Clinical significance of circulating tumor cells in radical radiotherapy for esophageal cancer
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摘要:目的
探讨食管癌患者循环肿瘤细胞(CTCs)与临床特征及预后的相关性。
方法选取南通市通州区人民医院2019年8月11日—2021年3月4日收治的114例食管鳞癌患者为研究对象，采用免疫磁珠阴性富集联合免疫荧光原位杂交技术检测CTCs。收集患者临床资料，结合其TNM分期、性别、年龄、肿瘤位置等临床特征进行统计学分析; 比较50例根治性放疗患者在放疗前后的CTCs水平，分析CTCs水平与近期缓解率和无进展生存期(PFS)的关系。
结果114例食管鳞癌患者CTCs阳性率与年龄、性别、肿瘤位置无相关性(P＞0.05), 与肿瘤T分期、N分期、M分期以及临床分期有相关性(P＜0.05或P＜0.01)。50例患者放疗前的CTCs阳性率为62.00%(31/50), 放疗后的CTCs阳性率为52.00%(26/50), 差异无统计学意义(χ2=1.020, P=0.313)。Kaplan-Meier方法绘制生存曲线的结果显示，放疗前CTCs阴性患者PFS为18.62个月(95%CI: 15.24~21.99), 高于CTCs阳性患者的13.84个月(95%CI: 10.01~17.68), 差异有统计学意义(P=0.048)。放疗后CTCs阴性患者PFS为19.58个月(95%CI: 16.51~22.67), 高于CTCs阳性患者的12.13个月(95%CI: 7.94~16.32), 差异有统计学意义(P=0.003)。多因素Cox回归分析显示，肿瘤临床分期、放疗后CTCs是食管鳞癌患者的独立预后因子(P＜0.05)。
结论CTCs是食管鳞癌患者病情进展评估及放疗后预后评价的重要指标。
Abstract:ObjectiveTo explore the correlations of circulating tumor cells (CTCs) with clinical features and prognosis in patients with esophageal cancer.
MethodsA total of 114 patients with esophageal squamous cell carcinoma in Tongzhou District People's Hospital of Nantong City from August 11, 2019 to March 4, 2021 were selected as research objects, and CTCs were detected by immunomagnetic bead negative enrichment combined with immunofluorescence in situ hybridization. The clinical data of patients were collected and statistically analyzed in combination with clinical features such as TNM staging, gender, age and tumor location; the level of CTCs before and after radiotherapy was compared in 50 patients with radical radiotherapy, and the correlations of CTCs level with short-term remission rate and progression free survival (PFS) were analyzed.
ResultsIn 114 patients with esophageal squamous cell carcinoma, positive rate of CTCs had no correlations with age, gender and tumor location (P > 0.05), but was correlated with T staging, N staging, M staging and clinical stages (P < 0.05 or P < 0.01). The positive rate of CTCs in 50 patients was 62.00% (31/50) before radiotherapy and 52.00% (26/50) after radiotherapy, and there was no significant difference before and after radiotherapy (χ2=1.020, P=0.313). The survival curve drawn by Kaplan-Meier method showed that the PFS of patients negative for CTCs before radiotherapywas 18.62 months (95%CI, 15.24 to 21.99), which was significantly higher than 13.84 months (95%CI, 10.01 to 17.68) of patients positive for CTCs before radiotherapy(P=0.048). After radiotherapy, the PFS of patients negative for CTCs was 19.58 months (95%CI, 16.51 to 22.67), which was significantly higher than 12.13 months (95%CI, 7.94 to 16.32) of patients positive for CTCs (P=0.003). Multivariate Cox regression analysis showed that tumor clinical stages and CTCs after radiotherapy were the independent prognostic factors of patients with esophageal squamous cell carcinoma (P < 0.05).
ConclusionCTCs i s an important index in evaluating the progress of disease and prognostic assessment after radiotherapyin patients with esophageal squamous cell carcinoma.
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约90%以上的食管癌患者的病理结果为鳞状细胞癌[1-2]。肿瘤的远处转移和复发是导致食管癌患者死亡的最主要原因。然而，在转移或者复发的早期阶段，患者临床表现不够明显，常规检查未能发现[3]。目前，放射疗法是食管癌的有效治疗手段之一。研究[4]显示，循环肿瘤细胞(CTCs)在肿瘤发展的早期即可从原发灶脱落进入血液循环或者淋巴循环而导致全身播散，这对恶性肿瘤的早期诊断、疗效评估及疾病预后等具有重要的临床价值[5]。本研究采用免疫磁珠阴性富集联合免疫荧光原位杂交技术检测食管鳞癌患者的CTCs，探讨CTCs与食管鳞癌临床特征及预后的关系，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 临床资料
回顾性分析2019年8月11日—2021年3月4日南通市通州区人民医院收治的114例食管鳞癌患者的临床资料，其中男88例，女26例，年龄48~87岁，平均(64.39±8.38)岁。所有患者经胃镜活检确诊为食管鳞癌，且未接受过手术、放射治疗、化疗，卡氏功能状态评分(KPS评分)≥70分，预期生存时间超过3个月。TNM分期根据《食管癌放射治疗指南(2019版)》[6]评定，其中50例不可根治切除或不愿接受手术的局部晚期食管鳞癌患者在检测CTCs后接受了根治性放疗，并在放疗结束1周内再次行CTCs检测，其中男35例，女15例，年龄49~87岁，平均(65.32±9.52)岁。
1.2 方法
1.2.1 CTCs检测
采集患者外周静脉血5 mL, 抗凝处理后室温保存, 24 h内行富集处理。将血液离心、弃上清、去除血红蛋白及血红素。在样本中加入红细胞裂解液，再次离心、弃上清、去除红细胞，白细胞及稀有细胞便沉淀下来。吸取适量磁珠洗涤并加入上述样本中，混匀，使白细胞与磁珠充分结合。再次离心、去除相结合的磁珠与白细胞。浓缩体积并去除残留磁珠后进行涂片。进行免疫荧光染色，得到表面标记CD45阴性、8号染色体着丝粒探针(CEP-8)阳性、4′, 6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)阳性的CTCs, 由3位工作人员独立进行镜下读片，平均数为CTCs计数(图 1)。目前尚无国际化判定标准，本研究取CTCs≥3个为阳性。
1.2.2 治疗方案及疗效评价
50例食管鳞癌患者均采用三维适形放疗，设备为德国西门子直线加速器。放疗处方剂量为1.8~2.0 Gy/次, 1次/d, 5次/周，放疗25次后进行第2次定位，并局部缩野推量，总剂量为60.0~70.0 Gy。依据患者放疗前、二次定位CT及放疗后3周的CT结果进行近期疗效评价，评价标准参考世界卫生组织(WHO)发布的《实体瘤客观疗效评价标准》[7]相关内容，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)。缓解率(RR)=(CR+PR)/总例数×100%。放疗完成后3周进行序贯化疗，并于每2个月对患者进行复查，无进展生存期(PFS)定义为从放疗开始至肿瘤进展的时间，随访截至2021年9月1日。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0进行统计分析，计数资料采用χ2检验，采用双侧检验，生存率采用Kaplan-Meier方法，绘制生存曲线，采用Log-rank检验差异的显著性。应用Cox比例风险模型进行多因素分析以判定独立预后因素。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 CTCs与食管鳞癌患者临床病理特征的关系
114例食管鳞癌患者CTCs阳性率与年龄、性别、肿瘤位置无相关性(P＞0.05)，与肿瘤T分期、N分期、M分期以及临床分期有相关性(P＜0.05或P＜0.01)。见表 1。
表 1 114例食管鳞癌患者CTCs与临床病理特征关系临床病理特征 分类 n CTCs 阳性率/% χ2 P 阴性 阳性 年龄 ＜60岁 29 15 14 48.28 1.476 0.224 ≥60岁 85 33 52 61.18 性别 男 88 34 54 61.36 1.905 0.168 女 26 14 12 46.15 肿瘤位置 上段 31 17 14 45.16 3.810 0.149 中段 56 23 33 58.93 下段 27 8 19 70.37 T分期 T1 17 12 5 29.41 9.682 0.021 T2 40 18 22 55.00 T3 38 14 24 63.16 T4 19 4 15 78.95 N分期 N0 42 27 15 35.71 14.153 0.001 N1 35 12 23 65.71 N2 37 9 28 75.68 N3 0 0 0 0 M分期 M0 104 47 57 54.81 4.635 0.031 M1 10 1 9 90.00 临床分期 Ⅰ期 27 21 6 22.22 24.380 0.001 Ⅱ期 32 15 17 53.13 Ⅲ期 45 11 34 75.56 Ⅳ期 10 1 9 90.00 2.2 放疗前后CTCs的变化
50例患者放疗前的CTCs阳性率为62.00%(31/50), 放疗后的CTCs阳性率为52.00%(26/50), 放疗前后的CTCs阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=1.020, P=0.313)。
2.3 CTCs与食管鳞癌患者放疗近期疗效的关系
50例患者中, 33例患者放疗后评价为缓解(CR+PR), 17例评价为SD。与CTCs阳性患者相比, CTCs阴性患者放疗前及放疗后的RR均更高，差异有统计学意义(P＜0.05); 放疗前阳性而放疗后阴性患者的RR高于放疗前后均为阳性、放疗前阴性而放疗后阳性、放疗前后均为阴性患者，差异有统计学意义(χ2=11.644, P=0.009)。见表 2。
表 2 50例食管鳞癌患者CTCs与放疗后近期疗效的关系时点 CTCs分类 n 疗效评价 RR/% χ2 P CR+PR SD 放疗前 阴性 19 16 3 84.21 4.529 0.033 阳性 31 17 14 54.84 放疗后 阴性 24 20 4 83.33 6.179 0.013 阳性 26 13 13 50.00 放疗前后变化 放疗前后均为阳性 22 13 9 59.09 11.644 0.009 放疗前阳性而放疗后阴性 9 8 1 88.89 放疗前阴性而放疗后阳性 4 0 4 0 放疗前后均为阴性 15 12 3 80.00 2.4 CTCs与食管鳞癌患者放疗后PFS的关系
截至2021年9月1日，本研究50例患者均完成随访，共有27例患者出现疾病进展。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并进行生存分析，放疗前CTCs阴性患者PFS为18.62个月(95%CI: 15.24~21.99), 高于CTCs阳性患者的13.84个月(95%CI: 10.01~17.68), 差异有统计学意义(P=0.048)。放疗后CTCs阴性患者PFS为19.58个月(95% CI: 16.51~22.67), 高于CTCs阳性患者的12.13个月(95% CI: 7.94~16.32), 差异有统计学意义(P=0.003)。见图 2。
2.5 多因素Cox回归分析PFS的影响因素
年龄、性别、T分期、N分期、放疗前CTCs与PFS无相关性(P＞0.05), 肿瘤临床分期、放疗后CTCs是食管鳞癌患者的独立预后因子(P＜0.05)。见表 3。
表 3 食管鳞癌患者放疗后PFS的COX回归分析预后因素 回归系数 Wald P OR 95%CI 下限 上限 年龄 -0.287 0.112 0.737 0.750 0.140 4.027 性别 0.286 0.166 0.684 1.331 0.337 5.258 T分期 -0.368 0.319 0.572 0.692 0.193 2.481 N分期 -0.184 0.074 0.786 0.832 0.220 3.141 临床分期 1.674 4.743 0.029 5.334 1.182 24.063 放疗前CTCs 0.183 0.042 0.838 1.201 0.207 6.966 放疗后CTCs 2.027 5.274 0.022 7.592 1.346 42.820 3. 讨论
食管癌是常见的预后较差的恶性肿瘤，其5年生存率仅为20%左右，肿瘤的远处转移和复发是其主要原因[8]。目前，食管癌检测的主要手段是影像学检测及肿瘤标志物检测，但是影像学检查无法及时发现肿瘤的复发、转移，而食管癌也缺乏特异性的肿瘤标志物。CTCs可从肿瘤处脱落并通过循环系统及淋巴系统进行全身播散，是肿瘤转移过程的关键环节，对CTCs的检测较传统检查能更及时地对肿瘤进展进行评估，且具有易于获得、相对无创、可以反复检测等优点，具有成为“实时肿瘤活检”的可能性。由于CTCs在外周血中含量极少, 106~108个血细胞中仅存在1个CTCs[9], 因此在CTCs检测中富集是必要的。较为常见的富集技术是形态学富集法和免疫磁珠抗原依赖技术[10], 其中形态学富集法具有操作便捷、价格相对较低等优点，但缺乏特异性，存在漏检可能; 免疫磁珠抗原依赖技术分为阳性及阴性富集法，前者通过识别肿瘤细胞表达的上皮细胞黏附分子(EpCAM)进行直接富集，后者通过去除CD45阳性的白细胞进行间接富集。本研究采用的阴性富集法不依赖CTCs表面标志物的表达，具有更高的检测率，而且所检出的CTCs具有更高的活性。
本研究发现CTCs与T分期、N分期、远处转移及临床分期有相关性，与年龄、性别、肿瘤部位无相关性。目前CTCs在乳腺癌、肺癌、胃癌等肿瘤中得到广泛研究，但在食管癌方面的研究较少，且研究结果也存在差异。MATSUSHITA D等[11]对90例食管癌患者的研究显示, CTCs水平与远处转移及临床分期有相关性，与T分期、N分期无相关性。LI SP等[12]报道食管癌CTCs水平仅与临床分期有关。QIAO Y等[13]研究显示, CTCs水平与T分期、N分期、远处转移及临床分期有关，与本研究结果一致。造成上述研究结果差异的原因可能是各研究检测方法有差异及研究样本不同所致，食管癌外周血CTCs仍缺乏大样本的研究报道，但总体上CTCs能反映食管癌的进展程度, CTCs的检测能对食管癌病情进行有效评估。在Ⅰ期食管癌中, CTCs阳性率为22.22%, 证明食管癌早期即可发生肿瘤细胞脱离原发灶进入血液循环，而此类患者发生转移的风险较高，因此CTCs能筛选食管癌发生转移的高危人群。本研究中，非转移食管鳞癌CTCs阳性率为54.81%, 表明CTCs在肿瘤未发生转移前即可被检测到，较传统影像学检测更为灵敏。
化疗能有效降低患者CTCs水平，故本研究在患者行序贯化疗前行CTCs检查，且重点观察放疗对CTCs水平的影响。本研究中，患者放疗后CTCs阳性率较放疗前有降低趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05), 考虑放疗作为局部治疗手段较化疗无法在短期内显著降低CTCs水平，同时本研究样本量较小，需要扩大样本量进一步研究。本研究显示放疗前后CTCs水平能评估患者近期RR，且CTCs放疗前阳性而放疗后阴性患者RR较高，提示放疗对肿瘤原发灶的有效控制可能与放疗诱导肿瘤细胞死亡、促进免疫性抗原释放、激活机体抗肿瘤免疫效应有关[14-15]。本研究4例患者出现放疗前阴性而放疗后阳性的情况，且疗效评估均为SD, 提示放疗效果不佳时CTCs水平会进一步提高。研究[16-18]指出CTCs与乳腺癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤的预后密切相关。本研究发现CTCs放疗前后水平与食管鳞癌患者预后密切相关，即CTCs水平高的患者的预后较差、PFS较低，表明CTCs也可以作为食管鳞癌的预后评价指标，与WOESTEMEIER A等[19]报道一致。本研究还显示放疗后CTCs、肿瘤临床分期可以作为食管鳞癌放疗后的独立预后因子，因此CTCs检测对食管鳞癌患者的临床诊治及预后评价具有较大的指导意义。
综上所述，本研究显示食管鳞癌患者CTCs与T分期、N分期、远处转移及临床分期有相关性，CTCs是食管鳞癌发生远处转移的重要前提，对评价肿瘤的进展程度具有重要意义; CTCs水平能有效反映食管鳞癌放疗患者近期RR及远期疗效，是食管鳞癌预后的重要指标。
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表 1 114例食管鳞癌患者CTCs与临床病理特征关系
临床病理特征 分类 n CTCs 阳性率/% χ2 P 阴性 阳性 年龄 ＜60岁 29 15 14 48.28 1.476 0.224 ≥60岁 85 33 52 61.18 性别 男 88 34 54 61.36 1.905 0.168 女 26 14 12 46.15 肿瘤位置 上段 31 17 14 45.16 3.810 0.149 中段 56 23 33 58.93 下段 27 8 19 70.37 T分期 T1 17 12 5 29.41 9.682 0.021 T2 40 18 22 55.00 T3 38 14 24 63.16 T4 19 4 15 78.95 N分期 N0 42 27 15 35.71 14.153 0.001 N1 35 12 23 65.71 N2 37 9 28 75.68 N3 0 0 0 0 M分期 M0 104 47 57 54.81 4.635 0.031 M1 10 1 9 90.00 临床分期 Ⅰ期 27 21 6 22.22 24.380 0.001 Ⅱ期 32 15 17 53.13 Ⅲ期 45 11 34 75.56 Ⅳ期 10 1 9 90.00 
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表 2 50例食管鳞癌患者CTCs与放疗后近期疗效的关系
时点 CTCs分类 n 疗效评价 RR/% χ2 P CR+PR SD 放疗前 阴性 19 16 3 84.21 4.529 0.033 阳性 31 17 14 54.84 放疗后 阴性 24 20 4 83.33 6.179 0.013 阳性 26 13 13 50.00 放疗前后变化 放疗前后均为阳性 22 13 9 59.09 11.644 0.009 放疗前阳性而放疗后阴性 9 8 1 88.89 放疗前阴性而放疗后阳性 4 0 4 0 放疗前后均为阴性 15 12 3 80.00
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表 3 食管鳞癌患者放疗后PFS的COX回归分析
预后因素 回归系数 Wald P OR 95%CI 下限 上限 年龄 -0.287 0.112 0.737 0.750 0.140 4.027 性别 0.286 0.166 0.684 1.331 0.337 5.258 T分期 -0.368 0.319 0.572 0.692 0.193 2.481 N分期 -0.184 0.074 0.786 0.832 0.220 3.141 临床分期 1.674 4.743 0.029 5.334 1.182 24.063 放疗前CTCs 0.183 0.042 0.838 1.201 0.207 6.966 放疗后CTCs 2.027 5.274 0.022 7.592 1.346 42.820
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