNA牛磺酸上调基因1(TUG1)通过负调控miR-300促进胆囊癌细胞增殖和转移^[24]。本研究显示, miR-300在CAL-27/DDP中表达降低，过表达miR-300可促进CAL-27/DDP的增殖、迁移和侵袭，促进p21表达，抑制CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平。进一步实验显示, LINC01139对miR-300表达具有靶向负调控作用，且干扰miR-300表达能够逆转抑制LINC01139表达对CAL-27/DDP细胞的增殖、迁移和侵袭抑制作用。因此, LINC01139/miR-300分子轴在OSCC的DDP耐药中发挥重要作用。

总之，本研究发现LINC01139能够促进OSCC的DDP耐药性，抑制LINC01139可通过上调miR-300达到抑制CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的目的，为改善OSCC化疗提供了潜在靶点。

图 1 增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

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图 2 增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

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图 3 LINC01139序列中含有与miR-300互补的核苷酸序列

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图 4 4组增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

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表 1 顺铂对CAL-27细胞和CAL-27/DDP增殖抑制率的影响(x±s)

细胞	DDP浓度							IC₅₀/(μg/mL)
细胞	0.125 μg/mL	0.25 μg/mL	0.5 μg/mL	1 μg/mL	2 μg/mL	4 μg/mL	8 μg/mL	IC₅₀/(μg/mL)
CAL-27(n=9)	11.32±1.14	22.45±2.27	34.62±3.55	45.86±4.31	59.33±5.12	73.21±7.56	86.22±8.13	1.17±0.19
CAL-27/DDP(n=9)	3.41±0.35^*	7.11±0.72^*	13.24±1.25^*	19.83±1.74^*	31.02±3.17^*	39.65±3.88^*	53.14±5.28^*	6.65±0.51^*
CAL-27: 口腔鳞癌细胞; CAL-27/DDP: 口腔鳞癌顺铂耐药细胞; DDP: 顺铂。与CAL-27细胞比较, * P＜0.05。

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表 2 LINC01139和miR-300在CAL-27细胞和CAL-27/DDP细胞中的表达(x±s)

细胞	LINC01139	miR-300
CAL-27(n=9)	1.00±0.06	1.00±0.05
CAL-27/DDP(n=9)	2.93±0.27^*	0.34±0.03^*
LINC01139: 长链非编码RNA01139; miR-300: 微小RNA-300; CAL-27: 口腔鳞癌细胞; CAL-27/DDP: 口腔鳞癌顺铂耐药细胞。与CAL-27细胞比较, * P＜0.05。

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表 3 抑制LINC01139表达联合DDP对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响(x±s)

组别	LINC01139	抑制率/%	迁移细胞数/个	侵袭细胞数/个	CyclinD1蛋白	p21蛋白	MMP-2蛋白	MMP-9蛋白
DDP+si-NC组(n=9)	1.00±0.08	6.41±0.63	105.23±10.22	88.14±8.42	0.61±0.06	0.33±0.03	0.72±0.07	0.66±0.06
DDP+si-LINC01139组(n=9)	0.51±0.05^*	42.15±4.13^*	56.39±5.21^*	41.65±4.55^*	0.20±0.02^*	0.79±0.07^*	0.30±0.03^*	0.27±0.03^*
LINC01139: 长链非编码RNA01139; CyclinD1: 兔源细胞周期素D1; MMP-2: 基质金属蛋白酶-2; MMP-9: 基质金属蛋白酶-9。与DDP+si-NC组比较, * P＜0.05。

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表 4 miR-300过表达联合DDP对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响(x±s)

组别	miR-300	抑制率/%	迁移细胞数/个	侵袭细胞数/个	CyclinD1蛋白	p21蛋白	MMP-2蛋白	MMP-9蛋白
DDP+miR-NC组(n=9)	1.00±0.06	7.12±0.77	101.25±9.84	86.14±8.63	0.63±0.06	0.32±0.03	0.71±0.07	0.68±0.06
DDP+miR-300组(n=9)	2.57±0.24^*	35.48±3.55^*	60.55±6.31^*	53.47±5.33^*	0.28±0.03^*	0.75±0.07^*	0.37±0.03^*	0.30±0.03^*
miR-300: 微小RNA-300; CyclinD1: 兔源细胞周期素D1; MMP-2: 基质金属蛋白酶-2; MMP-9: 基质金属蛋白酶-9。与DDP+miR-NC组比较, * P＜0.05。

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表 5 双荧光素酶报告实验(x±s)

组别	WT-LINC01139	MUT-LINC01139
miR-NC组(n=9)	1.00±0.06	1.02±0.08
miR-300组(n=9)	0.57±0.05^*	0.99±0.07
与miR-NC组比较, * P＜0.05。

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表 6 LINC01139调控miR-300的表达(x±s)

组别	miR-300
pcDNA组(n=9)	1.00±0.07
pcDNA-LINC01139组(n=9)	0.53±0.05^*
si-NC组(n=9)	1.02±0.06
si-LINC01139组(n=9)	2.68±0.27^#
F	381.236
P	＜0.001
与pcDNA组比较, * P＜0.05; 与si-NC组比较, #P＜0.05。

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表 7 干扰miR-300表达逆转了抑制LINC01139表达对CAL-27/DDP细胞DDP耐药性的作用(x±s)

组别	miR-300	抑制率/%	迁移细胞数/个	侵袭细胞数/个	CyclinD1蛋白	p21蛋白	MMP-2蛋白	MMP-9蛋白
DDP+si-NC组(n=9)	1.00±0.08	7.06±0.71	106.24±9.56	85.14±8.36	0.62±0.06	0.31±0.03	0.73±0.07	0.67±0.06
DDP+si-LINC01139组(n=9)	2.84±0.27^*	43.25±4.31^*	57.14±5.33^*	43.51±4.33^*	0.22±0.03^*	0.77±0.07^*	0.33±0.03^*	0.29±0.03^*
DDP+si-LINC01139+anti-miR-NC组(n=9)	2.86±0.28	44.69±4.52	55.86±5.52	42.69±4.74	0.21±0.02	0.78±0.06	0.32±0.03	0.28±0.02
DDP+si-LINC01139+anti-miR-300组(n=9)	1.53±0.15^#	21.36±2.54^#	83.47±8.35^#	69.71±6.33^#	0.51±0.05^#	0.40±0.04^#	0.64±0.06^#	0.56±0.05^#
miR-300: 微小RNA-300; CyclinD1: 兔源细胞周期素D1; MMP-2: 基质金属蛋白酶-2; MMP-9: 基质金属蛋白酶-9。与DDP+si-NC组比较, * P＜0.05; 与DDP+si-LINC01139+anti-miR-NC组比较, #P＜0.05。

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参考文献(24)

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施引文献(2)

期刊类型引用(2)

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2.	王军成，兰彦平，赵岳阳，蒯涛，马东明，李敏. LINK-A RNAi慢病毒载体构建及其抑制U251胶质瘤细胞增殖的研究. 宁夏医学杂志. 2023(07): 577-580+572 . 百度学术

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1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 细胞培养、药物处理
1.3 实验分组
1.4 qRT-PCR检测LINC01139和miR-300表达
1.5 MTT法检测细胞增殖抑制率
1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭
1.7 Western blot检测CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表达
1.8 双荧光素酶报告基因实验
1.9 统计学分析
2. 结果
2.1 DDP对CAL-27细胞和CAL-27/DDP增殖抑制率的影响
2.2 CAL-27、CAL-27/DDP中LINC01139和miR-300的表达
2.3 抑制LINC01139表达联合DDP(0.25 μg/mL)对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响
2.4 miR-300过表达联合DDP(0.25 μg/mL)对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响
2.5 LINC01139靶向调控miR-300的表达
2.6 干扰miR-300表达逆转了抑制LINC01139表达对CAL-27/DDP细胞DDP耐药性的作用
3. 讨论

1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 细胞培养、药物处理
1.3 实验分组
1.4 qRT-PCR检测LINC01139和miR-300表达
1.5 MTT法检测细胞增殖抑制率
1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭
1.7 Western blot检测CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表达
1.8 双荧光素酶报告基因实验
1.9 统计学分析
2. 结果
2.1 DDP对CAL-27细胞和CAL-27/DDP增殖抑制率的影响
2.2 CAL-27、CAL-27/DDP中LINC01139和miR-300的表达
2.3 抑制LINC01139表达联合DDP(0.25 μg/mL)对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响
2.4 miR-300过表达联合DDP(0.25 μg/mL)对CAL-27/DDP细胞增殖、迁移和侵袭的影响
2.5 LINC01139靶向调控miR-300的表达
2.6 干扰miR-300表达逆转了抑制LINC01139表达对CAL-27/DDP细胞DDP耐药性的作用
3. 讨论

参考文献(24)

施引文献(2)

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长链非编码RNA01139靶向调控微小RNA-300对口腔鳞癌顺铂耐药细胞增殖、迁移和侵袭的影响

通讯作者: 李鲲, E-mail: 1745620905@qq.com

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