Comparative study of two different elastic fiber staining methods of interpretation result of tumor invasion
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摘要:目的 比较Victoria blue法(A组)和Verhoeff法(B组)弹力纤维染色在染色过程、染色时间、染色效果方面对肺癌胸膜侵犯和结直肠癌浆膜或静脉侵犯判读的差异。方法 A组、B组均分别纳入肺癌怀疑胸膜侵犯标本50例和结直肠癌怀疑浆膜或静脉侵犯标本20例，进行弹力纤维染色。对比2组染色过程、染色时间、染色效果; 根据染色稳定性、清晰度、对比度等综合评价胸膜侵犯和浆膜或静脉侵犯情况，并对染色质量及判读准确性进行评分。结果 A组比B组操作简单，染色质量稳定，肿瘤细胞与脏层胸膜、浆膜或静脉的关系显示更清晰。A组判读评分高于B组，差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 Victoria blue法染色有助于准确评估肺癌的胸膜侵犯和结直肠癌浆膜或静脉的侵犯，提高判读准确性。Abstract:Objective To compare the difference between Victoria Blue method (group A) and Verhoeff method (group B) in the interpretation of pleural invasion in lung cancer and serous or venous invasion in colorectal cancer in terms of staining process, staining time and staining effect.Methods In the group A and group B, 50 cases of suspected pleural invasion of lung cancer and 20 cases of suspected serosal or venous invasion of colorectal cancer were enrolled for elastic fiber staining. The dyeing process, dyeing time and dyeing effect were compared between the two groups; pleural invasion and serosal or venous invasion were evaluated comprehensively according to the stability, clarity as well as contrast of staining, and the staining quality and interpretation accuracy were scored.Results Compared with the group B, the operation of group A was simpler, the staining quality was stable, and the relationship between tumor cells and visceral pleura, serous membrane or vein was clearer. The interpretation score of the group A was significantly higher than that of the group B (P < 0.05).Conclusion Victoria blue staining is helpful to accurately evaluate pleural invasion of lung cancer and serous membrane or vein invasion of colorectal cancer, and improve the accuracy of interpretation.
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Keywords:
- lung cancer /
- colorectal cancer /
- elastic fiber staining /
- pleural invasion /
- serosal invasion /
- venous invasion
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反复呼吸道感染(RRI)是指上下呼吸道感染次数超过一定范围，在儿童中的发病率较高[1]。RRI的发生与儿童免疫力低下、长期挑食、居住环境不良及微量元素缺乏等因素密切相关，临床表现包括鼻塞、发热、咳嗽、食欲不振和腹泻等[2-3]。RRI通常起病较急，若治疗不及时或不当，会严重影响儿童的生长发育。因此，探讨与RRI患儿病情严重程度及预后相关的指标，对于优化临床治疗效果及改善预后具有重要意义[4]。既往研究[5-7]报道，内皮细胞特异性分子-1(ESM-1, 又称endocan)、白细胞介素(IL)-1α和人类软骨糖蛋白-39(又称YKL-40)在呼吸道疾病的发生和进展中扮演重要角色。然而, endocan、IL-1α和YKL-40与RRI患儿预后的关系尚不明确。因此，本研究分析血清endocan、IL-1α及YKL-40水平与RRI患儿病情严重程度和预后的关系，以期为改善RRI患儿的预后提供参考依据，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性选取2022年10月—2023年9月青岛市第八人民医院收治的86例RRI患儿作为病例组，并根据病情严重程度[8]分为轻度组37例、中度组31例和重度组18例。纳入标准: ①符合RRI诊断标准[9]者; ②年龄1~12岁者; ③病程1年及以上者。排除标准: ①不接受随访者; ②合并其他慢性感染疾病者; ③既往有肿瘤史者; ④有免疫功能缺陷者; ⑤伴有血液类疾病者; ⑥有肺部手术史者; ⑦合并重要脏器功能障碍者; ⑧近3个月内使用激素或影响免疫功能的药物者; ⑨先天性呼吸道畸形者。另选取同期体检的94例健康儿童作为对照组。本研究经青岛市第八人民医院医学伦理委员会审核通过(批号: 20211220-02), 患儿家属均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 血清endocan、IL-1α和YKL-40水平检测
所有儿童于入院后抽取空腹静脉血3 mL, 血液经离心处理后，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中endocan、IL-1α和YKL-40水平。操作严格按照人endocan(货号KOA0444, 艾美捷科技有限公司)、IL-1α(货号KS016981, 上海科顺生物科技有限公司)、YKL-40(货号YS02583B, 上海雅吉生物科技有限公司)ELISA试剂盒说明书进行，使用Multiskan SkyHigh酶标仪(赛默飞)检测各样品在450 nm处的吸光度，并根据标准曲线计算浓度。
1.2.2 随访及预后评估
所有患儿接受常规抗感染和对症治疗，若治疗结束后6个月内呼吸道感染次数减少≥50%则归为预后良好组(n=64), 否则归为预后不良组(n=22)。
1.3 统计学分析
采用SPSS 25.0统计学软件进行数据处理。计数资料以[n(%)]表示，比较采用χ2检验。计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验或单因素方差分析。采用Spearman相关性分析法评估血清endocan、IL-1α和YKL-40水平与RRI患儿病情严重程度的相关性; 采用多因素Logistic回归分析探讨RRI患儿预后的影响因素; 绘制受试者工作特征(ROC)曲线，分析血清endocan、IL-1α和YKL-40对RRI患儿预后的预测价值。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 病例组和对照组一般资料及血清endocan、IL-1α、YKL-40水平比较
病例组在年龄、体质量指数、性别方面与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05); 病例组血清endocan、IL-1α、YKL-40水平均高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 病例组与对照组一般资料及血清endocan、IL-1α、YKL-40水平比较(x±s)[n(%)]指标 病例组(n=86) 对照组(n=94) t/χ2 P 年龄/岁 7.16±1.61 7.63±1.85 1.811 0.072 体质量指数/(kg/m2) 21.80±2.30 21.49±2.18 0.928 0.355 endocan/(ng/mL) 11.43±2.70 8.05±2.16 9.311 < 0.001 IL-1α/(pg/mL) 8.29±2.15 4.61±0.94 15.096 < 0.001 YKL-40/(ng/mL) 37.14±5.37 25.47±4.12 16.437 < 0.001 性别 女 50(58.14) 52(55.32) 0.145 0.703 男 36(41.86) 42(44.68) endocan: 又称内皮细胞特异性分子-1; IL-1α: 白细胞介素-1α;
YKL-40: 又称人类软骨糖蛋白-39。2.2 轻度组、中度组和重度组血清endocan、IL-1α、YKL-40水平比较
中度组和重度组患儿血清endocan、IL-1α、YKL-40水平均高于轻度组，且重度组患儿水平高于中度组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 轻度组、中度组和重度组患儿血清endocan、IL-1α、YKL-40水平比较(x±s)组别 n endocan/(ng/mL) IL-1α/(pg/mL) YKL-40/(ng/mL) 轻度组 37 8.61±2.52 6.03±1.96 31.18±5.04 中度组 31 12.05±2.70* 8.64±2.27* 39.12±5.47* 重度组 18 16.14±3.08*# 12.35±2.32*# 45.98±5.86*# 与轻度组比较, * P < 0.05; 与中度组比较, #P < 0.05。 2.3 血清endocan、IL-1α、YKL-40水平与RRI患儿病情严重程度的相关性
Spearman相关性分析结果显示，血清endocan、IL-1α、YKL-40水平与RRI患儿病情严重程度均呈显著正相关(r=0.407、0.493、0.452, P < 0.001)。
2.4 预后良好组和预后不良组血清endocan、IL-1α、YKL-40水平比较
预后不良组患儿血清endocan、IL-1α、YKL-40水平均高于预后良好组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 预后良好组和预后不良组血清endocan、IL-1α、YKL-40水平比较(x±s)组别 n endocan/(ng/mL) IL-1α/(pg/mL) YKL-40/(ng/mL) 预后良好组 64 10.24±2.43 7.18±1.87 34.91±5.08 预后不良组 22 14.89±3.47* 11.52±2.95* 43.64±6.23* 与预后良好组比较, * P < 0.05。 2.5 预后良好组和预后不良组临床资料比较
预后良好组和预后不良组患儿在年龄、体质量指数、病程、居住地、早产、被动烟草暴露等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05), 见表 4。
表 4 预后良好组和预后不良组患儿临床资料比较(x±s)[n(%)]指标 分类 预后良好组
(n=64)预后不良组
(n=22)t/χ2 P 年龄/岁 7.29±1.64 6.83±1.52 1.155 0.251 体质量指数(kg/m2) 21.95±2.28 21.37±2.34 1.023 0.309 病程/月 9.13±2.37 10.14±2.46 1.708 0.091 居住地 城镇/城市 39(60.94) 12(54.55) 0.277 0.599 农村 25(39.06) 10(45.45) 性别 女 36(56.25) 14(63.64) 0.367 0.545 男 28(43.75) 8(36.36) 早产 是 14(21.88) 7(31.82) 0.877 0.349 否 50(78.12) 15(68.18) 病情严重程度 轻度 31(48.44) 6(27.28) 3.726 0.155 中度 23(35.94) 8(36.36) 重度 10(15.62) 8(36.36) 被动烟草暴露 是 16(25.00) 9(40.91) 2.010 0.156 否 48(75.00) 13(59.09) 2.6 RRI患儿预后的多因素Logistic回归分析
将RRI患儿预后作为因变量(不良=1, 良好=0), 将血清endocan、IL-1α、YKL-40作为自变量(均为连续变量)，纳入多因素Logistic回归模型。分析结果显示，血清endocan(OR=1.412)、IL-1α(OR=1.583)、YKL-40(OR=1.259)均为RRI患儿预后的独立影响因素(P < 0.05), 见表 5。
表 5 RRI患儿预后的多因素Logistic回归分析变量 β SE Wald χ2 P OR 95%CI endocan 0.345 0.114 9.159 0.002 1.412 1.129~1.766 IL-1α 0.459 0.128 12.877 < 0.001 1.583 1.232~2.034 YKL-40 0.230 0.086 7.172 0.007 1.259 1.064~1.490 2.7 血清endocan、IL-1α、YKL-40对RRI患儿预后的预测价值
以RRI患儿预后为因变量，以血清endocan、IL-1α、YKL-40为检验变量，绘制ROC曲线。分析结果显示，血清endocan、IL-1α、YKL-40预测RRI患儿预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.777、0.795、0.787, 敏感度分别为72.73%、68.18%、72.73%, 特异度分别为84.37%、82.81%、82.81%; 血清endocan、IL-1α、YKL-40联合预测RRI患儿预后不良的敏感度为90.91%, 特异度为81.25%, AUC为0.925, 显著大于endocan、IL-1α、YKL-40单独预测的AUC(Z=2.217、2.169、2.218, P=0.027、0.030、0.027), 见图 1、表 6。
表 6 血清endocan、IL-1α、YKL-40对RRI患儿预后的预测效能变量 曲线下面积 截断值 95%CI 敏感度/% 特异度/% 约登指数 endocan 0.777 12.85 ng/mL 0.674~0.860 72.73 84.37 0.571 IL-1α 0.795 9.63 pg/mL 0.694~0.874 68.18 82.81 0.510 YKL-40 0.787 37.59 ng/mL 0.686~0.868 72.73 82.81 0.555 三者联合 0.925 — 0.848~0.971 90.91 81.25 0.722 3. 讨论
儿童气管、气道尚处于发育阶段，易受病毒、细菌等病原体入侵，引发呼吸道感染[10]。RRI往往伴随炎症反应的发生，其病情与炎症反应程度密切相关[11-13]。endocan、IL-1α、YKL-40与机体炎症通路紧密相关，因此，探讨血清中endocan、IL-1α、YKL-40水平与RRI患儿病情及预后的关系具有重要意义。
endocan是由内皮细胞分泌的蛋白多糖，主要在肾和肺内皮细胞表达，人类endocan编码基因位于5号染色体上[14]。endocan能够影响白细胞的黏附与迁移，在炎性因子作用下其表达量升高[15]。叶云虹等[16]报道，脓毒症患者endocan表达上调，推测脓毒症炎性级联反应导致肺血管内皮细胞受损，进而诱导endocan表达。本研究结果显示, RRI患儿血清endocan水平显著高于健康儿童，表明RRI会导致endocan水平升高。进一步分析发现, RRI患儿血清endocan水平随RRI病情严重程度的增加而升高，且相关性分析显示RRI患儿血清endocan与RRI病情严重程度呈显著正相关，提示RRI患儿病情越严重，内皮细胞功能障碍程度越高。此外，本研究还发现，预后不良组血清endocan水平显著高于预后良好组，且血清endocan是RRI患儿预后的独立影响因素。由此推测, endocan可能通过介导内皮功能和白细胞黏附等过程影响RRI患儿的预后[17]。彭贵鑫[18]发现，血浆endocan有助于慢性阻塞性肺疾病的病情评估和预后预测。本研究ROC曲线显示，血清endocan预测RRI患儿预后不良的AUC为0.777, 即能够在一定程度上对RRI患儿近期预后进行区分预测。
IL-1α为IL-1家族成员之一，是由活化的上皮细胞、巨噬细胞等细胞产生的促炎细胞因子，在机体细胞免疫和炎症反应中发挥重要作用。人类IL-1α编码基因位于2号染色体上[19-20]。佳丽娟等[21]报道，肺结核分歧杆菌感染患者的血清IL-1α水平升高，这可能由病原菌感染后巨噬细胞分泌IL-1α所致。RENIERIS G等[22]研究表明, IL-1α在新型冠状病毒感染中介导组织特异性炎症。本研究发现, RRI患儿血清IL-1α水平显著高于健康儿童，提示RRI患儿体内存在炎症反应; 重度组RRI患儿血清IL-1α水平显著高于中度组，且中度组显著高于轻度组，提示RRI患儿的病情越严重，炎症反应越强。结合Spearman相关性分析结果推测, IL-1α通过介导炎症反应与RRI严重程度密切相关。此外，本研究还发现，预后不良组患儿的血清IL-1α水平显著高于预后良好组，提示RRI患儿的预后与炎症反应强度存在一定关联。ROC曲线分析结果显示，血清IL-1α预测RRI患儿预后不良的AUC为0.795, 敏感度为68.18%, 特异度为82.81%, 提示血清IL-1α具有一定预测价值，当患儿血清IL-1α高于9.63 pg/mL时，预后不良的概率较高。
YKL-40是一种分子量约为40 kDa的分泌型糖蛋白，可由多种细胞分泌，参与组织重塑和炎症反应，其编码基因位于1号染色体。研究[23-24]表明, YKL-40与肺炎、糖尿病肾病、脑梗死等多种疾病的发展密切相关。缪治永等[25]研究发现，抑制YKL-40表达能够减轻Ⅱ型肺泡上皮细胞的炎症反应，为肺部疾病的治疗提供了新思路。本研究结果显示, RRI患儿血清YKL-40水平显著高于健康儿童，表明YKL-40参与了RRI的发生。进一步分析发现，血清YKL-40水平与RRI患儿病情严重程度密切相关，推测YKL-40可能通过介导呼吸系统炎症反应和氧化应激损伤影响其病情程度。此外，预后不良组RRI患儿的血清YKL-40水平显著高于预后良好组，且RRI患儿血清YKL-40水平越高，短期内预后不良的概率越高。郝淑娟等[26]发现，血清YKL-40是评估新生儿肺炎病情的重要指标之一，且其对预后的预测价值较高。本研究ROC曲线分析结果显示，血清YKL-40预测RRI患儿预后的AUC为0.787，敏感度和特异度分别为72.73%和82.81%, 表明血清YKL-40对RRI患儿预后具有一定预测价值。本研究进一步分析血清endocan、IL-1α、YKL-40三者联合对RRI患儿预后的预测价值，发现联合预测的敏感度高达90.91%, 且AUC(0.925)显著大于各指标单独预测的AUC, 表明联合预测的价值更高，可为临床治疗和护理工作提供指导。
综上所述，血清endocan、IL-1α、YKL-40水平均与RRI患儿的病情严重程度和预后密切相关，三者联合检测对RRI患儿预后具有良好的预测价值，可为病情评估和预后预测提供参考。
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图 1 2种弹力纤维染色方法的染色效果(放大倍数10倍)
1a: A组染色效果。肺癌，肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰; 1b: B组染色效果。肺癌，肿瘤细胞与弹力纤维对比不清晰; 2a: A组染色效果。肠癌，低倍镜下易判读; 2b: B组染色效果。肠癌，低倍镜下不易判读; 3a: A组染色效果。肺癌，炭末不影响判读; 3b: B组染色效果。肺癌，炭末影响判读; 4a: A组染色效果。肺癌，分化易掌握，肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰; 4b: B组染色效果。肺癌，分化不够，肿瘤细胞与弹力纤维对比不清晰; 5a: A组染色效果。肺癌，分化易掌握，肿瘤细胞与弹力纤维对比清晰; 5b: B组染色效果。肺癌，分化过度，肿瘤细胞与弹力纤维对比不清晰。
表 1 2种方法染色过程、操作时间对比
组别 脱蜡至水 弹力纤维染色 分化时间 复染时间 脱水封片 A组(n=70) 10 min 乙醇1 min, VB染液1.5 h 同时分化2~3 s 核固红8~15 min 10 min B组(n=70) 10 min 铁碘苏木素15~30 min 须单张分化约35张×1 min VG复染1~2 min 10 min 
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表 2 肺癌胸膜侵犯、结直肠癌浆膜或静脉侵犯判读结果比较[n(%)]
组别 侵犯结果 侵犯 未侵犯 不能判读 A组(n=70) 29(41.43) 41(58.57) 0 B组(n=70) 26(37.14) 43(61.43) 1(1.43)
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表 3 弹力纤维染色评分(x±s)
分 项目 A组(n=70) B组(n=70) 弹力纤维定性定位 1.84±0.37 1.44±0.59 染色背景 1.78±0.42 0.94±0.39 肿瘤细胞与弹力纤维对比 1.89±0.32 1.05±0.55 炭末影响判读 1.91±0.29 1.46±0.60 总分 7.42±0.94 4.89±1.53
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