Mechanism of Tongmai granules in treatment of stroke based on ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry and network pharmacology
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摘要:目的
基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）和网络药理学方法，探讨通脉颗粒治疗脑卒中的作用机制。
方法采用UHPLC-QTOF-MS技术鉴定通脉颗粒的化学成分；通过TCMSP、TTD和PubMed等数据库检索通脉颗粒活性成分作用靶点和脑卒中相关靶点；采用STRING数据库构建关键靶点的蛋白互作网络；采用DAVID数据库对关键靶点进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。
结果从通脉颗粒中鉴定出丹酚酸B、葛根素和藁本内酯等96个化学成分，筛选到38个活性成分和作用于脑卒中靶点55个，核心靶点包括前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、核因子κB（NFκB）和核因子红细胞系2相关因子2（NRF2）等，关键通路主要涉及缺氧诱导因子1（HIF-1）、肿瘤坏死因子（TNF）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）等。
结论通脉颗粒中丹酚酸B、葛根素和藁本内酯等主要活性成分，通过作用于PTGS2、NFκB和NRF2等靶点，调控HIF-1、TNF和PI3K-Akt等信号通路发挥抗脑卒中的作用。
Abstract:ObjectiveTo explore the mechanisms of Tongmai granules in treatment of stroke based on ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-QTOF-MS) and network pharmacology technology.
MethodsThe chemical compounds of Tongmai granules were identified by UHPLC-QTOF-MS approach. The compounds' targets and stroke-related targets were screened via TCMSP, TTD and PubMed databases. STRING database was used to construct the protein interaction network of key targets. DAVID database was used for Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis for key targets.
ResultsA total of 96 chemical components, such as salvianolic acid B, puerarin and ligustilide were identifiedfrom Tongmai granules. A total of 38 active compounds and 55 targets of Tongmai granules for stroke treatment were obtained. The core targets included prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), nuclear factor kappa B (NFκB)as well as nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) and so on, and the key pathways mainly involved hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), tumor necrosis factor (TNF) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-Akt and so on.
ConclusionMajor active components such as salvianolic acid B, puerarin and ligustilide in Tongmai granules regulate HIF-1, TNF and PI3K-Akt signaling pathways by acting on PTGS2, NFκB and NRF2 and other targets to play an anti-stroke role.
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脑卒中是一种急性脑血管疾病，具有发病率高、致残率高、复发率高和病死率高等临床特征[1]。中国人群的脑卒中发病率排在全球首位，其是导致居民死亡的首位病因[2]。《中国卒中中心报告2020》[3]揭示，脑卒中的发病率居高不下，且发病呈年轻化趋势。临床证据[4]表明，与西药治疗相比，中医药在脑卒中防治中具有独特优势。通脉颗粒由丹参、川芎和葛根共3味中药组成，具有活血通脉之功效，临床主要用于脑卒中、动脉硬化、心绞痛和冠心病等心脑血管疾病治疗[5]。通脉颗粒具有抑制神经炎症、抗氧化应激和改善血液流变学等多重药理作用[6-8]。通脉颗粒是治疗脑卒中的核心中药制剂，临床疗效确切，不良反应较小[9]。但通脉颗粒治疗脑卒中的药效成分和潜在作用机制尚不清楚，制约了其临床应用。本研究拟采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)技术对通脉颗粒的化学成分进行系统表征，并借助网络药理学对其抗脑卒中的作用途径进行初步探讨，以期更好地指导临床用药。
1. 材料与方法
1.1 药品及试剂
通脉颗粒(批号2110009)购自葵花药业集团(唐山)生物制药有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯，由美国TEDIA公司提供。超纯水由Mill-Q去离子水系统(美国密理博公司)自制，其他试剂为分析纯。
1.2 主要仪器
Waters Acquity超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，含在线真空脱气机、柱温箱、自动进样器、四元泵和WAD检测器。SCIEX 4600高分辨四极杆飞行时间质谱仪(美国AB公司)。KH-500DB型数控超声仪, Centrifuge 5425R低温高速离心机(德国艾本德公司)。
1.3 样品溶液制备
精密称取1.0 g样品至100.0 mL锥形瓶中，加入30.0 mL的75%甲醇水溶液, 100 Hz下超声提取60 min; 冷却至室温, 75%的甲醇水溶液补足失重; 将提取液于13 000转/min离心10 min, 取上清转移至1.5 mL离心管，于-20 ℃保存待用。
1.4 UHPLC-QTOF-MS分析
液相色谱条件: 色谱柱, Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100.0 mm, 1.8 μm); 流动相: A为乙腈, B为0.1%甲酸水溶液; 进样量为2.0 μL; 流速为0.4 mL/min; 柱温为40 ℃; 梯度洗脱程序如下: 0~1 min, 5% A; 1~5 min, 5%~12% A; 5~15 min, 12%~22% A; 15~22 min, 22%~38% A; 22~30 min, 38%~95% A; 30~32 min, 95% A; 32~32.1 min，95%~5% A; 32.1~35 min, 5% A。
质谱条件: 采用DIA采集模式获得MS和MS/MS数据，正、负离子模式扫描。离子化电压为(+)5 000/(-)4 500 V; 离子源温度(+)500/(-)450 ℃, 接簇电压(DP)为(+)80/(-)80 V, 碰撞能(CE)为(+)35/(-)35 V; 喷雾气(Gas 1)为55 psi, 辅助加热气(Gas 2)为55 psi, 气帘气为35 psi。一级质谱母离子和二级质谱子离子扫描范围均为m/z 50~1 500。
1.5 通脉颗粒活性成分的筛选
将从通脉颗粒鉴定的化学成分导入中药系统药理学数据库(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)。以口服生物利用度(OB)和分子类药性(DL)为标准，筛选出OB≥30.00%且DL≥0.18的化学成分作为通脉颗粒的活性成分。此外，通过文献检索的方法，考虑化合物在通脉颗粒中的含量及其生物活性，筛选通脉颗粒活性成分。
1.6 通脉颗粒关键靶点获取
将通脉颗粒活性成分导入TCMSP、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)和PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)等数据库进行靶点挖掘。以“Stroke” “Cerebral ischemia” “Cerebral hemorrhage”为关键词，分别通过PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、Comparative Toxicogenomics Database(CTD, http://ctdbase.org/)和Therapeutic Target Database(TTD, http://db.idrblab.net/ttd/)等数据库筛选脑卒中相关靶点。将化合物和脑卒中靶点导入Uniprot(https://www.uniprot.org/因名称规范处理。基于VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es)平台绘制化合物靶点和疾病靶点的韦恩图，获得通脉颗粒治疗脑卒中的关键靶点。为表征通脉颗粒治疗脑卒中的关键功效，将通脉颗粒治疗脑卒中的交集靶点导入CTD数据库，汇总靶点对应的功效。
1.7 蛋白与蛋白交互(PPI)网络建立和关键靶标分析
采用STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)分析关键靶点的PPI网络，物种设置为“Homo Sapiens”, 其他参数采用默认设置。基于Cytoscape 3.7.1软件构建通脉颗粒治疗脑卒中的PPI网络，并采用软件中自带的NetworkAnalyzer工具包对PPI网络的拓扑异构参数(degree、betweeness、closeness)进行分析，确定PPI网络的核心靶点。
1.8 “化合物-靶点”和“靶点-功效”网络构建
采用Cytoscape 3.7.1软件分别构建“化合物-靶点”和“靶点-功效”互作网络。通过分析“化合物-靶点”和“靶点-功效”网络的拓扑异构参数，筛选通脉颗粒治疗脑卒中的关键药效成分、作用靶点和药效。
1.9 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析和基因本体论(GO)生物功能注释
将上述筛选到的交集基因导入DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，对通脉颗粒治疗脑卒中的作用靶点进行KEGG通路分析和GO功能富集分析。利用RStudio软件以气泡图和条形图的形式可视化处理通脉颗粒治疗脑卒中的作用通路和涉及的生物功能。
2. 结果
2.1 通脉颗粒的化学成分鉴定
采用UHPLC-QTOF-MS方法，通过文献查询[10-12]、数据库匹配和标准品比对，共从通脉颗粒中鉴定出96个化合物，正离子模式下鉴定38个，负离子模式下鉴定58个。UHPLC-QTOF-MS-的总离子流图见图 1。通脉颗粒的化学成分以黄酮类、酚酸类、丹参酮类和苯酞类为主，其中黄酮类成分39个，酚酸类成分26个，丹参酮类成分17个，苯酞类成分9个和其他类成分5个。
2.2 通脉颗粒治疗脑卒中的活性成分
通脉颗粒中活性化合物的筛选不仅根据化学成分的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)行为(OB≥30%; DL≥0.18), 也综合考虑化合物在通脉颗粒中含量高低及其生物活性。以葛根中葛根素、大豆苷和染料木素为例，尽管这3个化合物的OB值均低于30%, 但葛根素、大豆苷和染料木素是葛根指标性成分，且有明显抗脑缺血活性[13], 因而也被确定为通脉颗粒活性成分。最终筛选到通脉颗粒中38个活性成分，其中丹参16种，葛根14种和川芎8种。见表 2。
表 2 通脉颗粒中活性成分编号 化合物 OB/% DL 化合物归属 P5 丹参素 36.91 0.06 丹参 P8 原儿茶醛 38.35 0.03 丹参 P14 大豆苷元-4′，7-二葡萄糖苷 47.27 0.67 葛根 P17 染料木甙 13.35 0.75 葛根 P18 绿原酸 11.93 0.33 川芎 P19 咖啡酸 54.97 0.05 川芎 P20 夏佛塔苷 22.96 0.82 葛根 P23 葛根素 24.03 0.69 葛根 P25 葛根素-7-O-木糖苷 32.15 0.31 葛根 P26 大豆苷 14.32 0.73 葛根 P30 3′-甲氧基大豆苷 27.13 0.84 葛根 P32 阿魏酸 39.56 0.06 川芎 P48 芒柄花苷 69.67 0.21 葛根 P51 洋川芎内酯I 46.80 0.08 川芎 P53 迷迭香酸 1.38 0.35 丹参 P57 紫草酸 2.67 0.76 丹参 P59 大豆黄素 19.44 0.19 葛根 P60 丹酚酸B 3.01 0.41 丹参 P61 黄豆黄素 50.48 0.24 葛根 P63 3′-甲氧基大豆黄素 30.12 0.21 葛根 P65 丁烯基苯酞 42.44 0.07 川芎 P66 尼泊尔鸢尾异黄酮 37.78 0.30 葛根 P68 丹酚酸A 2.96 0.70 丹参 P69 染料木素 17.93 0.21 葛根 P71 丹参二醇A 75.39 0.46 丹参 P73 正丁烯基苯酞 42.44 0.07 川芎 P75 藁本内酯 23.50 0.07 川芎 P76 丹参酚醌Ⅰ 49.68 0.32 丹参 P78 芒柄花黄素 66.39 0.21 葛根 P80 降丹参酮 34.72 0.37 丹参 P81 紫丹参甲素 21.91 0.45 丹参 P82 洋川芎内酯A 32.12 0.19 川芎 P85 紫丹参素C 55.74 0.40 丹参 P87 二氢丹参酮Ⅰ 43.76 0.39 丹参 P90 隐丹参酮 52.34 0.40 丹参 P91 丹参酮Ⅰ 29.27 0.36 丹参 P94 丹参酮ⅡA 49.89 0.40 丹参 P95 丹参新酮 38.76 0.25 丹参 2.3 通脉颗粒治疗脑卒中的关键靶点
将筛选到的38个活性成分导入PubMed、PharmMapper和TCMSP数据库，共检索到通脉颗粒化学成分靶点254个。PharmGKB、CTD、TTD和DrugBank数据库共查询到脑卒中相关靶点453个。采用VENNY 2.1构建通脉颗粒化学成分和脑卒中靶点的韦恩图，共得到55个通脉颗粒治疗脑卒中的关键靶点(图 2A)。分别对丹参、川芎和葛根的作用靶点取交集，得到3味药的交集靶点8个(图 2B), 分别为核因子κB(NFκB)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、Toll样受体4(TLR4)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血红素加氧酶1(HMOX1)、白细胞介素-1β(IL-1β)和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)。
2.4 通脉颗粒治疗脑卒中的关键靶点PPI网络
关键靶点的PPI网络图见图 3，该PPI网络共包含52个节点(node)和744条边(edge)。以degree值大小筛选核心靶点，排在前列的靶点如下: 白细胞介素-6(IL-6, degree=38)、TLR4(degree=36)、IL-1β(degree=35)、肿瘤坏死因子(TNF, degree=34)、血管内皮生长因子(VEGF, degree=34)、信号传导与转录激活因子3(STAT3, degree=31)和HIF-1α(degree=30)等，这些靶点在PPI网络中互作频率较高，提示上述靶点可能是脑卒中治疗的关键靶点。
2.5 通脉颗粒的化学成分-脑卒中靶点网络分析
通脉颗粒化学成分-脑卒中靶点的可视化网络见图 4, 该网络共含有93个节点(化学成分38个，靶点55个)和353条边。采用“NetworkAnalyzer”插件进行网络分析, degree值排名前10的活性成分为: P60(丹酚酸B)、P23(葛根素)、P26(大豆苷)、P69(染料木素)、P59(大豆黄素)、P94(丹参酮ⅡA)、P5(丹参素)、P75(藁本内酯)、P82(洋川芎内酯A)和P48(芒柄花苷); 前10位靶点依次为: 前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、核因子κB(NFκB)、胱天蛋白酶3(CASP3)、核因子红细胞系2相关因子2(NRF2)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、BCL2相关X蛋白(BAX)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)、肿瘤坏死因子(TNF)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)和VEGF(血管内皮生长因子)。以上结果表明，上述degree值较高的活性成分和靶点可能是通脉颗粒治疗脑卒中的关键药效成分和作用靶点。
2.6 通脉颗粒靶点-功效网络分析
脑卒中的病理特征主要有神经炎症、神经毒性、细胞凋亡、氧化应激、血脑屏障损伤、能量代谢紊乱等[14], 依次将这些靶点的功效归为这些病理特征。通脉颗粒的靶点-功效网络如图 5所示。通脉颗粒治疗脑卒中的作用靶点主要富集在炎症(degree=22)、凋亡(degree=16)、氧化应激(degree=13)和神经保护(degree=11)上，尤其是神经炎症和细胞凋亡富集的靶点最多，提示其主要通过抗炎和抑制凋亡途径发挥抗脑卒中的作用。
2.7 GO功能及KEGG通路富集分析
GO富集分析共得到549条生物过程(BP)、55条细胞组成(CC)和78条分子功能(MF), 排名前10位GO条目的结果见图 6。通脉颗粒治疗脑卒中的关键靶点主要涉及细胞交互、催化活性、信号传导、细胞迁移的正调控、细胞死亡、神经元凋亡的调控等生物过程; 主要涉及蛋白复合物、细胞质、细胞连接、囊泡、线粒体和细胞膜等细胞组分; 主要参与蛋白结合、酶结合、信号受体结合、血红素结合、蛋白激酶结合和转录因子结合等分子功能。
进一步采用KEGG通路富集分析筛选通脉颗粒治疗脑卒中可能涉及的信号通路，共得到29条显著相关的信号通路(P < 0.05)。富集排名靠前的信号通路主要包括缺氧诱导因子信号通路(HIF-1 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、白细胞介素-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、松弛素信号通路(Relaxin signaling pathway)和神经营养素信号通路(Neurotrophin signaling pathway)等。富集因子前20位的信号通路见图 7。KEGG通路分析表明，通脉颗粒主要通过抑制神经炎症相关信号通路发挥治疗脑卒中的作用。
3. 讨论
脑中风的发病机制涉及再灌注损伤、神经炎症、神经细胞凋亡等复杂的缺血级联反应，其确切发病机制尚未完全清楚[15]。目前，西医尚无特效的治疗方法，而中医药治疗缺血性中风具有整体调节、综合治疗、标本兼顾的独特优势[16]。通脉颗粒由丹参、川芎和葛根组成，其中丹参具有活血祛瘀、清心除烦的作用; 川芎具有活血化瘀、祛风燥湿和行气止痛之功效; 葛根具有升阳透疹、解肌退热和止泻的作用。诸药合用可活血、行气和养血，其被广泛用于脑卒中的临床治疗。本研究利用UHPLC-QTOF-MS结合网络药理学技术探讨了通脉颗粒治疗脑卒中的关键靶点和作用机制。
化合物-靶点网络分析显示，通脉颗粒中丹酚酸B、葛根素、大豆苷、染料木素、丹参酮ⅡA和藁本内酯等活性成分通过作用于PTGS2、NFκB、CASP3、NRF2和AKT1等靶点，在脑卒中治疗中发挥重要作用。丹酚酸B和丹参酮ⅡA是丹参主要活性成分，丹酚酸B通过抑制脂质过氧化反应、清除氧自由基、促进半影区VEGF的表达等途径，有效改善血脑屏障损伤[17]。丹参酮ⅡA能够显著下调BCL2相关X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、胱天蛋白酶8(Caspase-8)等凋亡诱导因子的表达，抑制神经元细胞凋亡[18]; 并可降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达，进而抑制神经炎症，减轻细胞黏附分子和白细胞浸润导致的脑损伤[19]。葛根素和染料木素是葛根主要药效成分，葛根素通过抑制单核细胞因子和内皮素分泌，减少脑梗死范围，改善脑卒中患者神经功能缺损[20]。染料木素通过抑制Ca2+超载、减轻谷氨酸神经毒性、上调NRF2、HIF-1α等抗氧化蛋白表达，对脑卒中有显著预防和保护作用[21]。藁本内酯是川芎重要活性成分，可通过抑制TLR4-MAPK/NF-κB信号通路，减少炎症相关酶及炎症因子表达，减少缺血区脑梗死体积[22]。
KEGG富集分析结果表明，以PTGS2、TNF、VEGF、NFκB、NRF2、BAX和IL-6等为核心的通脉颗粒治疗脑卒中的关键靶点，参与了HIF-1、TNF、PI3K-Akt、IL-17、Relaxin和Neurotrophin等信号通路。缺氧诱导因子(HIF)是机体低氧应答状态下的关键转录因子，通过抑制氧化/硝化应激、促进血管生成等途径改善半影区的脑梗死体积[23]。TNF-α和IL-1β、IL-6、IL-17等炎症细胞因子具有促进脑内炎症反应，加重脑损伤的作用[24]。PI3K-Akt通路是自噬的经典通路，涉及神经炎症、内质网应激、氧化应激和神经元细胞凋亡等重要生命过程，与脑卒中的发生发展密切相关[25]。Neurotrophin信号通路在中枢神经系统中，对于促进神经细胞存活尤为重要，可通过激活Trk受体诱导神经递质释放，增强突触可塑性[26]。PTGS2参与局部缺血后的氧化应激和炎症反应，服用PTGS2抑制剂可增加脑卒中病死率[27]。
综上所述，通脉颗粒中有酚酸类、苯酞类、黄酮类和丹参酮类等成分，通过作用于PTGS2、HIF-1α、NFκB、NRF2、TNF和BAX等脑卒中相关靶点，干预HIF-1、TNF和PI3K-Akt等信号通路，进而抑制神经炎症、降低氧化应激和调节细胞凋亡，从而改善脑卒中症状。本研究从化学成分表征、靶点、功效、生物功能和信号通路等多角度探讨通脉颗粒治疗脑卒中的药效成分和作用机制，可为通脉颗粒的临床应用和二次开发提供参考。
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表 2 通脉颗粒中活性成分
编号 化合物 OB/% DL 化合物归属 P5 丹参素 36.91 0.06 丹参 P8 原儿茶醛 38.35 0.03 丹参 P14 大豆苷元-4′，7-二葡萄糖苷 47.27 0.67 葛根 P17 染料木甙 13.35 0.75 葛根 P18 绿原酸 11.93 0.33 川芎 P19 咖啡酸 54.97 0.05 川芎 P20 夏佛塔苷 22.96 0.82 葛根 P23 葛根素 24.03 0.69 葛根 P25 葛根素-7-O-木糖苷 32.15 0.31 葛根 P26 大豆苷 14.32 0.73 葛根 P30 3′-甲氧基大豆苷 27.13 0.84 葛根 P32 阿魏酸 39.56 0.06 川芎 P48 芒柄花苷 69.67 0.21 葛根 P51 洋川芎内酯I 46.80 0.08 川芎 P53 迷迭香酸 1.38 0.35 丹参 P57 紫草酸 2.67 0.76 丹参 P59 大豆黄素 19.44 0.19 葛根 P60 丹酚酸B 3.01 0.41 丹参 P61 黄豆黄素 50.48 0.24 葛根 P63 3′-甲氧基大豆黄素 30.12 0.21 葛根 P65 丁烯基苯酞 42.44 0.07 川芎 P66 尼泊尔鸢尾异黄酮 37.78 0.30 葛根 P68 丹酚酸A 2.96 0.70 丹参 P69 染料木素 17.93 0.21 葛根 P71 丹参二醇A 75.39 0.46 丹参 P73 正丁烯基苯酞 42.44 0.07 川芎 P75 藁本内酯 23.50 0.07 川芎 P76 丹参酚醌Ⅰ 49.68 0.32 丹参 P78 芒柄花黄素 66.39 0.21 葛根 P80 降丹参酮 34.72 0.37 丹参 P81 紫丹参甲素 21.91 0.45 丹参 P82 洋川芎内酯A 32.12 0.19 川芎 P85 紫丹参素C 55.74 0.40 丹参 P87 二氢丹参酮Ⅰ 43.76 0.39 丹参 P90 隐丹参酮 52.34 0.40 丹参 P91 丹参酮Ⅰ 29.27 0.36 丹参 P94 丹参酮ⅡA 49.89 0.40 丹参 P95 丹参新酮 38.76 0.25 丹参 
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