Vitamin C alleviates macular degeneration in rats by regulating function of macrophages
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摘要:目的
探讨维生素C通过调节巨噬细胞功能缓解大鼠黄斑变性的可能机制。
方法应用尾静脉注射碘酸钠法建立黄斑变性SD大鼠模型，并灌胃维生素C对其进行治疗。30只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、治疗组，每组10只。正常组不给予处理；治疗组尾静脉注射40 mg/kg碘酸钠造模，实验开始后每天灌胃1次维生素C，灌胃剂量100 mg/kg; 模型组尾静脉注射40 mg/kg碘酸钠造模，实验开始后每天灌胃等体积生理盐水。治疗结束后，使用视网膜电图记录系统检测大鼠视网膜电位，使用苏木精-伊红染色法(HE染色法)对视网膜结构、视网膜外核层细胞数、视网膜色素细胞上皮层进行观察，使用流式细胞仪检测视网膜巨噬细胞的CD36和CD206。
结果维生素C能够减缓大鼠视网膜损伤。模型组视网膜外核层细胞数为(72.90±15.60)个/视野，低于治疗组的(126.40±13.60)个/视野，差异有统计学意义(P＜0.01); 模型组视网膜色素上皮细胞层数为(1.56±0.93)层/视野，低于治疗组的(3.49±0.88)层/视野，差异有统计学意义(P＜0.05)。维生素C能提高年龄相关性黄斑变性(AMD)大鼠视网膜电位，保护大鼠视网膜功能，缓解AMD进展。维生素C能够提高CD36阳性细胞比率，降低CD206阳性细胞比率，体现为模型组视网膜巨噬细胞CD36阳性细胞比率为(33.98±6.86)%, 低于治疗组的(46.86±3.83)%, 差异有统计学意义(P＜0.01); 模型组视网膜巨噬细胞CD206阳性细胞比率为(43.59±6.51)%, 高于治疗组的(31.52±4.08)%, 差异有统计学意义(P＜0.01)。
结论维生素C通过增强视网膜巨噬细胞吞噬能力、抑制巨噬细胞M2极化发挥缓解大鼠黄斑变性的功效。
Abstract:ObjectiveTo explore the possible mechanism of vitamin C in alleviating macular degeneration in rats by regulating the function of macrophages.
MethodsSD rats were injected with sodium iodate into the tail vein to create a macular degeneration model, and vitamin C was given to the rats by gavage. Thirty SD rats were randomly divided into normal group, model group and treatment group after adaptive feeding for one week, with 10 rats in each group. The normal group was not given any treatment measures; in the treatment group, 40 mg/kg sodium iodate was injected into the tail vein to establish the model, and 100 mg/kg vitamin C was given by gavage once a day after the start of experiment; in the model group, 40 mg/kg sodium iodate was injected into the tail vein to establish the model, and the equal volume of normal saline was given by gavage every day after the start of experiment. After the treatment, the electroretinogram recording system was used to detect retinal potential of rats, the retinal structure, the number of retinal external nuclear cells and the epithelial layer of retinal pigment cells were detected by hematoxylin-eosin staining (HE staining), and flow cytometry was used to detect CD36 and CD206 in retinal macrophages.
ResultsVitamin C was able to alleviate the retinal damage in rats. The number of retinal external nuclear cells in the model group was (72.90±15.60) cells per field of vision, which was lower than (126.40±13.60) cells per field of vision in the treatment group (P < 0.01). The epithelial layer of retinal pigment cells in the model group was (1.56±0.93) layers per field of vision, which was significantly lower than (3.49±0.88) layers per field of vision in the treatment group (P < 0.05). Vitamin C was able to increase the retinal potential of age-related macular degeneration (AMD) rats, protect the retinal function of rats, and alleviate the progression of AMD. Vitamin C was able to increase the ratio of CD36 positive cells and reduce the ratio of CD206 positive cells, which was reflected as follows: the ratio of CD36 positive cells of retinal macrophages in the model group was (33.98±6.86)%, which was significantly lower than (46.86±3.83)% in the treatment group (P < 0.01). The ratio of CD206 positive cells of retinal macrophages in the model group was (43.59±6.51)%, which was significantly higher than (31.52±4.08)% in the treatment group (P < 0.01).
ConclusionVitamin C can alleviate macular degeneration in rats by enhancing phagocytic capacity of retinal macrophages and inhibiting M2 polarization of macrophages.
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Keywords:
- vitamin C /
- age-related macular degeneration /
- macrophages /
- electroretinogram /
- retinal damage
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年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种好发于50岁以上人群的慢性进展性疾病，是老年人群不可逆性视力损伤的主要原因之一[1]。AMD的病因和发病机制复杂，目前认为该病与年龄、种族、遗传、氧化应激、炎症等相关[2-4]。研究[5-6]表明, AMD本质上是慢性炎症，而巨噬细胞作为参与炎症的重要细胞，其在AMD发病机制中的作用一直受到关注。对于AMD的治疗，目前临床上通常采用全身补充抗氧化剂药物如维生素C等进行治疗[7-8], 但关于维生素C缓解AMD的机制的研究仍较少。本研究探讨维生素C通过调节巨噬细胞功能缓解黄斑变性进展的机制，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂与动物
碘酸钠，购自美国Sigma-Aldrich公司; 维生素C粉剂，购自国药集团化学试剂有限公司; 荧光标记抗小鼠流式抗体，购自美国Biolegend公司。
2周龄SD大鼠30只，雄性，体质量200~220 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK(京)2016-0011。实验过程中严格遵守3R原则。
1.2 造模与分组给药
参照参考文献[9]造模，并进行适当调整。30只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、治疗组，每组10只。正常组不给予处理; 治疗组尾静脉注射40 mg/kg碘酸钠造模，实验开始后每天灌胃1次维生素C, 灌胃剂量100 mg/kg; 模型组尾静脉注射40 mg/kg碘酸钠造模，实验开始后每天灌胃等体积生理盐水。共治疗14 d, 2 d测量1次体质量。
1.3 视网膜电图(ERG)测定
给药治疗结束后，将大鼠暗适应12 h、散瞳、使用50 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg甲苯噻嗪腹腔注射麻醉后，在双侧眼睑内安放银-氯化银电极，参考电极和接地电极分别置于同侧下肢和后颈处。采用Ganzfeld Q400刺激器进行刺激，使用RETI-port视网膜电图记录系统进行暗适应、明适应、混合反应、振荡电位和闪烁光反应视网膜电图检测，记录各组大鼠a波、b波的峰时值(ms)和振幅值(μV)。
1.4 视网膜结构变化检测
给药结束后，将大鼠麻醉，取出眼球后脱臼处死。将眼球置于4%多聚甲醛中固定30 min, 剥离出视网膜后再次固定24 h, 后经脱水、包埋、切片后进行苏木精-伊红染色(HE染色)。在光学显微镜下对视网膜外核层细胞数、视网膜色素上皮层数进行计数。
1.5 巨噬细胞流式检测
将大鼠眼球取出后，采用生理盐水漂洗干净，剪成小块，置于含0.8 mg/mL胶原酶Ⅳ和0.5 μg/mL RNase Ⅰ的RPMI 1640培养基中，于37 ℃消化30 min。采用70 μm细胞过滤器过滤, PBS清洗后得到单细胞悬液。
使用2% BSA/PBS封闭单细胞30 min, 取1×106细胞(100 μL)按说明书加入适量荧光标记的抗小鼠CD11b、F4/80、CD36或CD206抗体，避光孵育30 min。再次离心后，使用PBS重悬，使用流式细胞仪对巨噬细胞(CD11b+F4/80+)的CD36、CD206阳性细胞比率进行检测。
1.6 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件分析数据，计量资料采用均数±标准差表示。使用单因素方差分析(ANOVA)对组间均数进行比较，进一步采用最显著差数法(LSD-t法)进行多重两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 维生素C对大鼠体质量的影响
实验结果显示，维生素C作为临床常用的抗氧化剂，灌胃给药持续时间对大鼠体质量无影响，差异无统计学意义(P＞0.05), 说明维生素C用于治疗黄斑变性是相对安全的。见表 1。
表 1 各组大鼠灌胃给药持续时间对体质量变化的影响(x±s)g 组别 n 0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d 正常组 10 190.1±10.2 193.1±9.2 197.3±10.9 201.4±12.5 203.9±7.4 209.7±8.9 214.2±14.2 221.1±12.7 模型组 10 195.7±12.7 197.1±7.2 199.5±12.6 204.7±11.5 212.4±9.8 215.5±9.6 220.0±13.7 227.8±9.2 治疗组 10 200.5±9.6 201.0±10.2 206.9±14.1 208.4±10.5 210.9±9.3 217.4±13.5 219.6±13.4 225.4±14.1 2.2 维生素C能够恢复黄斑变性大鼠视网膜电位
暗适应0.01 ERG检测结果显示，相较于正常组，模型组ERG b波降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。维生素C灌胃给药治疗14 d后，治疗组ERG b波振幅升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与暗适应0.01 ERG结果相似，与正常组比较，模型组暗适应3.0 ERG、暗适应3.0振荡电位、明适应3.0 ERG以及明适应3.0闪烁光反应的振幅均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。经过14 d的维生素C灌胃治疗后，治疗组上述相关ERG检测治疗均有不同程度的恢复，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2。
表 2 各组大鼠ERG检测(x±s)μV 组别 n 暗适应0.01 ERG 暗适应3.0 ERG 暗适应3.0震荡电位 明适应3.0 ERG 明适应3.0闪烁光反应 正常组 10 312.55±32.12 351.80±40.12 240.99±20.20 361.09±40.12 191.50±16.12 模型组 10 113.56±28.21* 233.56±10.21* 124.05±40.06* 253.56±36.21* 113.56±20.21* 治疗组 10 240.49±30.08# 298.49±30.08# 230.12±35.03# 300.49±20.08# 182.49±10.08# 与正常组比较, * P＜0.05; 与模型组比较, #P＜0.05。 2.3 维生素C能够抑制黄斑变性大鼠视网膜细胞凋亡
为了进一步检测维生素C对大鼠黄斑变性的缓解效果，将治疗后的大鼠视网膜剥离, HE染色后在光学显微镜下观察并统计视网膜外核层细胞数和视网膜色素上皮层数。实验结果显示，正常组大鼠视网膜层析分明，细胞排列整齐，结构无异常。模型组大鼠视网膜出现一定程度的病理损伤，视网膜色素上皮层数减少，细胞呈波浪状排布。经维生素C灌胃治疗后，相较于模型组，治疗组视网膜色素上皮层数有所增加，细胞恢复成较为整齐的排列。视网膜外核层细胞数和视网膜色素上皮层数的定量结果显示，相较于正常组，模型组视网膜外核层细胞数和视网膜色素上皮层数均下降，差异有统计学意义(P＜0.01); 相较于模型组，治疗组视网膜外核层细胞数和视网膜色素上皮层数则有增加，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。上述结果证实了维生素C对大鼠黄斑变性进展有较好的缓解效果。见图 1、表 3。
表 3 各组大鼠视网膜外核层细胞数和视网膜色素上皮层数变化(x±s)组别 n 视网膜外核层细胞数/(个/视野) 视网膜色素上皮层数/(层/视野) 正常组 10 186.90±12.50 6.17±2.01 模型组 10 72.90±15.60** 1.56±0.93** 治疗组 10 126.40±13.60## 3.49±0.88# 与正常组比较, * * P＜0.01; 与模型组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01。 2.4 维生素C改变黄斑变性大鼠视网膜巨噬细胞功能
与正常组相比，模型组大鼠眼球中与细胞吞噬相关的CD36阳性巨噬细胞比率降低，差异有统计学意义(P＜0.05), 而CD206阳性的M2样巨噬细胞比率升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。相较于模型组，经维生素C灌胃治疗后，治疗组CD36阳性巨噬细胞比率升高，而CD206阳性的M2样巨噬细胞比率下降，差异有统计学意义(P＜0.01), 说明维生素C可能是通过增强巨噬细胞的吞噬能力、抑制巨噬细胞的M2极化来发挥缓解黄斑变性的功效。见表 4。
表 4 各组大鼠眼球巨噬细胞CD36、CD206阳性细胞比率变化(x±s)组别 n CD36/% CD206/% 正常组 10 55.63±8.73 21.63±7.81 模型组 10 33.98±6.86* 43.59±6.51** 治疗组 10 46.86±3.83## 31.52±4.08## 与正常组比较, * P＜0.05, * * P＜0.01;
与模型组比较, ##P＜0.01。3. 讨论
AMD是老年人主要的致盲眼病之一，主要症状是视物变形、变色，视力下降甚至失明[7]。AMD包括地图样萎缩(GA)和新生血管性老年性黄斑变性(nAMD), 主要病理特点是脉络膜与视网膜色素上皮细胞层(RPE)之间玻璃膜疣形成, Bruch膜增厚，视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞凋亡，黄斑区脉络膜新生血管形成[10]。AMD的发病机制复杂，研究[3, 8, 11]发现遗传、炎症、氧化应激等均与AMD相关。研究者[10, 12]发现, AMD视网膜中免疫及炎症反应对于该病的进展具有重要影响。
巨噬细胞与免疫及炎症反应的发生密切相关。巨噬细胞具有极强的可塑性，在不同的生理环境下的功能是可变的。根据其功能、标志物的不同，巨噬细胞可以分为经典活化型巨噬细胞(M1样巨噬细胞)和替代活化型巨噬细胞(M2样巨噬细胞)[13-14]。M1样巨噬细胞在脂多糖、γ-干扰素等诱导下极化而成，细胞的促炎因子及炎症介质表达增高，主要介导Th1反应。M2样巨噬细胞是在白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-13(IL-13)等诱导下形成，其抗炎细胞因子表达增加，主要介导Th2免疫反应[15]。M2样巨噬细胞具有抗炎、促肿瘤、促血管新生等作用，在黄斑变性病理进程中发挥重要作用[5, 16]。Drusen是视网膜色素上皮细胞层和Bruch膜之间的胞外沉积物[17]。巨噬细胞吞噬能力下降，导致Drusen沉积，可能是导致AMD的直接原因之一[18]。此外, M2巨噬细胞产生血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子等，可促进血管形成，进而介导nAMD的发生[19-20]。M1样巨噬细胞吞噬能力增强，且其表达的IL-18能够对抗VEGF导致的血管新生[21], 表明将视网膜中的巨噬细胞由M2样逆极化到M1样将有助于AMD的治疗。
由于AMD的病理因素复杂，因此有关AMD的治疗较为困难且难以根治。使用抗氧化剂如维生素C是目前临床上防治AMD的热点[8]。研究[22-24]表明，作为高效抗氧化剂的维生素C可以通过中和自由基来预防或延迟AMD的进展。研究[25]表明，维生素C除了可以抑制巨噬细胞脂质过氧化作用而保护机体免受损伤，还可以明显提高巨噬细胞的增殖、迁移与吞噬能力[26-27]。本研究结果显示，灌胃维生素C能够上调黄斑变性大鼠视网膜巨噬细胞中清道夫受体CD36阳性细胞的比率，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进Drusen沉积物的清除; 同时，维生素C还可以抑制巨噬细胞的M2极化，降低CD206阳性巨噬细胞的比率，减弱巨噬细胞对黄斑变性病变进程的影响。
本研究结果显示，维生素C能够减缓大鼠视网膜损伤，增加视网膜外核层细胞数和视网膜色素上皮细胞层数，提高AMD大鼠视网膜电位，保护大鼠视网膜功能，缓解AMD进展。维生素C可能是通过增强视网膜巨噬细胞吞噬能力、抑制巨噬细胞M2极化来发挥缓解黄斑变性的功效。
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表 1 各组大鼠灌胃给药持续时间对体质量变化的影响(x±s)
g 组别 n 0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d 正常组 10 190.1±10.2 193.1±9.2 197.3±10.9 201.4±12.5 203.9±7.4 209.7±8.9 214.2±14.2 221.1±12.7 模型组 10 195.7±12.7 197.1±7.2 199.5±12.6 204.7±11.5 212.4±9.8 215.5±9.6 220.0±13.7 227.8±9.2 治疗组 10 200.5±9.6 201.0±10.2 206.9±14.1 208.4±10.5 210.9±9.3 217.4±13.5 219.6±13.4 225.4±14.1 
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表 2 各组大鼠ERG检测(x±s)
μV 组别 n 暗适应0.01 ERG 暗适应3.0 ERG 暗适应3.0震荡电位 明适应3.0 ERG 明适应3.0闪烁光反应 正常组 10 312.55±32.12 351.80±40.12 240.99±20.20 361.09±40.12 191.50±16.12 模型组 10 113.56±28.21* 233.56±10.21* 124.05±40.06* 253.56±36.21* 113.56±20.21* 治疗组 10 240.49±30.08# 298.49±30.08# 230.12±35.03# 300.49±20.08# 182.49±10.08# 与正常组比较, * P＜0.05; 与模型组比较, #P＜0.05。
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表 3 各组大鼠视网膜外核层细胞数和视网膜色素上皮层数变化(x±s)
组别 n 视网膜外核层细胞数/(个/视野) 视网膜色素上皮层数/(层/视野) 正常组 10 186.90±12.50 6.17±2.01 模型组 10 72.90±15.60** 1.56±0.93** 治疗组 10 126.40±13.60## 3.49±0.88# 与正常组比较, * * P＜0.01; 与模型组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01。
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表 4 各组大鼠眼球巨噬细胞CD36、CD206阳性细胞比率变化(x±s)
组别 n CD36/% CD206/% 正常组 10 55.63±8.73 21.63±7.81 模型组 10 33.98±6.86* 43.59±6.51** 治疗组 10 46.86±3.83## 31.52±4.08## 与正常组比较, * P＜0.05, * * P＜0.01;
与模型组比较, ##P＜0.01。
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