Experimental study on reconstruction of blood supply of pig femoral head by anastomosis of epiphyseal artery
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摘要:目的
通过活体验证吻合猪股骨头内骺动脉Ⅰ期重建股骨头血供的可行性。
方法选取9头体质量约100 kg的普通级长白猪，制作股骨颈头下型骨折模型。将右后肢作为实验组，左后肢作为对照组。实验组行内固定后，在股骨头内吻合骺动脉，对照组行内固定后不予其他处理。术中和术后7 d，观察并计算吻合口通畅率、股骨头渗血率、数字减影血管造影（DSA）阳性率。术后7 d，取双侧股骨头行组织学检查，并计算软骨厚度。
结果本研究有1头猪术中死亡，8头猪有完整资料。实验组术中吻合口通畅率为100.0%，股骨头渗血率为100.0%，DSA阳性率为25.0%；实验组术后7 d吻合口通畅率为12.5%，股骨头渗血率为12.5%，DSA阳性率为12.5%。组织学检查显示，实验组软骨厚度大于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。
结论在活体猪中Ⅰ期吻合股骨头内骺动脉重建股骨头血供的方法是可行的，短期内是有效的。
Abstract:ObjectiveTo verify the feasibility of anastomosing the epiphyseal artery of the pig femoral head in vivo in the first stage of reconstruction of the blood supply of the femoral head.
MethodsNine ordinary Landrace pigs weighing about 100 kg were used to make subcephalic fractures of the femoral neck. The right hindlimb was used as experimental group, and the left hindlimb was used as control group. The epiphyseal artery was anastomosed in the femoral head after internal fixation in the experimental group, while no other treatment was done after internal fixation in the control group. The patency rate of anastomosis, the blood oozing rate of femoral head and the positive rate of digital subtraction angiography (DSA) were observed and calculated during operation and 7 days after operation. The bilateral femoral heads were taken for histological examination at 7 days after operation.
ResultsIn this study, one pig died during operation, and 8 pigs had complete data. In the experimental group, the intraoperative anastomotic patency rate was 100.0%, the intraoperative blood oozing rate of femoral head was 100.0%, and the intraoperative positive rate of DSA was 25.0%; at 7 days after operation in the experimental group, the intraoperative anastomotic patency rate was 12.5%, the intraoperative blood oozing rate of femoral head was 12.5%, and the intraoperative positive rate of DSA was 12.5%. Histological examination showed that the thickness of cartilage in the experimental group was significantly greater than that in the control group (P < 0.01).
ConclusionIt is feasible to reconstruct the blood supply of the femoral head by anastomosis of the internal epiphyseal artery of the femoral head in the first stage in living pigs, and the effect is effective in the short term.
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Keywords:
- femoral neck fracture /
- femoral head /
- reconstruction of blood supply /
- replantation
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股骨头坏死是股骨颈骨折较为严重的并发症之一，其中创伤导致股骨头血供中断是股骨头坏死的主要原因之一[1-2]。ZHAO D W等[3]通过吻合后上支持带动脉恢复股骨头血供治疗1例经颈型股骨颈骨折取得成功后，应用显微外科技术Ⅰ期恢复股骨头血供治疗股骨头无血供的股骨颈骨折正成为该领域的研究热点[4]。根据骨折线的解剖部位，可将股骨颈骨折分为头下型、经颈型和基底型[5-6]。分型为头下型骨折时，由于股骨头部无法找到可供吻合的血管，应用上述的方法无法完成股骨头再植。为了解决上述问题，本研究团队大胆提出了吻合股骨头内骺动脉的设想，并对此展开了一系列研究[7-10]。通过制作股骨头动脉铸型标本发现，股骨头内支持带动脉可分为下方的骺动脉区、中间的骺动脉网区和上方的骺上动脉区。骺动脉在相互吻合成骺动脉网前沿骨皮质下行走约1.5 cm, 口径约0.5 mm, 具备显微镜下吻合条件[7]。体外实验[10]证实，通过吻合股骨头内骺动脉能完成股骨头再植。本研究通过活体验证吻合猪股骨头内骺动脉Ⅰ期重建股骨头血供的可行性，现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 实验动物及分组
普通级长白猪(吴江田宇生物科技有限公司，合格证号: SCXK苏2016-0006)9头，雌雄不限, 8~10月龄(平均9个月)，体质量约100 kg。本研究已通过苏州大学附属瑞华医院医学伦理委员会审核批准(伦理审批文书批号: RHGK2022034)。本研究分为2组进行，将9只实验猪的右后肢作为实验组，按序制作股骨颈头下型骨折、内固定、吻合骺动脉，观察各项指标; 将这9只实验猪的左后肢作为对照组，除不进行吻合骺动脉外，其他同实验组处理。
1.2 制作股骨颈头下型骨折及内固定方法
术前禁食、禁水6 h, 两侧后肢术区备皮; 采用2%盐酸塞拉嗪1.5 mg/kg行基础麻醉，丙泊酚及七氟烷静脉-吸入复合麻醉维持麻醉状态; 采用X线辅助定位股骨头体表投影点，以该点为中心行髋关节内侧切口，长约10 cm; 锐性分离皮下组织，逐层分离肌肉; “T”形切开髋关节囊，切断圆韧带，暴露并游离股骨头; 在股骨头颈交界处用骨刀截断股骨颈，造成双侧股骨颈头下型骨折，测量股骨头大小和质量并记录; 解剖复位股骨头后，使用点状复位钳固定，沿股骨颈方向使用2枚空心拉力螺钉或克氏针固定股骨头。
1.3 术后处理
术后将实验猪放置在固定笼内，转运至安静、清洁的房间。结合外固定支架使猪呈侧卧位，将后肢与固定笼固定，联合应用氯丙嗪镇静，减少后肢活动。术后首个48 h使用镇痛泵, 48 h后再应用凯酚止痛。每天早、中、晚应用罂粟碱和肝素钠维持吻合口通畅。应用奥美拉唑预防应激性溃疡，每天静脉滴注脂肪乳250 mL和氨基酸500 mL加强营养，术后流食喂养至7 d。
1.4 吻合骺动脉方法
股骨头取出后，首先在显微镜下寻找股骨头支持带动脉滋养孔; 以滋养孔为中心，设计底边为0.6 cm、高为1.0 cm的等腰三角形(图 1A); 去除三角形内骨皮质，显露出位于骨内的骺动脉(图 1B), 测量其口径后备用; 固定完成后，游离近端后下支持带动脉和远端骺动脉，二定点法端端吻合远近端(图 1C)。
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图 1 吻合骺动脉方法A: 游离的股骨头，红色三角形为预开骨窗位置，紫色箭头所示为滋养孔; B: 骺动脉游离后镜下表现，红色三角形区域为骨窗，红色箭头所示为骺动脉; C: 血管吻合完成后镜下表现，白色箭头所示为骺动脉，黑色箭头所示为支持带动脉，黄色箭头位置为吻合口。1.5 观察指标
1.5.1 吻合口通畅率
血管吻合完成后松开止血夹，术中若见骺动脉颜色鲜红、充盈良好、搏动规律、吻合口无渗血、无血栓形成，则判定为吻合口即时通畅。若动脉内无红色血液且搏动消失，则判定为吻合口即时不通畅。术后7 d暴露血管吻合部位，若与术中动脉通畅时状态相同，则判定为吻合口7 d通畅; 若动脉弹性消失、管腔干瘪、有血栓形成，则判定为吻合口7 d不通畅。记录并计算吻合口即时通畅率以及吻合口7 d通畅率。
1.5.2 股骨头渗血率
术中在三角形骨窗上方约1 cm处，采用直径2.0 mm克氏针钉入软骨面下方0.5 cm, 使用显微刮匙清理针孔周围被压缩的骨质，使用肝素生理盐水冲洗，观察针孔中血流的颜色和速度，若30 s内有鲜红色血液渗出，则判定为股骨头即时渗血阳性，否则判定为渗血阴性，见图 2。术后7 d, 清理针孔内血凝块，使用肝素生理盐水冲洗干净，同上观察。若有鲜红色血液渗出，则判定为股骨头7 d渗血阳性，否则判定为阴性。记录并计算股骨头即时渗血率以及股骨头7 d渗血率。
1.5.3 数字减影血管造影(DSA)阳性率
以手术对侧膝关节内侧面后缘为参考点，纵行切开皮肤，在隐动脉置入血管穿刺鞘，在导丝的引导下置入单弯导管，导管置入腹主动脉分叉处，进行初次造影(压力为300 PSI, 流速为4 mL/s, 总量为12 mL)。根据图像在导丝辅助下推进导管至股深动脉内，导管开口放置于股骨头血管分支开口处，进行再次造影(压力为200 PSI, 流速为3 mL/s, 总量为8 mL), 采集图像，若观察到造影剂由股深动脉进入股骨头后下支持带动脉分支，通过骺动脉-后下支持带动脉吻合口直至走行至股骨头内，则判定为DSA阳性，否则判定为阴性，见图 3。术后7 d, 以同样方法进行造影并观察，记录并计算DSA即时阳性率以及DSA 7 d阳性率。
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图 3 DSA造影结果A: 术前DSA造影，白色所示为股骨头位置，红色箭头所示为股骨头内显影血管; B: 术后X线片，白色所示为股骨头位置; C: 术后DSA造影，白色所示为股骨头位置，红色箭头所示为股骨头内显影血管。1.5.4 组织学检查
术后7 d时，随机处死4只实验猪，观察双侧股骨头改变并记录。沿冠状面剖开股骨头, 10%甲醛溶液固定，使用浓度为20%的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙。脱钙后使用石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察组织学改变。在每个股骨头软骨层随机选取5个视野，使用Image J软件测量软骨厚度并统计结果。
2. 结果
本研究有1头猪术中死亡，其他8头猪均有完整资料。术中吻合骺动脉直径为0.3~0.6 mm, 平均(0.46±0.10) mm。实验组吻合口即时通畅率为100.0%, 7 d通畅率为12.5%; 实验组股骨头即时渗血率为100.0%, 7 d渗血率为12.5%; 实验组DSA即时阳性率为25.0%, 7 d阳性率为12.5%。见表 1。
表 1 实验结果统计表(n=9)动物编号 吻合血管口径/mm 吻合口通畅情况 股骨头渗血情况 DSA 术毕 术后7 d 术毕 术后7 d 术毕 术后7 d 1 0.30 通畅 吻合处断开 阳性 阴性 阴性 阴性 2 0.50 死亡 死亡 死亡 死亡 死亡 死亡 3 0.35 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 4 0.55 通畅 远端撕脱 阳性 阴性 阳性 阴性 5 0.60 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 6 0.50 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 7 0.40 通畅 近端弯折 阳性 阴性 阴性 阴性 8 0.50 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 9 0.40 通畅 通畅 阳性 阳性 阳性 阳性 实验组(n=8)股骨头质量和最大直径分别为(18.43±1.81) g和(34.80±0.55) mm, 对照组(n=8)分别为(18.45±1.84) g和(33.18±1.75) mm, 组间差异无统计学意义(P>0.05)。术后7 d, 实验组股骨头较对照组洁白且光滑(图 4A); 与实验组相比，对照组镜下可见骨髓组织存在一定程度的变性、骨小梁间组织细胞增多、脂肪空泡减少、部分区域骨小梁碎裂(图 4C、4D); 2组空骨陷窝和成骨细胞数量差异无统计学意义(P>0.05); 2组软骨厚度(图 4B、4E、4F)的差异有统计学意义(P < 0.01)。
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图 4 股骨头组织学观察A: 实验组与对照组股骨头肉眼表现; B: 实验组与对照组软骨厚度比较，与同一动物编号对照比较, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1; C: 实验组HE染色表现(放大20倍)，骨小梁结构完整，骨髓组织形态正常; D: 对照组HE染色表现(放大20倍)，部分区域骨小梁碎裂，骨髓组织存在一定程度变性，脂肪空泡减少; E: 实验组软骨镜下表现; F: 对照组软骨镜下表现。3. 讨论
目前，股骨头内部的血供形式有分区供血和整体供血2种观点，其中分区供血观点提出较早，具有代表性的是TRUETA J等[11]研究成果。分区供血观点认为股骨头内部存在明显的血供分区，不同组骺动脉为股骨头的不同部位供血，这些部位相互独立，相互间无交通吻合。随着新技术及新设备的广泛应用，越来越多的专家正在接受整体供血观点[12]。整体供血观点认为股骨头内部的血管是相互吻合成网的，任何一组骺动脉均能为整个股骨头提供血供和营养[13]。本研究也支持整体供血观点，通过制作股骨头内动脉的铸形标本，观察到各组骺动脉入头后穿过骺板在中央区相互吻合形成骺动脉网，在网区再向上辐射状发出许多细小的骺上动脉，其终末分支进一步发散，范围涵盖全股骨头。作者认为股骨头内的骺动脉网是股骨头整体供血的解剖学依据[7, 14]。ZHAO D W等[3]吻合一条头外支持带动脉首次再植成活股骨头的结果也间接支持股骨头整体供血观点。因此，股骨头整体供血观点是股骨头再植研究的解剖学基础。
临床上股骨颈骨折，尤其是头下型骨折，股骨头的血供是中断的，若能Ⅰ期恢复其血供(即股骨头再植)，无疑会降低股骨颈骨折后股骨头坏死率。作者前期研究在体外证实了股骨头再植的可行性和有效性[10]。本研究选择术后7 d作为观察时间节点，是基于目前临床上的共识(能维持通血7 d的再植组织，一般都能成活)。虽然实验结果仅1头猪维持了7 d的通血，但从100.0%吻合口即时通畅率、股骨头即时渗血率以及实验组股骨头软骨厚度明显厚于对照组来看，吻合1条股骨头内骺动脉是能恢复股骨头动脉血供和提供足够营养的，这虽然不能证明吻合股骨头内骺动脉能完成股骨头再植，但为进一步研究股骨头再植提供了实验依据。
本研究仅有1头实验猪的再植股骨头在第7天还有血液供应，其他7头均未检测到股骨头有血液供应。分析原因可能为: ①未吻合静脉。股骨头内的静脉能否吻合的研究资料不多，作者观察到股骨头内的静脉管壁非常薄，难于完成吻合，加上手术体位的限制，因此选择了只缝合1根动脉，希望通过骨面的渗血等其他因素来解决再植股骨头静脉回流。但实验结果不支持本研究的设想[15], 因此建立静脉通路是今后研究股骨头再植必须要解决的问题。②贫血。术中出血和术后骨面渗血等因素造成实验猪持续贫血。虽然作者在术中用自体血回输缓解了一部分猪的贫血状态，但仍不能满足股骨头再植的需要。解决贫血是今后研究股骨头再植的重要任务之一[16-18]。③维持体位困难。制动是确保再植组织吻合口通畅的要素之一，但要让实验猪保持7 d的制动位置则非常困难。本研究结果中部分吻合口的撕裂、栓塞等可能与此有关。
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图 1 吻合骺动脉方法
A: 游离的股骨头，红色三角形为预开骨窗位置，紫色箭头所示为滋养孔; B: 骺动脉游离后镜下表现，红色三角形区域为骨窗，红色箭头所示为骺动脉; C: 血管吻合完成后镜下表现，白色箭头所示为骺动脉，黑色箭头所示为支持带动脉，黄色箭头位置为吻合口。
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图 3 DSA造影结果
A: 术前DSA造影，白色所示为股骨头位置，红色箭头所示为股骨头内显影血管; B: 术后X线片，白色所示为股骨头位置; C: 术后DSA造影，白色所示为股骨头位置，红色箭头所示为股骨头内显影血管。
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图 4 股骨头组织学观察
A: 实验组与对照组股骨头肉眼表现; B: 实验组与对照组软骨厚度比较，与同一动物编号对照比较, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1; C: 实验组HE染色表现(放大20倍)，骨小梁结构完整，骨髓组织形态正常; D: 对照组HE染色表现(放大20倍)，部分区域骨小梁碎裂，骨髓组织存在一定程度变性，脂肪空泡减少; E: 实验组软骨镜下表现; F: 对照组软骨镜下表现。
表 1 实验结果统计表(n=9)
动物编号 吻合血管口径/mm 吻合口通畅情况 股骨头渗血情况 DSA 术毕 术后7 d 术毕 术后7 d 术毕 术后7 d 1 0.30 通畅 吻合处断开 阳性 阴性 阴性 阴性 2 0.50 死亡 死亡 死亡 死亡 死亡 死亡 3 0.35 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 4 0.55 通畅 远端撕脱 阳性 阴性 阳性 阴性 5 0.60 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 6 0.50 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 7 0.40 通畅 近端弯折 阳性 阴性 阴性 阴性 8 0.50 通畅 栓塞 阳性 阴性 阴性 阴性 9 0.40 通畅 通畅 阳性 阳性 阳性 阳性 
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