Influence of circular RNA_0005273 on biological behavior of esophageal cancer cells and its possible mechanism
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摘要:目的
探讨环状RNA_0005273(circ_0005273)对食管癌细胞生物学行为的影响及其可能作用机制。
方法分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blot)检测食管癌组织、癌旁组织、人食管癌细胞EC109中circ_0005273、微小RNA-1200(miR-1200)基因表达量与信号转导与转录活化因子3(STAT3)蛋白表达量。正常培养EC109细胞并设为对照组，另将si-NC、si-circ_0005273、miR-NC、miR-1200、si-circ_0005273+anti-miR-1200分别转染至EC109细胞并设为si-参照组、si-circ组、miR-参照组、miR-1200组、si-circ+anti组。分别采用噻唑蓝(MTT)法、平板克隆形成实验、流式细胞术和Transwell实验检测各组细胞增殖抑制率、集落形成数、细胞凋亡率和迁移细胞数; 采用双荧光素酶报告基因实验分析miR-1200与circ_0005273、STAT3间的靶向调控关系。
结果食管癌组织中circ_0005273、STAT3蛋白表达量高于癌旁组织, miR-1200表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义(P < 0.05); si-circ组miR-1200表达量、细胞增殖抑制率、凋亡率均高于对照组、si-参照组, circ_0005273表达量、STAT3蛋白表达量、集落形成数和迁移细胞数均低于或少于对照组、si-参照组，差异有统计学意义(P < 0.05); miR-1200组STAT3蛋白表达量、集落形成数、迁移细胞数均低于对照组、miR-参照组, miR-1200表达量、细胞增殖抑制率、凋亡率均高于对照组、miR-参照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。circ_0005273可靶向调控miR-1200, 且miR-1200可靶向调控STAT3。si-circ+anti组STAT3蛋白表达、集落形成数、迁移细胞数高于si-circ组，细胞增殖抑制率、凋亡率低于si-circ组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论circ_0005273在食管癌组织中呈高表达，干扰circ_0005273表达可通过上调miR-1200表达和下调STAT3表达而发挥抑制食管癌细胞增殖、迁移的作用，并诱导细胞凋亡。
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关键词:
- 食管癌 /
- 环状RNA_0005273 /
- 微小RNA-1200 /
- 信号转导与转录活化因子3 /
- 细胞增殖 /
- 迁移 /
- 凋亡
Abstract:ObjectiveTo explore the influence of circular RNA_0005273 (circ_0005273) on biological behavior of esophageal cancer cells and its possible mechanism.
MethodsThe genetic expression levels of circ_0005273, microRNA-1200 (miR-1200) and protein expression level of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in esophageal cancer tissues, paracancerous tissues and human esophageal cancer cells EC109 were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot respectively. EC109 cells were normally cultured and named as control group, and the si-NC, si-circ_0005273, miR-NC, miR-1200 and si-circ_0005273+anti-miR-1200 were respectively transfected into EC109 cells and named as si-reference group, si-circ group, miR-reference group, miR-1200 group and si-circ+anti group. Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) assay, colony formation assay, flow cytometry and Transwell assay were used to detect inhibition rate of cell proliferation, the number of colony formation, cell apoptosis rate and the number of cell migration; the targeted regulatory relationships of miR-1200 with circ_0005273 and STAT3 were analyzed by dual-luciferase reporter assay.
ResultsThe protein expression levels of circ_0005273 and STAT3 in the esophageal cancer tissues were significantly higher than those in the paracancerous tissues, while the expression level of miR-1200 was significantly lower than that in the paracancerous tissues (P < 0.05); the expression level of miR-1200, inhibition rate of cell proliferation and cell apoptosis rate in the si-circ group were significantly higher than those in the control group and si-reference group, while the expression level of circ_0005273, protein expression level of STAT3, the number of colony formation and the number of migrating cells were significantly lower than those in the control group and si-reference group (P < 0.05); the protein expression level of STAT3, the number of colony formation and the number of migrating cells in the miR-1200 group were significantly lower than those in the control group and miR-reference group, while the expression level of miR-1200, inhibition rate of cell proliferation and apoptosis rate were significantly higher than those in the control group and miR-reference group (P < 0.05). The circ_0005273 was able to regulate miR-1200 and miR-1200 was able to regulate STAT3 by targeted therapy. Protein expression level of STAT3, the number of colony formation and the number of migrating cells in the si-circ+anti group were significantly higher than those in the si-circ group, while inhibition rate of cell proliferation and apoptosis rate were significantly lower than those in the si-circ group (P < 0.05).
ConclusionThe circ_0005273 is highly expressed in esophageal cancer tissues, and interference of circ_0005273 can inhibit the proliferation and migration of esophageal cancer cells as well as induce cell apoptosis by up-regulating expression of miR-1200 and down-regulating expression of STAT3.
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食管癌是中国常见的恶性肿瘤，早期诊治有助于改善患者预后，但食管癌早期症状较为隐匿，导致大部分患者确诊时已处于中晚期。分子靶向治疗、基因治疗等方法已被用于肿瘤治疗中，食管癌的发病机制目前尚未明确，探究食管癌的发病机制有助于寻找靶向治疗的潜在靶点[1]。环状RNA(circRNA)属于内源性非编码RNA分子，因不具有5′端帽子与3′尾巴，不易被外切核酸酶降解。研究[2-4]显示, circRNA在食管癌中表达异常，并对细胞增殖、迁移等生物学过程发挥调控作用。环状RNA_0005273(circ_0005273)在结直肠癌组织中表达升高，且与肿瘤生长及转移相关，还可促进细胞增殖与转移[5]。研究[6]表明, circ_0005273与微小RNA-1200(miR-1200)存在结合位点，且miR-1200表达上调可促进肿瘤细胞凋亡并抑制细胞增殖。靶基因预测软件预测结果显示miR-1200与信号转导与转录激活因子3(STAT3)存在结合位点，而食管癌细胞增殖、迁移和侵袭与STAT3表达上调有关[7]。circ_0005273/miR-1200/STAT3在食管癌中的作用机制尚不明确，本研究探讨circ_0005273对miR-1200/STAT3表达的调控作用及其对食管癌细胞生物学行为的影响，以期为食管癌发病机制的研究提供一定参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
选取2019年3月—2020年4月在湖北省十堰市太和医院行手术切除治疗的51例食管癌患者作为研究对象，男31例、女20例，年龄45~66岁，平均(55.24±6.46)岁，取患者癌组织和癌旁组织标本作为研究样本。所有研究对象经病理诊断确诊食管癌，未合并其他恶性肿瘤及自身免疫性疾病，并在明确各项操作步骤与注意事项的情况下自愿签署知情同意书。本研究符合《赫尔辛基宣言》标准并经十堰市太和医院伦理委员会审核批准。
人食管癌细胞EC109购自上海联迈生物工程有限公司; Lipofectamine 3000和Trizol试剂购自美国invitrogen公司; cDNA反转录和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)相关试剂盒购自天根生化有限公司; si-circ_0005273、miR-1200 mimics、anti-miR-1200及其相应的阴性对照(si-NC、miR-NC)由锐博生物合成; 噻唑蓝(MTT)试剂和细胞凋亡迁移相关检测试剂盒分别购自碧云天生物技术有限公司、北京索莱宝有限公司。LightCycler480型荧光定量PCR仪购自上海Roche公司; FACS Calibur流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞转染及实验分组
将EC109细胞接种于6孔板(1×104个/孔)，按照Lipofectamine 3000说明书将si-NC、si-circ_0005273、miR-NC、miR-1200 mimics、si-circ_0005273与anti-miR-1200转染至细胞，分别设为si-参照组、si-circ组、miR-参照组、miR-1200组、si-circ+anti组，转染6 h后丢弃原有培养基，应用DMEM完全培养基培养48 h。另设对照组，该组EC109细胞按照正常条件培养。si-NC正向引物序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反向引物序列为ACGUGACACGUUCGGAGAATT; si-circ_0005273序列为5′-GAAAGATTTCTGCCCAGCAGA-3′; miR-NC序列为5′-GGUUCGUACGUACACUGUUCA-3′; miR-1200序列为5′-CUCCUGAGCCAUUCUGAGCCUC-3′; anti-miR-1200序列为5′-GAGGCUCAGAAUGGCUCAGGAG-3′。
1.2.2 qRT-PCR检测基因表达
分别取适量组织样本和对数生长期的EC109细胞，均用Trizol试剂提取总RNA并进行纯度检测，取适量总RNA配置反转录反应溶液并反应合成cDNA。完成后将cDNA作为模板进行qRT-PCR反应，即95 ℃预变性2 min, 95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共循环40次。使用LightCycler480型荧光定量PCR仪分析相关基因的相对表达量。circ_0005273正向引物序列为5′-AAGATTTCTGCCCAGCAGACC-3′, 反向引物序列为5′-ACCAGGGTAGCCAGAAACCT-3′; STAT3正向引物序列为5′-TCTGTGTGACACCAACGACC-3′, 反向引物序列为5′-TCCTCACATGGGGGAGGTAG-3′; GAPDH正向引物序列为5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′, 反向引物序列为5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′; miR-1200正向引物序列为5′-GTATGAGCTCCTGAGCCATTCTGA-3′, 反向引物序列为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAG-3′; U6正向引物序列为5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′, 反向引物序列为5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′。以GAPDH和U6为内参基因，相对表达量采用2-△△Ct法计算。
1.2.3 MTT法检测细胞增殖能力:
将EC109细胞接种于96孔板，每孔加入20 μL MTT试剂反应4 h和150 μL二甲亚砜(DMSO)反应5 min。将检测波长设为490 nm, 使用酶标仪检测各孔光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。
1.2.4 平板克隆形成实验检测集落形成数:
将EC109细胞接种于6孔板(每孔1×103个)，培养2周(每3 d更换1次培养液)，加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，依次分别加入甲醇(500 μL)与1%结晶紫染色液(400 μL), 采用蒸馏水洗涤后晾干拍照，观察集落形成数。
1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率:
将EC109细胞用PBS洗涤并离心，收集细胞沉淀并用缓冲液重悬。将细胞悬液与Annexin V-FITC和PI染液孵育，使用FACS Calibur流式细胞仪分析细胞凋亡率。
1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移能力:
将EC109细胞用无血清培养基重悬，然后接种至Transwell小室的上室，并向下室加入完全培养基。培养24 h后，将细胞用甲醇固定并用0.1%结晶紫染色液进行染色, 30 min后使用流水洗涤并晾干，于显微镜下观察细胞数量。
1.2.7 双荧光素酶报告基因实验检测目的基因的靶向关系:
Circular RNA Interactome、Targetscan预测结果显示, circ_0005273与miR-1200之间、miR-1200与STAT3之间分别存在结合位点。由上海钰博生物科技有限公司设计合成含有circ_0005273与miR-1200结合位点的野生型荧光素酶报告质粒(WT-circ_0005273)以及含有结合位点突变序列的突变型荧光素酶报告质粒(MUT-circ_0005273), 含有miR-1200与STAT3结合位点的野生型荧光素酶报告质粒(WT-STAT3)以及含有结合位点突变序列的突变型荧光素酶报告质粒(MUT-STAT3)。将EC109细胞按照每孔1×104个接种于6孔板，采用脂质体转染法将WT-circ_0005273、MUT-circ_0005273、WT-STAT3、MUT-STAT3分别与miR-1200 mimics、miR-NC共转染至EC109细胞，转染完成后将其放置于培养箱内, 24 h后使用荧光素对细胞活性进行检测。
1.2.8 蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达量:
采用RIPA裂解液提取总蛋白，然后用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒进行定量。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脱脂奶粉封闭后，膜与STAT3一抗(1∶1 000)或内参GAPDH抗体(1∶2 000)孵育过夜，然后与二抗(1∶5 000)反应2 h。使用ECL化学发光液显示蛋白条带，并应用Gel-Pro32软件进行灰度分析。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验或单因素方差分析, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 circ_0005273、miR-1200、STAT3在食管癌组织和癌旁组织中的表达
食管癌组织中circ_0005273表达量、STAT3蛋白表达量高于癌旁组织, miR-1200表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 1。
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图 1 食管癌组织与癌旁组织中circ_0005273、miR-1200、STAT3表达情况比较(n=51)A: qRT-PCR检测circ_0005273表达(两者比较, *P<0.05); B: qRT-PCR检测miR-1200表达(两者比较, *P<0.05); C: Western blot检测STAT3蛋白表达(与癌旁组织比较, *P<0.05)。2.2 干扰circ_0005273对EC109细胞增殖、凋亡、迁移的影响
si-circ组miR-1200表达量、细胞增殖抑制率、凋亡率均高于对照组、si-参照组, circ_0005273表达量、STAT3蛋白表达量、集落形成数和迁移细胞数均低于或少于对照组、si-参照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 2、表 1。
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图 2 干扰circ_0005273对EC109细胞凋亡及STAT3蛋白表达的影响A: 流式细胞术检测各组细胞凋亡率; B: Western blot检测各组STAT3蛋白表达。表 1 干扰circ_0005273对miR-1200、STAT3表达和细胞增殖、迁移、凋亡的影响(x±s)组别 n circ_0005273 miR-1200 STAT3 抑制率/% 集落形成数/个 凋亡率/% 迁移细胞数/个 对照组 3 1.00±0 1.00±0 0.63±0.05 0±0 122.00±2.16 8.14±0.25 173.67±3.68 si-参照组 3 1.00±0.01 0.99±0.02 0.65±0.05 0.01±0.01 120.67±3.68 8.03±0.28 174.33±4.50 si-circ组 3 0.18±0.01*# 3.86±0.07*# 0.24±0.01*# 59.31±2.27*# 56.00±1.63*# 23.28±0.73*# 74.67±2.49*# circ_0005273: 环状RNA_0005273; miR-1200: 微小RNA-1200; STAT3: 信号转导与转录活化因子3。与对照组比较, *P < 0.05; 与si-参照组比较, #P < 0.05。 2.3 过表达miR-1200对EC109细胞增殖、凋亡、迁移的影响
miR-1200组STAT3蛋白表达量、集落形成数、迁移细胞数均低于或少于对照组、miR-参照组, miR-1200表达量、细胞增殖抑制率、凋亡率均高于对照组、miR-参照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 3、表 2。
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图 3 过表达miR-1200对EC109凋亡及STAT3蛋白表达的影响A: 流式细胞术检测各组细胞凋亡率; B: Western blot实验检测各组STAT3蛋白表达。表 2 过表达miR-1200对STAT3表达和EC109细胞增殖、迁移、凋亡的影响(x±s)组别 n miR-1200 STAT3 抑制率/% 集落形成数/个 凋亡率/% 迁移细胞数/个 对照组 3 1.00±0 0.63±0.05 0±0 122.67±1.70 8.16±0.37 173.33±3.86 miR-参照组 3 1.01±0.01 0.62±0.06 0±0.01 121.67±3.30 8.07±0.40 172.33±5.44 miR-1200组 3 3.38±0.09*# 0.34±0.02*# 50.99±1.58*# 67.00±2.16*# 20.60±0.80*# 85.00±3.27*# 与对照组比较, *P < 0.05; 与miR-参照组比较, #P < 0.05。 2.4 circ_0005273与miR-1200的靶向关系分析
circular RNA Interactome预测结果显示, circ_0005273与miR-1200存在结合位点，见图 4。miR-1200组WT-circ_0005273低于miR-参照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 2组MUT-circ_0005273比较，差异无统计学意义(P>0.05), 表明miR-1200过表达可降低WT-circ_0005273载体的荧光素酶活性，但对MUT-circ_0005273载体的荧光素酶活性无影响，见表 3。
表 3 circ_0005273与miR-1200靶向关系的双荧光素酶报告基因实验结果(x±s)组别 n WT-circ_0005273 MUT-circ_0005273 miR-参照组 3 0.99±0.04 1.01±0.05 miR-1200组 3 0.32±0.03* 0.99±0.06 与miR-参照组比较, *P < 0.05。 2.5 miR-1200与STAT3的靶向关系分析
Targetscan预测结果显示, miR-1200与STAT3存在结合位点，见图 5。miR-1200组WT-STAT3低于miR-参照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 2组MUT-STAT3比较，差异无统计学意义(P>0.05), 表明miR-1200过表达可降低WT-STAT3载体的荧光素酶活性，但对MUT-STAT3载体的荧光素酶活性无影响，见表 4。
表 4 miR-1200与STAT3靶向关系的双荧光素酶报告基因实验结果(x±s)HT6SS]组别 n WT-STAT3 MUT-STAT3 miR-参照组 3 1.02±0.05 1.03±0.04 miR-1200组 3 0.19±0.02* 0.96±0.05 与miR-参照组比较, *P < 0.05。 2.6 抑制miR-1200对干扰circ_0005273后的EC109细胞增殖、凋亡、迁移的影响
si-circ组STAT3蛋白表达、集落形成数、迁移细胞数低于或少于对照组，细胞增殖抑制率、凋亡率高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05); si-circ+anti组STAT3蛋白表达、集落形成数、迁移细胞数高于或多于si-circ组，细胞增殖抑制率、凋亡率低于si-circ组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 6、表 5。由此提示，抑制miR-1200可逆转干扰circ_0005273对EC109细胞增殖、迁移的抑制作用及凋亡诱导作用。
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图 6 抑制miR-1200对干扰circ_0005273后的EC109细胞凋亡、STAT3蛋白表达的影响A: 流式细胞术检测各组细胞凋亡率; B: Western blot检测各组STAT3蛋白表达。表 5 抑制miR-1200对干扰circ_0005273后的EC109细胞增殖、迁移、凋亡的影响(x±s)组别 n miR-1200 STAT3 抑制率/% 集落形成数/个 凋亡率/% 迁移细胞数/个 对照组 3 1.00±0 0.64±0.04 0±0 122.33±3.09 8.12±0.39 175.33±5.44 si-circ组 3 3.85±0.11* 0.24±0.01* 59.49±2.25* 56.67±1.70* 23.44±0.96* 75.67±1.70* si-circ+anti组 3 1.36±0.07# 0.51±0.04# 12.87±0.54# 108.67±2.49# 13.01±0.59# 145.33±4.03# 与对照组比较, *P < 0.05; 与si-circ组比较, #P < 0.05。 3. 讨论
circRNA主要存在于细胞质中，近年来多种新型circRNA如circ_0003340、circRNA PRKCI、circ_0006168、circ_0004370被证实在食管癌中异常表达，参与食管癌病理过程并发挥重要作用，或可作为食管癌的潜在治疗靶点[8-11]。胰腺癌组织中的circ_0005273呈高表达，淋巴结转移、远处转移及预后变化均与该指标表达异常升高有关，抑制circ_0005273表达可抑制胰腺癌细胞增殖与迁移[12]。circ_0005273在乳腺癌组织和细胞系中高表达，下调其表达可抑制乳腺癌细胞增殖与迁移，进而抑制乳腺癌进展[13]。乳头状甲状腺癌组织和细胞系中circ_0005273表达上调，敲除circ_0005273可抑制细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭[14]。但食管癌中circ_0005273表达变化的具体机制及作用目前尚未阐明。本研究发现，食管癌组织中circ_0005273表达量高于癌旁组织，而干扰circ_0005273表达可升高食管癌细胞增殖抑制率和凋亡率，使集落形成数和迁移细胞数减少。
目前, circ_0005273靶向调控的微小RNA(miRNA)种类尚不明确。本研究发现，在干扰circ_0005273后，食管癌细胞中miR-1200呈高表达变化趋势，进一步证实circ_0005273可靶向结合miR-1200。由此提示, circ_0005273在食管癌病理过程中有参与并通过靶向结合miR-1200发挥重要作用。相关研究[15-16]显示, miR-1200在神经胶质瘤、胃癌组织中表达下调，上调其表达则可抑制细胞增殖及转移。本研究结果显示, miR-1200在食管癌组织中表达下调，过表达miR-1200可抑制食管癌细胞增殖、克隆和迁移，并诱导细胞凋亡，表明miR-1200在食管癌发生发展过程中具有抑癌基因作用。本研究还发现，上调食管癌细胞中miR-1200表达可抑制STAT3蛋白表达，而干扰circ_0005273表达也可抑制STAT3蛋白表达。食管癌组织中STAT3蛋白表达量显著高于癌旁组织，进一步证实STAT3是miR-1200的靶基因，提示circ_0005273可通过靶向结合miR-1200而正向调控STAT3的表达。STAT3属于信号转导与转录活化因子(STATs)家族成员之一，可促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和抑制细胞凋亡，进而发挥癌基因作用[17-18]。研究[19]显示，抑制STAT3表达可促进舌鳞癌细胞凋亡，抑制细胞增殖及移植瘤生长。本研究结果显示，抑制miR-1200可以逆转circ_0005273敲低对食管癌细胞生长、克隆形成和迁移的抑制作用，提示circ_0005273可靶向miR-1200/STAT3轴，进而促进食管癌的恶性进程。
综上所述，食管癌组织中circ_0005273和STAT3呈高表达, miR-1200呈低表达，干扰circ_0005273表达可通过上调miR-1200表达和下调STAT3表达而发挥抑制食管癌细胞增殖、迁移的作用，并诱导细胞凋亡。circ_0005273在食管癌中发挥癌基因作用，或可作为食管癌的潜在治疗靶点。
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图 1 食管癌组织与癌旁组织中circ_0005273、miR-1200、STAT3表达情况比较(n=51)
A: qRT-PCR检测circ_0005273表达(两者比较, *P<0.05); B: qRT-PCR检测miR-1200表达(两者比较, *P<0.05); C: Western blot检测STAT3蛋白表达(与癌旁组织比较, *P<0.05)。
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图 2 干扰circ_0005273对EC109细胞凋亡及STAT3蛋白表达的影响
A: 流式细胞术检测各组细胞凋亡率; B: Western blot检测各组STAT3蛋白表达。
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图 3 过表达miR-1200对EC109凋亡及STAT3蛋白表达的影响
A: 流式细胞术检测各组细胞凋亡率; B: Western blot实验检测各组STAT3蛋白表达。
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图 6 抑制miR-1200对干扰circ_0005273后的EC109细胞凋亡、STAT3蛋白表达的影响
A: 流式细胞术检测各组细胞凋亡率; B: Western blot检测各组STAT3蛋白表达。
表 1 干扰circ_0005273对miR-1200、STAT3表达和细胞增殖、迁移、凋亡的影响(x±s)
组别 n circ_0005273 miR-1200 STAT3 抑制率/% 集落形成数/个 凋亡率/% 迁移细胞数/个 对照组 3 1.00±0 1.00±0 0.63±0.05 0±0 122.00±2.16 8.14±0.25 173.67±3.68 si-参照组 3 1.00±0.01 0.99±0.02 0.65±0.05 0.01±0.01 120.67±3.68 8.03±0.28 174.33±4.50 si-circ组 3 0.18±0.01*# 3.86±0.07*# 0.24±0.01*# 59.31±2.27*# 56.00±1.63*# 23.28±0.73*# 74.67±2.49*# circ_0005273: 环状RNA_0005273; miR-1200: 微小RNA-1200; STAT3: 信号转导与转录活化因子3。与对照组比较, *P < 0.05; 与si-参照组比较, #P < 0.05。 
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表 2 过表达miR-1200对STAT3表达和EC109细胞增殖、迁移、凋亡的影响(x±s)
组别 n miR-1200 STAT3 抑制率/% 集落形成数/个 凋亡率/% 迁移细胞数/个 对照组 3 1.00±0 0.63±0.05 0±0 122.67±1.70 8.16±0.37 173.33±3.86 miR-参照组 3 1.01±0.01 0.62±0.06 0±0.01 121.67±3.30 8.07±0.40 172.33±5.44 miR-1200组 3 3.38±0.09*# 0.34±0.02*# 50.99±1.58*# 67.00±2.16*# 20.60±0.80*# 85.00±3.27*# 与对照组比较, *P < 0.05; 与miR-参照组比较, #P < 0.05。
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表 3 circ_0005273与miR-1200靶向关系的双荧光素酶报告基因实验结果(x±s)
组别 n WT-circ_0005273 MUT-circ_0005273 miR-参照组 3 0.99±0.04 1.01±0.05 miR-1200组 3 0.32±0.03* 0.99±0.06 与miR-参照组比较, *P < 0.05。
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表 4 miR-1200与STAT3靶向关系的双荧光素酶报告基因实验结果(x±s)HT6SS]
组别 n WT-STAT3 MUT-STAT3 miR-参照组 3 1.02±0.05 1.03±0.04 miR-1200组 3 0.19±0.02* 0.96±0.05 与miR-参照组比较, *P < 0.05。
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表 5 抑制miR-1200对干扰circ_0005273后的EC109细胞增殖、迁移、凋亡的影响(x±s)
组别 n miR-1200 STAT3 抑制率/% 集落形成数/个 凋亡率/% 迁移细胞数/个 对照组 3 1.00±0 0.64±0.04 0±0 122.33±3.09 8.12±0.39 175.33±5.44 si-circ组 3 3.85±0.11* 0.24±0.01* 59.49±2.25* 56.67±1.70* 23.44±0.96* 75.67±1.70* si-circ+anti组 3 1.36±0.07# 0.51±0.04# 12.87±0.54# 108.67±2.49# 13.01±0.59# 145.33±4.03# 与对照组比较, *P < 0.05; 与si-circ组比较, #P < 0.05。
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