Analysis in expression profiles of circular RNA in plasma in children with pediatric type 2 spinal muscular atrophy
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摘要:目的
分析儿童脊髓性肌萎缩症(SMA)2型患者血浆中环状RNA (circRNA)的表达谱变化。
方法选取2021年9月—2022年3月安徽省儿童医院神经内科住院治疗的儿童SMA2型患者5例为SMA组, 同期健康对照者5例为对照组。采用高通量测序技术检测并筛选出血浆中差异表达的circRNA, 应用生物信息学进行基因本体论(GO)注释、京都基因和基因组百科全书(KEGG)和Reactome通路富集分析。利用在线数据库预测circRNA可能靶向的微小RNA (miRNA)。
结果与对照组相比, SMA组患者血浆中共有136个circRNA呈显著差异性表达(P < 0.05, 差异倍数≥1.5), 包括55个表达上调和81个表达下调的circRNA。生物信息学分析发现，同源重组修复、DNA复制等通路在SMA的发生发展中具有重要作用。应用TargetScan和miRanda软件预测了差异表达circRNA与miRNA的关系，绘制了circRNA-miRNA调控网络图。
结论SMA组与对照组存在差异表达的circRNA。这些circRNA可能参与SMA的发生、发展，或可成为SMA的新型诊断和治疗的潜在分子标志物。
Abstract:ObjectiveTo analyze the change of expression profiles of circular RNA (circRNA) in plasma of children with pediatric type 2 spinal muscular atrophy (SMA).
MethodsFrom September 2021 to March 2022, five hospitalized children with pediatric type 2 SMA in the Department of Neurology of Anhui Provincial Children's Hospital were selected as SMA group, and five healthy controls in the same period were selected as control group. High throughput sequencing technology was used to detect and screen the differentially expressed circRNA in plasma, and bioinformatics was used for gene ontology (GO) annotation, the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and Reactome pathway enrichment analyses. Online database was used to predict the microRNAs (miRNA) that circRNA may target.
ResultsCompared with the control group, a total of 136 circRNA were significantly differentially expressed in the plasma of children with SMA (P < 0.05, fold change≥1.5), including 55 up-regulated and 81 down-regulated circRNA. Bioinformatics analysis revealed that pathways such as homologous recombination repair and DNA replication play important roles in the occurrence and development of SMA. TargetScan and miRanda software were used to predict the relationship between differentially expressed circRNA and miRNA, and the picture of the circRNA-miRNA regulatory networks was drawn.
ConclusionThere are differentially expressed circRNA between the SMA group and the control group. These circRNA may be involved in the occurrence and development of SMA, and may become potential molecular markers for novel diagnosis and treatment of SMA in the future.
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胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，部分患者就诊时已经出现远处转移，预后不佳[1], 因此探索胃癌远处转移的分子机制至关重要。微小RNA(miRNA)在肿瘤进展过程中发挥重要调控作用，多种miRNA已被发现在胃癌组织中差异表达，参与胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移过程[2-5]。微小RNA-1291(miR-1291)是近年来发现的一种非编码RNA, 参与调控肿瘤细胞的增殖与转移[6]。CAI Q等[7]研究发现, miR-1291在前列腺癌组织中低表达，上调miR-1291可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，但miR-1291与胃癌的关系尚不明确。BMP激活素膜结合抑制因子(BAMBI)基因编码的蛋白位于细胞膜，通过调控多种信号通路参与肿瘤进展过程，例如沉默BAMBI基因的结肠癌细胞侵袭能力会增强[8], 但也有研究[9]表明沉默BAMBI可抑制胃癌细胞的侵袭能力。BAMBI已被证实与多种miRNA存在靶向关系，但miR-1291与BAMBI的靶向关系尚不明确。本研究基于细胞实验探讨miR-1291对胃癌细胞恶性表型的调控作用及其与BAMBI的靶向关系，以期为胃癌的靶向治疗提供新的靶点。
1. 材料与方法
1.1 基于公共数据库分析miR-1291在胃癌组织、正常胃组织中的表达
通过GEO数据库在线工具GEO2R分析GSE54129数据集中正常胃黏膜组织标本与胃癌组织标本的miR-1291表达水平。
1.2 细胞、试剂及仪器
人胃癌细胞SGC-7901(上海酶研生物科技有限公司)，人胃黏膜上皮细胞GES-1(苏州海星生物有限公司); 黑胶虫清除基础培养基(RPMI)1640(北京诺博莱德科技有限公司), Lipofectamine 2000试剂(上海复申生物科技有限公司), miR-1291 mimic质粒(过表达miR-1291)、miR-NC质粒、miR-1291 inhibitor质粒(抑制剂)、miR inhibitor空质粒、BAMBI mimic质粒(过表达BAMBI)、Vector质粒(过表达空载)、sh-BAMBI质粒(敲低BAMBI)、sh-NC质粒(敲低空白对照)、野生型(WT)-BAMBI和突变型(MUT)-BAMBI质粒、引物(沈阳万类生物有限公司)，TRIzol试剂(北京普利莱基因技术有限公司); miRNA逆转录、荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(日本TARKARA生物有限公司)，兔抗人BAMBI、转化生长因子-β(TGF-β)和SMAD同源物4(SMAD4)一抗、鼠抗兔二抗(沈阳万类生物有限公司), CCK-8试剂盒(天津赛东南生物有限公司), Transwell小室(中乔新舟生物有限公司)，Matrigel基质胶(MatriClone公司)，双荧光素酶报告系统(MCE公司); ABI Q5型号PCR仪(美国ABI公司)，酶标仪(郑州基波新科技有限公司)、光学显微镜(日本奥林巴斯)。
1.3 细胞培养、转染及分组
使用RPMI 1640培养基培养SGC-7901细胞和GES-1细胞，培养条件为5%CO2, 37 ℃。SGC-7901细胞系是胃癌细胞系，未污染, 1个月检测1次明确无支原体感染。将miR-1291 mimic质粒、miR-NC质粒、miR-1291 inhibitor质粒、miR inhibitor质粒分别转染至取传3代的SGC-7901细胞，依次设为miR-1291组、miR-NC组、miR-1291 inhibitor组、miR inhibitor组。将BAMBI mimic质粒、Vector质粒、sh-BAMBI质粒、sh-NC质粒分别转染至细胞中，依次设为BAMBI组、Vector组、sh-BAMBI组、sh-NC组。将各组细胞继续培养24 h后进行后续实验。
1.4 CCK-8实验
将SGC-7901细胞接种至96孔板中(2 000个/孔)，分别于培养24、48、72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL, 37 ℃孵育30 min, 上机检测450 nm处光密度(OD)值。
1.5 Transwell实验
迁移实验: 首先用无血清培养基制备单细胞悬液，将1×105个细胞种植到Transwell小室(8 μm)的上室中，下室中加入正常RPMI 1640培养基。侵袭实验: 预先在上室中铺入4%基质胶, 37 ℃孵育10 min, 其余步骤同迁移实验。继续培养48 h后去除培养基，去除上室中的细胞，洗涤3次，用4%多聚甲醛固定10 min, 洗涤3次，用0.1%结晶紫染色3 min, 洗涤3次后晾干，拍照。
1.6 实时荧光定量PCR反应
提取各组细胞总RNA, 鉴定RNA浓度及纯度，然后逆转录成cDNA, 反应条件为30 ℃ 10 min, 42 ℃ 30 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min。按照Mir-X miRNA qRT-PCR TB GreenⓇ Kit及TB GreenⓇ Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)试剂盒说明进行PCR, 循环条件为95℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 共40个循环，构建溶解曲线，相对表达量用2-△△Ct法计算。内参使用GAPDH、U6。引物序列如下: miR-1291上游引物5′-CGTGGCCCTGACTG AAGACC-3′, 下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAG GTATT-3′; U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3′, 下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′; BAMBI上游引物5′-CCCAGTGGTACTTTGGTGCC-3′, 下游引物5′-GCGGTCATGTACTTCTGTCCC-3′; GAPDH上游引物5′-CCTTGCACATGCCGGAG-3′, 下游引物5′-GCACAGAGCCTCGCCTT-3′。
1.7 蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞BAMBI、TGF-β、SMAD4蛋白表达
收集各组细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，测蛋白浓度。配制5%浓缩胶及10%分离胶，每孔中加入30 μg蛋白, 70 V电压下将蛋白转移到聚氟乙烯膜上, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入BAMBI (1∶1 000)、TGF-β(1∶1 000)、SMAD4 (1∶1 000)及β-actin (1∶1 000), 4 ℃冰箱过夜，第2天膜洗涤3次，加入对应的二抗室温孵育1 h, 洗涤3次，加入发光液，上机曝光，使用Image J软件分析条带灰度值，蛋白的相对表达量用目的蛋白与β-actin的比值表示。
1.8 在线网站预测miR-1291与BAMBI的靶向关系
通过TargetScan在线网站(http://www.targetscan.org/)预测miR-1291与BAMBI的靶向关系。
1.9 荧光素酶报告实验
将miR-1291 mimic质粒、miR-NC质粒分别与WT-BAMBI质粒、MUT-BAMBI质粒两两组合后转染至SGC-7901细胞中，设为miR-1291+WT-BAMBI组、miR-1291+MUT-BAMBI组、miR-NC+WT-BAMBI组、miR-NC+MUT-BAMBI组。继续培养48 h后，检测各组细胞荧光素酶相对活性。
1.10 统计学分析
采用SPSS 20.00软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析, 2组间比较采用LSD-t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 胃癌组织、正常胃组织miR-1291表达情况
公共数据库分析结果显示，胃癌组织的miR-1291表达水平为(0.85±0.11), 低于正常胃组织的(2.02±0.23), 差异有统计学意义(t=18.33, P < 0.01)。
2.2 SGC-7901、GES-1细胞miR-1291表达情况
SGC-7901细胞miR-1291表达水平低于GES-1细胞，差异有统计学意义(t=10.74, P < 0.01), 见图 1。
2.3 各组细胞miR-1291表达情况
miR-1291组细胞miR-1291表达水平高于miR-NC组, miR-1291 inhibitor组细胞miR-1291表达水平低于miR inhibitor组，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 2。
2.4 miR-1291对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的影响
miR-1291组细胞72 h时OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数低于或少于miR-NC组, miR-1291 inhibitor组细胞72 h时OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数高于或多于miR inhibitor组，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 3。
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图 3 miR-1291对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的影响A: CCK-8实验结果; B: Transwell侵袭实验结果; C: Transwell迁移实验结果。2组比较, **P<0.01。2.5 SGC-7901、GES-1细胞的BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达情况
SGC-7901细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达水平高于GES-1细胞，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 4。
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图 4 SGC-7901、GES-1细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达情况A: Western blot检测BAMBI蛋白表达; B: BAMBI mRNA表达水平。两者比较, **P<0.01。2.6 各组细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达情况
BAMBI组细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达水平高于Vector组, sh-BAMBI组细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达水平低于sh-NC组，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 5。
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图 5 各组细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达情况A: Western blot检测BAMBI蛋白表达; B: BAMBI mRNA表达水平。2组比较, **P<0.01。2.7 BAMBI对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的影响
BAMBI组细胞72 h时OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数高于或多于Vector组, sh-BAMBI组细胞72 h时OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数低于或少于sh-NC组，差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 6。
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图 6 BAMBI对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的影响A: CCK-8实验结果; B: Transwell侵袭实验结果; C: Transwell迁移实验结果。2组比较, **P<0.01。2.8 miR-1291与BAMBI的靶向关系
生物学信息学分析发现, miR-1291与BAMBI存在碱基结合位点。miR-1291+WT-BAMBI组细胞荧光素酶活性低于miR-NC+WT-BAMBI组，差异有统计学意义(P < 0.01); miR-1291+MUT-BAMBI组细胞荧光素酶活性与miR-NC+MUT-BAMBI组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。miR-1291组细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达水平低于miR-NC组, miR-1291 inhibitor组细胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表达水平高于miR inhibitor组，差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 7。
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图 7 miR-1291与BAMBI的靶向关系A: miR-1291与BAMBI核苷酸碱基结合情况; B: 荧光素酶报告基因实验结果; C: Western blot检测BAMBI蛋白表达; D: BAMBI mRNA表达水平。2组比较, **P<0.01。2.9 BAMBI对细胞TGF-β、SMAD4蛋白表达的影响
BAMBI组TGF-β、SMAD4蛋白水平低于Vector组, sh-BAMBI组TGF-β、SMAD4蛋白水平高于sh-NC组，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 8。
3. 讨论
近年来，胃癌发病率逐年上升并呈现年轻化趋势，多数患者就诊时已经出现转移，尽管放化疗、手术及免疫疗法一定程度上改善了患者预后，但是总体预后仍不佳。因此，明确胃癌增殖、转移机制和寻找诊断生物学标志物、有效治疗靶点至关重要。研究[10]发现, miRNA在肿瘤细胞恶性生物学行为中扮演着重要角色。miR-1291位于SNORA34基因上，在多种肿瘤组织中差异表达，参与肿瘤进展[11-12]。WANG J Q等[13]发现，结直肠癌组织中miR-1291呈低表达，上调miR-1291可抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移。另有研究[14]发现, miR-1291与早期乳腺癌患者淋巴结转移有关。此外，黑色素瘤细胞来源的长链非编码RNA ELFN1-AS1可通过靶向调控巨噬细胞miR-1291表达，促进巨噬细胞的极化，进而抑制肿瘤生长[15]。本研究结果显示, miR-1291在胃癌细胞和胃癌组织中低表达，上调miR-1291可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，下调miR-1291可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示miR-1291是胃癌的抑癌基因。
miRNA一般通过与下游靶基因结合而发挥作用，研究[16-17]发现，雌激素相关受体α(ERRα)、人调停蛋白复合体亚基1(MED1)与miR-1291存在靶向关系。为进一步明确miR-1291的下游靶基因，本研究利用在线生物信息学工具进行预测，发现BAMBI可能是miR-1291的作用靶点，进一步行荧光素酶报告基因实验后证实两者存在靶向调控关系。BAMBI基因位于10号染色体，在调控细胞生理、病理及信号传递中扮演着重要角色。研究[18]发现，结肠癌组织中BAMBI呈高表达，沉默BAMBI可通过激活TGF-β/Smad通路抑制结直肠癌细胞的增殖与迁移。此外，上调BAMBI可增强肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力[17]。本研究结果显示, BAMBI在胃癌细胞中高表达，上调BAMBI可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，下调BAMBI可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示BAMBI是胃癌的促癌基因。TGF-β信号通路是细胞常见通路之一，在肿瘤细胞恶性生物学行为中发挥重要调控作用，同时参与调控胃癌上皮间质转化(EMT)过程[18], 靶向抑制该通路是目前治疗胃癌的方法之一。BAMBI细胞外蛋白结构与TGF-β相似，因而可与TGF-βⅠ型受体竞争性结合，且由于胞内结构没有磷酸酶活性，下游的Smads信号不能被磷酸化，最终抑制了TGF-β信号通路[19]。研究[20-21]证实, BAMBI与TGF-β信号通路存在调控关系。本研究结果显示，上调BAMBI后细胞TGF-β、SMAD4蛋白水平下降，反之TGF-β、SMAD4蛋白水平上升，与上述结论相符。
综上所述, miR-1291在胃癌细胞中低表达，上调miR-1291可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能是miR-1291负性调控BAMBI进而抑制TGF-β通路, miR-1291或可成为胃癌治疗的新靶点。本研究存在不足之处，例如未能利用临床样本资料验证miR-1291、BAMBI与胃癌临床病理特征及预后的关系，亦未通过动物实验进一步明确miR-1291、BAMBI对胃癌恶性生物学行为的影响，未来还需进一步深入研究加以验证。
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表 1 SMA组5例SMA患儿临床资料
临床资料 病例1 病例2 病例3 病例4 病例5 性别 女 男 女 男 女 就诊年龄 4岁9个月 3岁 10岁 3岁 12岁10个月 发病年龄 6个月 6个月 12个月 10个月 9个月 肌肉萎缩 + + + + + 骨骼畸形 + + + + + 肌张力 减弱 减弱 减弱 减弱 减弱 左肩-肘-腕-掌指肌力 4 3 2 2 3 右肩-肘-腕-掌指肌力 4 3 2 2 3 左髋-膝-踝-掌趾肌力 2 2 1 1 2 右髋-膝-踝-掌趾肌力 2 2 1 1 2 骨密度(胫骨中段) 0.6 1.3 -5.9 0.5 -1.8 
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表 2 SMA组与正常对照组差异表达的circRNA
环状RNA 染色体定位 基因名 表达情况 log2倍数变化 差异倍数 P hsa_circ_0024193 chr11 ATM 高 2.353 5.110 < 0.001 hsa_circ_0008833 chr6 SAMD3 高 2.098 4.281 0.001 hsa_circ_0000944 chr19 CCDC9 高 2.044 4.125 < 0.001 hsa_circ_0004137 chr14 RBM23 高 2.014 4.040 0.002 hsa_circ_0004751 chr17 AATF 高 1.934 3.821 0.007 hsa_circ_0005573 chr20 STK4 高 1.828 3.552 0.007 hsa_circ_0000615 chr15 ZNF609 高 1.812 3.511 < 0.001 hsa_circ_0007694 chr11 ATM 高 1.738 3.336 < 0.001 hsa_circ_0135062 chr7 ANKIB1 高 1.722 3.299 0.003 hsa_circ_0006956 chr10 CCSER2 高 1.709 3.269 0.004 hsa_circ_0005910 chr2 LTBP1 低 -2.624 0.162 < 0.001 hsa_circ_0009109 chr1 DCAF6 低 -2.320 0.200 0.002 hsa_circ_0076179 chr6 MAPK14 低 -2.084 0.235 0.003 hsa_circ_0028899 chr12 RNF10 低 -2.032 0.245 0.004 hsa_circ_0006809 chr14 CDC42BPB 低 -1.924 0.264 0.004 hsa_circ_0035957 chr15 DENND4A 低 -1.819 0.283 0.004 hsa_circ_0007017 chr7 KMT2C 低 -1.759 0.295 0.015 hsa_circ_0006272 chr10 CCAR1 低 -1.737 0.300 0.007 hsa_circ_0018403 chr10 SGMS1 低 -1.680 0.312 0.004 hsa_circ_0101926 chr14 KLHDC1 低 -1.665 0.315 0.015
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表 3 差异表达的circRNA与miRNA结合位点的预测结果
表达趋势 环状RNA 结合相关miRNA hsa_circ_0024193 hsa-miR-513a-3p hsa-miR-548c-3p hsa-miR-507 hsa-miR-557 hsa-miR-324-5p 上调 hsa_circ_0008833 hsa-miR-1234 hsa-miR-586 hsa-miR-155 hsa-miR-616 hsa-miR-598 hsa_circ_0000944 hsa-miR-1307 hsa-miR-548b-3p hsa-miR-942 hsa-miR-136 hsa-miR-361-3p hsa_circ_0004137 hsa-miR-876-3p hsa-miR-31 hsa-miR-619 hsa-miR-1208 hsa-miR-1178 hsa_circ_0004751 hsa-miR-1208 hsa-miR-623 hsa-miR-766 hsa-miR-513a-3p hsa-miR-224 下调 hsa_circ_0005910 hsa-miR-1258 hsa-miR-184 hsa-miR-485-3p hsa-miR-488 hsa-miR-623 hsa_circ_0009109 hsa-miR-1256 hsa-miR-624 hsa-miR-577 hsa-miR-579 hsa-miR-557 hsa_circ_0076179 hsa-miR-769-5p hsa-miR-203 hsa-miR-516b hsa-miR-657 hsa-miR-1288 hsa_circ_0028899 hsa-miR-1248 hsa-miR-647 hsa-miR-194 hsa-miR-31 hsa-miR-183 hsa_circ_0006809 hsa-miR-766 hsa-miR-1205 hsa-miR-1248 hsa-miR-578 hsa-miR-576-5p
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期刊类型引用(1)
1. 聂晓欢，张跃华，高亭午，张易欣，周玮月，李美艳，姜黎黎，王菊荣. 部分微小RNA在宫颈癌患者血清中的表达及早期筛查的意义研究. 中国医药. 2024(01): 97-101 . 
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