Expression and significance of DCAF7 and miR-98-3p in colorectal cancer tissues
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摘要:目的
探讨DCAF7、miR-98-3p在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系。
方法选取在辽宁省肿瘤医院行结直肠癌根治术的患者70例为研究对象。术中收集患者的结直肠癌组织及癌旁正常组织。采用免疫组织化学染色法检测结直肠癌组织中DCAF7分布情况, Western Blot法检测结直肠癌组织中DCAF7蛋白水平，实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测结直肠癌组织中miR-98-3p水平, Pearson法分析DCAF7与miR-98-3p表达的相关性。
结果结直肠癌患者癌组织中DCAF7表达水平(0.61±0.11)上调, miR-98-3p表达水平(1.93±0.34)下调(P < 0.05); 结直肠癌组织中DCAF7和miR-98-3p的表达水平呈显著负相关(r=-0.376, P < 0.05); 受试者工作特征(ROC)曲线显示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量评估结直肠癌的曲线下面积(AUC)分别为0.864、0.835, 对应的敏感度分别为82.86%、90.00%, 特异度分别为78.57%、68.57%。二者联合评估结直肠癌的AUC为0.952, 敏感度为97.14%, 特异度为77.14%。
结论DCAF7在结直肠癌组织中显著高表达, miR-98-3p呈低表达，二者显著负相关，且与结直肠癌患者部分临床病理特征密切相关。DCAF7和miR-98-3p有望成为结直肠癌诊断的潜在指标。
Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of DCAF7 and miR-98-3p in colorectal cancer and the clinicopathological characteristics.
MethodsA total of 70 patients with colorectal cancer who underwent radical resection in Liaoning Cancer Hospital were selected as research objects. Colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues were collected during the operation. Immunohistochemical staining method was used to detect the distribution of DCAF7 in colorectal cancer tissues, western blot method was used to detect the level of DCAF7 protein in colorectal cancer tissues, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method was used to detect the level of miR-98-3p in colorectal cancer tissues, Pearson method was used to analyze the correlation between DCAF7 and miR-98-3p expression.
ResultsThe expression level of DCAF7 [(0.61±0.11)] in cancer tissues of patients with colorectal cancer was significantly up-regulated, and the expression level of miR-98-3p [(1.93±0.34)] was significantly down-regulated (P < 0.05); the expression levels of DCAF7 and miR-98-3p in colorectal cancer tissues were significantly negatively correlated (r=-0.376, P < 0.05); receiver operating characteristic (ROC) curve results showed that the area under the curve (AUC) of peripheral blood DCAF7 protein and miR-98-3p content in evaluating colorectal cancer were 0.864 and 0.835, respectively, with corresponding sensitivity of 82.86% and 90.00%, specificity of 78.57% and 68.57%, respectively. The AUC of their combined evaluation of colorectal cancer was 0.952, the sensitivity was 97.14%, and the specificity was 77.14%.
ConclusionDCAF7 is significantly highly expressed in colorectal cancer tissues, while miR-98-3p is lowly expressed in colorectal cancer tissues, which is negatively correlated with DCAF7 and miR-98-3p, and is closely related to some clinicopathological features of colorectal cancer patients. DCAF7 and miR-98-3p are expected to be potential indicators for the diagnosis of colorectal cancer.
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Keywords:
- colorectum /
- DCAF7 protein /
- miR-98-3p /
- pathological features
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结直肠癌(CRC)是最普遍的恶性肿瘤之一，主要影响患者胃肠道，尤其是结肠、直肠和盲肠[1]。饮食习惯、炎症反应、DNA改变、遗传多态性、基因-环境相互作用和微生物群组成的变化等被认为是CRC发展的潜在危险因素[2]。尽管诊断和治疗技术不断改进，但许多CRC患者的临床结果和预后仍然较差[3]。此外，可用于准确预测早期CRC的可靠标志物较少，使其诊断和治疗具有一定难度[4]。微小RNA(miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的小型非编码单链RNA, 在肿瘤的发生、转移中发挥重要作用。miRNA表达的改变与包括CRC在内的各种癌症之间有密切关系[5], 故miRNA可能对CRC患者具有重要的诊断和预后价值。研究[6]表明, miR-98-3p在肺癌、肝癌等多种肿瘤组织和细胞中呈低表达，并在肿瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥负性调控作用。miR-98在结肠癌患者的癌组织中低表达，与肿瘤恶性程度呈负相关[7]。DNA损伤结合蛋白1和CUL4相关因子(DCAF)家族可通过对其靶蛋白进行泛素化修饰，实现对细胞生长、分化、凋亡等生命活动的调控。其中, DCAF7是DCAF家族蛋白的主要成员之一, DCAF7主要参与调控细胞增殖分化[8], 但目前关于DCAF7在结直肠癌中表达的研究较少。因此，本研究通过检测结直肠癌组织中DCAF7、miR-98-3p的表达情况，探讨二者在结直肠癌组织中的作用及与临床病理特征的相关性，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年6月—2018年6月辽宁省肿瘤医院收治的结直肠癌患者70例为研究对象，收集其术中切除的结直肠癌组织及癌旁正常组织。70例患者中男32例，女38例，年龄30~52岁，平均(37.50±1.40)岁。纳入标准: ①经影像学检查、病理检查确诊为结直肠癌的患者; ②首发肿瘤者; ③病理资料完整者。排除标准: ①严重心、肝、肾疾病，以及感染性疾病、其他恶性肿瘤患者; ②术前接受过放疗、化疗及生物治疗者。本研究所有患者及家属均被告知，并获得患者的知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。
1.2 方法
1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测组织中miR-98-3p水平
使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取组织中总RNA，使用分光光度计(NanoDrop Technologies，美国)对RNA进行定量，并进行逆转录得到cDNA(逆转录反应程序为16 ℃ 30 min, 42 ℃ 42 min, 85 ℃ 5 min)。该cDNA作为RNA扩增的模板，采用qRT-PCR法对miR-98-3p进行扩增(qRT-PCR反应程序为94 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 共设40个循环), miR-98-3p以U6作为内参，使用2-△△Ct方法对mRNA水平进行定量分析。miR-98-3p及内参引物序列见表 1。miR-98-3p以患者的肿瘤组织相对表达水平中位数为临界值，超过该范围则判定为高表达。
表 1 qRT-PCR引物序列基因 正向引物5′-3′ 反向引物5′-3′ miR-98-3p GGGGTGAGGTAGTAAGTTGT TGCGTGTCGTGGAGTC U6 GCGCGTCGTGAAGCGTTC GTGCAGGGTCCGAGGT 1.2.2 免疫组织化学染色观察组织中DCAF7蛋白表达
所有手术切除标本的石蜡包埋块被切成4 μm厚的切片，并安装在载玻片上。切片使用二甲苯脱蜡并在酒精中脱水。将组织切片与0.3%过氧化氢孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶活性。然后进行抗原修复，组织切片在微波炉中10 mmol/L柠檬酸缓冲液中煮沸10 min后，用10%正常兔血清缓冲液孵育20 min以阻断非特异性结合位点。柠檬酸修复抗原后，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min, 加入一抗(DCAF7兔多克隆抗体)4 ℃孵育过夜。PBS冲洗，加入二抗37 ℃孵育15 min, 进行DAB染色以及苏木精复染后脱水、透明、封片。根据切片的染色强度以及阳性细胞百分比进行评分: 0分为无阳性细胞; ≤25%的阳性细胞为1分; >25%~50%阳性细胞为2分, >50%阳性细胞为3分。染色强度: 无染色为0分，浅黄色为1分，黄褐色为2分，深褐色为3分。综合计分为以上2种评分相加, ≤3分判定为阴性, >3分判定为阳性。
1.2.3 Western blot法检测DCAF7蛋白水平
用RIPA裂解缓冲液(Pierce, 美国)裂解组织样本，然后收集裂解液，用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司，中国)定量。使用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后，转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在室温下在3%脱脂奶粉中封闭30 min, 随后与一抗DCAF7(1∶ 1 000, Sigma-Aldrich, 美国)和GAPDH(1∶ 5 000, Proteintech, 中国)4 ℃孵育过夜，洗膜缓冲液(TBST)清洗10 min, 然后加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1∶ 10 000, 苏州赛维斯生物科技有限公司，中国)室温1 h。检测使用ECL蛋白质印迹检测试剂(美国密理博)进行，将印迹的特定蛋白质表达水平标准化为GAPDH。Image J软件用于分析条带密度。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学分析，计数资料采用[n(%)]表示，行卡方(χ2)检验; 计量资料均呈正态分布，用(x±s)表示, 2组比较行t检验; DCAF7与miR-98-3p表达水平与结直肠癌患者临床病理参数的关系采用χ2检验。受试者工作特征(ROC)曲线评价外周血DCAF7、miR-98-3p含量对结直肠癌的诊断价值。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 结直肠癌组织及癌旁组织中DCAF7蛋白的表达情况
结直肠癌组织中DCAF7蛋白的阳性表达率为71.43%(50/70), 癌旁组织中阳性表达率为8.57%(6/70), 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 1、表 2。
表 2 结直肠癌组织及癌旁组织中DCAF7蛋白阳性表达情况组织 n DCAF7蛋白 阴性 阳性 结直肠癌组织 70 20(28.57) 50(71.43) 癌旁组织 70 64(91.43) 6(8.57) χ2 — 57.619 P — < 0.001 2.2 结直肠癌组织及癌旁组织中DCAF7蛋白水平
结直肠癌患者癌组织中DCAF7蛋白的表达水平为(0.61±0.11), 高于癌旁组织的(0.19±0.02), 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 2。
2.3 结直肠癌组织及癌旁组织中miR-98-3p水平比较
结直肠癌组织中miR-98-3p表达水平为(1.93±0.34), 低于癌旁组织的(3.67±0.71), 差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.4 结直肠癌患者癌组织中DCAF7、miR-98-3p表达的相关性
分析结果显示，结直肠癌患者癌组织中DCAF7、miR-98-3p表达呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.376, P < 0.05)。见图 3。
2.5 DCAF7蛋白和miR-98-3p表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系
结果显示，结直肠癌患者癌组织中DCAF7蛋白的表达与患者性别、年龄以及肿瘤直径、肿瘤位置、浸润程度无关(P>0.05), 与淋巴结转移、TNM分期和分化程度有关(P < 0.05); miR-98-3p表达与患者的性别、年龄、浸润程度以及肿瘤位置无关(P>0.05), 与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤直径和分化程度有关(P < 0.05)。见表 3。
表 3 结直肠癌组织中DCAF7蛋白、miR-98-3p的表达与临床病理参数的关系临床病理特征 分类 n miR-98-3p χ2 P DCAF7 χ2 P 高表达 低表达 阳性 阴性 年龄 >55岁 32 14 18 0.272 0.602 20 12 2.303 0.129 ≤55岁 38 19 19 30 8 性别 男 36 15 21 0.892 0.345 25 11 0.143 0.705 女 34 18 16 25 9 肿瘤位置 结肠 39 20 19 0.605 0.436 26 13 0.978 0.323 直肠 31 13 18 24 7 淋巴结转移 是 45 15 30 9.643 0.002 40 5 18.822 < 0.001 否 25 18 7 10 15 TNM分期 Ⅰ+Ⅱ 25 21 4 21.201 < 0.001 11 14 14.336 < 0.001 Ⅲ+Ⅳ 45 12 33 39 6 分化程度 高分化 10 7 3 6.058 0.048 4 6 9.580 0.008 中分化 24 14 10 15 9 低分化 36 12 24 31 5 浸润程度 T1~T2 20 13 7 3.583 0.058 14 6 0.028 0.867 T3~T4 50 20 30 36 14 肿瘤直径 ≥5 cm 37 10 27 12.745 < 0.001 29 8 1.857 0.173 < 5 cm 33 23 10 21 12 2.6 结直肠癌组织中DCAF7蛋白和miR-98-3p水平对结直肠癌的诊断价值
ROC曲线显示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量评估结直肠癌的曲线下面积(AUC)分别为0.864(95%CI: 0.796~0.916)、0.835(95%CI: 0.763~0.892), 对应的敏感度分别为82.86%、90.00%, 特异度分别为78.57%、68.57%。二者联合评估结直肠癌的AUC为0.952(95%CI: 0.902~0.981), 敏感度为97.14%, 特异度为77.14%。见图 4。
3. 讨论
CRC是全球第三大最常见的癌症类型[9]。结直肠癌的发生发展与生活方式、遗传因素、结直肠腺瘤密切相关。该病的病因与个体基因突变有关，包括不同类型的染色体突变和DNA错配修复[10]。近年来，新的治疗方法和诊断技术的开发和应用，显著降低了CRC的病死率。然而, CRC的发病机制尚不完全清楚。
miRNA在细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用，其异常表达与肿瘤的发生发展有密切关系[11]。研究[12-14]表明, CRC中miR-143和miR-145表达显著下调，提示miRNA可能成为CRC治疗中潜在的基因治疗靶点。研究[15]表明, miR-98在多种肿瘤中呈低表达，与口腔鳞状细胞癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌等的转移有关，例如miR-98通过靶向一型胰岛素样生长因子受体(IGF1R)表达来抑制口腔鳞状细胞癌的增殖和转移。此外, miR-98通过下调整合素B3(ITGB3)抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭。miR-98-3p是miR-98家族重要成员，在本研究中，结直肠癌组织中miR-98-3p水平低于癌旁组织，结直肠癌患者癌组织中miR-98-3p表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置和浸润程度无关，与TNM分期、分化程度、肿瘤直径以及淋巴结转移有关。上述结果提示miR-98-3p与结直肠癌的恶性程度相关，并参与结肠癌的发生发展进程。
DCAF蛋白家族是机体维持正常生长发育的重要蛋白质家族，参与细胞增殖分化、凋亡等一系列调控，该家族已累计发现60种蛋白，其蛋白过表达或缺失与临床许多肿瘤、发育障碍等的发生发展关系密切，为肿瘤的临床治疗提供更多方向[7]。磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)是调节细胞增殖和分化之间平衡的一个重要激酶。研究[16]发现, DCAF7与DYRK1A互相作用，参与维持其稳定性。但目前关于DCAF7在结肠癌中的研究较少。本研究中，结直肠癌组织中DCAF7蛋白水平显著高于癌旁组织，结直肠癌组织中DCAF7蛋白阳性表达率为71.43%, 癌旁组织中DCAF7阳性表达率为8.57%; 结直肠癌患者癌组织中DCAF7蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径和浸润程度无相关性，与TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有相关性，提示DCAF7蛋白也与结直肠癌的恶性程度相关。研究进一步发现，结直肠癌组织中DCAF7与miR-98-3p表达水平呈明显负相关，推测二者之间存在某种负调控关系，共同参与结直肠癌的发生发展。ROC曲线显示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量评估结直肠癌的AUC分别为0.864、0.835, 对应的敏感度分别为82.86%、90.00%, 特异度分别为78.57%、68.57%。二者联合评估结直肠癌的AUC为0.952, 敏感度为97.14%, 特异度为77.14%。这表明DCAF7与miR-98-3p有望成为结直肠癌诊断的潜在指标。
综上所述, DCAF7在结直肠癌组织中高表达, miR-98-3p呈低表达，二者呈负相关，可作为判断结直肠癌患者病情发展的潜在生物指标，二者的表达可对患者临床病理特征进行一定的判断分析，但二者在结直肠癌患者中的确切机制有待进一步研究。
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表 1 qRT-PCR引物序列
基因 正向引物5′-3′ 反向引物5′-3′ miR-98-3p GGGGTGAGGTAGTAAGTTGT TGCGTGTCGTGGAGTC U6 GCGCGTCGTGAAGCGTTC GTGCAGGGTCCGAGGT 
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表 2 结直肠癌组织及癌旁组织中DCAF7蛋白阳性表达情况
组织 n DCAF7蛋白 阴性 阳性 结直肠癌组织 70 20(28.57) 50(71.43) 癌旁组织 70 64(91.43) 6(8.57) χ2 — 57.619 P — < 0.001
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表 3 结直肠癌组织中DCAF7蛋白、miR-98-3p的表达与临床病理参数的关系
临床病理特征 分类 n miR-98-3p χ2 P DCAF7 χ2 P 高表达 低表达 阳性 阴性 年龄 >55岁 32 14 18 0.272 0.602 20 12 2.303 0.129 ≤55岁 38 19 19 30 8 性别 男 36 15 21 0.892 0.345 25 11 0.143 0.705 女 34 18 16 25 9 肿瘤位置 结肠 39 20 19 0.605 0.436 26 13 0.978 0.323 直肠 31 13 18 24 7 淋巴结转移 是 45 15 30 9.643 0.002 40 5 18.822 < 0.001 否 25 18 7 10 15 TNM分期 Ⅰ+Ⅱ 25 21 4 21.201 < 0.001 11 14 14.336 < 0.001 Ⅲ+Ⅳ 45 12 33 39 6 分化程度 高分化 10 7 3 6.058 0.048 4 6 9.580 0.008 中分化 24 14 10 15 9 低分化 36 12 24 31 5 浸润程度 T1~T2 20 13 7 3.583 0.058 14 6 0.028 0.867 T3~T4 50 20 30 36 14 肿瘤直径 ≥5 cm 37 10 27 12.745 < 0.001 29 8 1.857 0.173 < 5 cm 33 23 10 21 12
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