Effect of microRNA-142-3p targeting tumor necrosis factor-alpha on inflammatory response of human nasal epithelial cells induced by lipopolysaccharide
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摘要:目的
探讨微小RNA(miR)-142-3p对脂多糖(LPS)诱导的人鼻黏膜上皮细胞(HNEPC)炎症反应的影响及其与TNF-α的靶向关系。
方法选取HNEPC为研究对象，使用LPS诱导建立炎症反应模型。将miR-142-3p上调、miR-142-3p下调、空质粒转染至细胞，分为对照组、LPS组、miR-142-3p上调组、miR-142-3p下调组、空质粒组; 将TNF-α下调、下调对照质粒分别与miR-142-3p上调质粒共同转染至细胞，记为miR-142-3p上调+TNF-α下调组、空质粒+TNF-α下调组、miR-142-3p上调组和空质粒组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力; 采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-142-3p和白细胞介素(IL)-6、IL-10、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA水平; 采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α含量; 通过TargetScan网站、荧光素酶报告实验分析miR-142-3p与TNF-α的靶向关系。
结果LPS组细胞增殖能力高于对照组, miR-142-3p上调组细胞增殖能力高于空质粒组, miR-142-3p下调组细胞增殖能力低于空质粒组，差异有统计学意义(P < 0.05)。LPS组细胞IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α蛋白及其mRNA表达水平高于对照组, miR-142-3p上调组细胞相关炎性因子表达水平高于空质粒组, miR-142-3p下调组细胞相关炎性因子表达水平低于空质粒组，差异有统计学意义(P < 0.05)。TNF-α下调组细胞IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α mRNA及细胞上清液中蛋白表达水平低于下调对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。miR-142-3p与TNF-α具有良好的靶向关系。
结论miR-142-3p在慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻黏膜组织中高表达，过表达miR-142-3p可促进LPS诱导HNEPC炎性反应，可能与上调TNF-α基因表达有关。
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关键词:
- 微小RNA-142-3p /
- 肿瘤坏死因子-α /
- 脂多糖 /
- 人鼻黏膜上皮细胞 /
- 炎症反应
Abstract:ObjectiveTo observe the effect of microRNA (miR)-142-3p on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response in human nasal mucosal epithelial cells (HNEPC) and its targeting relationship with TNF-α.
MethodsHNEPC were selected, and an inflammatory response model was established by LPS induction. The miR-142-3p up-regulated, miR-142-3p down-regulated and empty plasmid were transfected into cells, which were divided into control group, LPS group, miR-142-3p up-regulated group, miR-142-3p down-regulated group and empty plasmid group; TNF-α down-regulated and down-regulated control plasmids and miR-142-3p up-regulated plasmids were co-transfected into cells, respectively, and were labeled as miR-142-3p up-regulated +TNF-α down-regulated group, empty plasmid+TNF-α down-regulated group, miR-142-3p up-regulated group and empty plasmid group. Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) was used to detect cell proliferation; the real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the mRNA levels of miR-142-3p, interleukin (IL)-6, IL-10, interferon-γ (IFN-γ) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α); the contents of IL-6, IL-10, IFN-γ and TNF-α in the supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay; the targeting relationship between miR-142-3p and TNF-α was analyzed by TargetScan website and luciferase report experiment.
ResultsThe cell proliferation capacity of the LPS group was significantly higher than that of the control group, was significantly higher in the miR-142-3p up-regulated group than that of the empty plasmid group, and was significantly lower in the miR-142-3p down-regulated group than that of the empty plasmid group (P < 0.05). The expression IL-6, IL-10, IFN-γ and TNF-α proteins levels and their mRNA levels in the LPS group were significantly higher than those in the control group, the expression levels of cell-related inflammatory factors in miR-142-3p up-regulated group were significantly higher than those in the empty plasmid group, and the expression level of cell-related inflammatory factors in the miR-142-3p down-regulated group was significantly lower than that in the empty plasmid group (P < 0.05). The mRNA expression levels of IL-6, IL-10, IFN-γ and TNF-α and the protein expression levels of cell supernatant in the TNF-α down-regulated group were significantly lower than those in the down-regulated control group (P < 0.05). MiR-142-3p had a good targeting relationship with TNF-α.
ConclusionThe miR-142-3p is highly expressed in nasal mucosa tissues of patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. Overexpression of miR-142-3p can promote LPS-induced HNEPC inflammatory response, which may be related to up-regulation of gene expression.
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氡(Rn)是一种无色、无味、无臭的天然放射性气体，通常由地壳中的镭和铀衰变产生，与人们的工作和生活环境密切相关。Rn的同位素大约有40种，与人类健康关系最密切的是222Rn。222Rn是226Ra和238U的衰变产物，主要存在于地壳含量最丰富的花岗岩和黏土铀中[1]。Rn的半衰期为3.8 d, 经过衰变后释放出α粒子, α粒子通过呼吸道进入人体，在支气管上皮细胞和肺上皮细胞沉积并产生内照射引起双链DNA断裂和染色体畸变。同时，产生的活性氧对DNA造成间接损伤，导致细胞周期缩短、凋亡，增大癌变可能性[2]。
肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，对人类的健康危害较大。相关统计数据显示, 2020年全球肺癌死亡病例数占所有癌症死亡病例数的18%, 肺癌患病人数占癌症总病例数的11.4%[3]。流行病学调查研究证明，高浓度Rn的暴露人群主要是铀矿工人。北美和欧洲的联合铀矿工队列研究结果显示，加拿大、德国和墨西哥每100个工作水平月(WLM)肺癌发生的超额相对危险度(ERR)为0.96(95%CI为0.56~1.56)、0.19(95%CI为0.16~0.22)、1.8(95%CI为0.7~5.4)[4]; 法国和捷克为0.73(95%CI为0.32~1.33)[5]、0.54(95%CI为0.33~0.83)[6]。日常生活中，较低浓度的Rn对普通人群的健康几乎无影响。然而，在封闭的空间中, Rn的浓度会随着时间的延长而积累，增加对人体健康的危害。一项对西班牙保加利亚地区居民室内Rn暴露和肺癌发病风险关系的Meta分析[7]发现，居民Rn暴露量与肺癌发生风险呈显著正相关(OR=1.48, 95%CI为1.26~1.73)。另外，挪威的一项关于家庭Rn暴露与肺癌的研究[8]也表明，每增加100 Bq/m3 Rn辐射，肺癌发生风险增大1.14%。以上研究结果均证明，室内Rn浓度的升高会增大患肺癌的风险。
在Rn暴露的动物模型和细胞恶性转化中均发现，长时间Rn暴露会造成肺损伤[9-12], 长期低剂量Rn暴露会诱发上皮间质转化[13]、线粒体损伤[11, 14-15]和表观遗传改变[16-20]等生物学效应。近年来，虽然Rn致肺癌的机制研究取得了很大的进展，但是这些研究尚不能具体阐明Rn致肺癌的作用机制。
非编码RNA是一类不能对蛋白质进行编码的RNA分子[21]。研究[22]显示，人类基因组中大约有2%的基因可以编码蛋白质，剩下大部分基因则进行转录形成非编码RNA。根据非编码RNA的长度可以将其分为微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)。在Rn暴露致肺癌的作用机制相关研究中，非编码RNA的研究内容主要集中于miRNA。
1. miRNA在Rn致肺癌中的研究进展
据估计, miRNA可以调控人类大约30%的蛋白编码基因。miRNA能够识别特定的目标信使RNA(mRNA), 转录后能够发挥促进靶mRNA的降解和(或)抑制翻译过程中调控基因表达的作用[23]。同时, Rn的同位素衰变产生的电离辐射引起DNA断裂，导致染色体重排和某些miRNA分子的变化[24]。因此, Rn暴露致肺癌的发生和发展中，表达水平发生变化的miRNA可能成为预防Rn致肺癌的潜在靶点。
CUI F M等[25]利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)作为研究对象进行长期Rn暴露建立细胞恶性转化模型。该细胞模型中有378个miRNA发生异常表达。DANG X H等[24]通过α粒子照射BEAS-2B细胞，建立了长期低剂量恶性转化细胞模型，从6组不同剂量的BEAS-2B恶性转化模型中筛选出了5个有差异表达的miRNA, 包括hsa-miR-3907、hsa-miR-6732-3P、hsa-miR-4788、hsa-miR-5001-5p和hsa-miR-4257。同时, SUN L等[26]研究发现，长期Rn暴露矿工的外周血中miR-19a、miR-30e、miR-335和miR-451a的表达明显降低。以上研究提示, miRNA在Rn暴露诱导的肺癌中发挥重要作用。
研究[27-37]发现, miR-let-7、miR-194-3p、miR-34和miR-200在长期Rn暴露的模型中参与了细胞的增殖、分化和恶性转化。研究[27]显示, let-7在多种癌症中的蛋白水平表达较低，并在肺癌的发生、发展过程中发挥着抑癌作用。let-7可以抑制原癌基因Kirsten-Rous肉瘤病毒(K-RAS)、高迁移率族蛋白A2(HMGA2)、原癌基因蛋白质C-MYC、编码区决定子结合蛋白(CRD-BP)等细胞周期相关基因和阻断细胞周期相关蛋白D2的表达。CHEN Z H等[28]研究发现，长期Rn暴露的大鼠肺组织和人支气管上皮细胞(HBE)中let-7a-2p/let-7b-3p表达量均下调，并且let-7a-2p/let-7b-3p表达量下调程度与Rn暴露浓度呈明显的剂量依赖性。
Rn暴露的BEAS-2B细胞恶性转化模型[29]发现, miR-194-3p表达水平明显降低，通过下调骨形态发生蛋白1(BMP1)抑制转化生长因子β(TGFβ)的活性水平，进而降低基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的活性，加快细胞恶性化进程。WU J等[30]利用Rn暴露的BEAS-2B建立细胞恶性转化模型发现, miR-34a表达量明显增高，促凋亡蛋白BCL-2相关X蛋白(Bax)表达增加以及抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)的表达量降低。
在α粒子诱导的人乳头状病毒永生化的人支气管上皮细胞(BEP2D)转化模型[31]中, miR-200家族的表达显著下调，同时其转录因子E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)、E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)和间质相关标志神经-钙连接素(N-cad)mRNA的表达显著上调。过表达的miR-200可以下调ZEB家族的表达，并抑制肿瘤细胞上皮间质转化和侵袭转移能力。高刚[32]在高Rn暴露地区居民肺癌组织中也发现, miR-200a/200b的表达显著下调，与α粒子诱导BEP2D恶性转化中miR-200的表达结果相似，提示miR-200家族在Rn致肺癌过程中具有重要作用。
2. 其他非编码RNA在Rn致肺癌中的作用
lncRNA作为非编码RNA参与转录调控、细胞内物质转运、染色体重构和表观遗传调控等生物过程, 在细胞分化、生长发育、应激反应和疾病的发生和发展中起着重要作用[33], 是近年来发现的新兴癌症生物标志物[34]。在肺癌发病机制的研究中，很多学者对lncRNA开展研究，但关于Rn暴露的相关研究较少。目前只发现1项研究[35]探讨了lncRNA在Rn暴露后的肺损伤中作用。该研究发现, Rn暴露的大鼠肺组织中约有1 000个lncRNA表达失调，并对Rn暴露后表达上调的lncRNA-FR052959进行了深入研究，结果表明, lncRNA-FR05295通过表皮生长因子受体(ErbB)信号通路调控非受体酪氨酸激酶C-abl的表达，提示lncRNA-FR05295可能在Rn暴露的肺损伤中起重要作用。
circRNA作为一种共价闭合的非编码RNA，其表达在组织和发育阶段具有特异性。circRNA参与调控机体的多种病理和生理过程，并可成为癌症诊断、治疗和预后的临床生物标志物[36-37]。有研究在肺癌发病机制中对circRNA进行了大量探索，但是较少涉及Rn暴露致肺癌的相关研究。PEI W W等[38]研究显示，暴露于Rn(剂量为100 000 Bq/m3, 12 h/d, 累计60 WLM)的小鼠肺组织发生了炎症反应。利用基因测序筛查出107个上调和83个下调的circRNA, 选择了具有最高倍数变化的circRNA以预测miRNA结合位点，证明其与最高暴露剂量(剂量为100 000 Bq/m3, 12 h/d, 累计60WLM)中的circRNA具有一致性，提示circRNA与miRNA的相互作用在Rn诱导的肺损伤中发挥了重要作用。
3. 小结
非编码RNA在肺癌的发生、发展、诊断和治疗中具有非常重要的意义。虽然Rn致肺癌作用机制取得了较大进展，但对非编码RNA在Rn致肺癌的发生和发展中的作用认识不足，其在Rn致肺癌的分子作用机制中研究仍较少。相关研究通过基因测序等手段发现大量表达差异的非编码RNA, 但一直未深入研究。因此，应对非编码RNA在Rn致肺癌中的作用机制进行深入研究，分析非编码RNA在Rn致肺癌中的作用机制，为Rn致肺癌的防治提供新思路。
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图 6 miR-142-3p与TNF-α的靶向关系
A: TNF-α与miR-142-3p的结合位点; B: 荧光素酶实验; C、D: 各组细胞TNF-α mRNA、上清液TNF-α蛋白表达水平。两两比较, **P < 0.01。
表 1 引物序列
引物 序列 GAPDH 上游 5′-ACG GATTTGGTCGTATTGGG-3′ 下游 5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′ miR-142-3p 上游 5′-CGAGGATCCGGAGGCAAG-3′ 下游 5′-CCGAATTCCAGCTGTCCGG-3′ IL-6 上游 5′-ACTCACCTCTTCAGAAC-3′ 下游 5′--CCATCTTTGGAAGGTT-3′ IL-10 上游 5′-TCAAGGCGCATGTGAACTCC-3′ 下游 5′-GATGTCAAACT CACTCATGGCT-3′ IFN-γ 上游 5′-TGAATGTC CAACGCAAAGCA-3′ 下游 5′-TGAATGTCCAACGCAAAGCA-3′ TNF-α 上游 5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′ 下游 5′-GAGGACCTGGGAG TAGATGAG-3′ 
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