Mechanism of Shenqitang Shen'an Capsule containing serum on activity and ultrastructure of renal tubular epithelial cells as well as NLR family pyrin domain containing 3 inflammasome injured by lipopolysaccharide
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摘要:目的
探讨参芪糖肾安胶囊含药血清对脂多糖(LPS)损伤的肾小管上皮细胞活性、超微结构及NLR蛋白3(NLRP3)炎性小体的影响。
方法随机将HK-2细胞分为空白组(HK-2+75 μL 7.5%空白血清)、LPS组(HK-2+LPS+75 μL 7.5%空白血清)、低浓度组(HK-2+LPS+75 μL 2.5%含药血清+75 μL 7.5%空白血清)、中浓度组(HK-2+LPS+75 μL 5%含药血清+75 μL 5%空白血清)、高浓度组(HK-2+LPS+150 μL 10%含药血清)。采用CCK-8法检测细胞存活率; 采用流式细胞仪检测细胞凋亡率; 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平; 采用电镜检测细胞的超微结构; 采用蛋白质印迹检测细胞中NLRP3和caspase-1蛋白表达。
结果与空白组相比, LPS组细胞存活率降低，凋亡率及细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平增高，差异有统计学意义(P < 0.05); 与LPS组相比，低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞存活率均增高，凋亡率及细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。LPS组较空白组出现明显的程序性坏死，细胞体积变大，胞膜大量破裂，细胞大量坏死; 与LPS组相比，低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞均有明显改善，坏死的细胞数量减少，仅可见少量细胞线粒体轻度肿胀和空泡样变，且呈剂量依赖性。与空白组相比，LPS组细胞中NLRP3和caspase-1蛋白表达升高，差异有统计学意义(P < 0.05); 与LPS组相比，低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞中NLRP3和caspase-1蛋白表达降低，且高浓度组细胞中NLRP3和caspase-1蛋白表达低于低浓度组和中浓度组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论参芪糖肾安胶囊含药血清可抑制LPS损伤的肾小管上皮细胞凋亡，增加细胞存活率，改善超微结构，抑制NLRP3炎性小体介导的炎性反应，对急性肾损伤发挥保护作用。
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关键词:
- 参芪糖肾安胶囊含药血清 /
- 脂多糖 /
- 肾小管上皮细胞 /
- 超微结构 /
- NLRP3炎性小体
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Shenqitang Shen'an Capsule containing serum on the activity, ultrastructure and NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) inflammatory vesicles in lipopolysaccharide (LPS)-injured renal tubular epithelial cells.
MethodsHK-2 cells were randomly divided into blank group (HK-2+75 μL 7.5% blank serum), LPS group (HK-2+LPS+75 μL 7.5% blank serum), low concentration group (HK-2+LPS+75 μL 2.5% drug-containing serum+75 μL 7.5% blank serum), medium concentration group (HK-2+LPS+75 μL 5% drug-containing serum+75 μL 5% blank serum), and high concentration group (HK-2+LPS+150 μL 10% drug-containing serum). The cell survival rate was detected by CCK-8; the apoptosis rate was detected by flow cytometry; the levels of interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); the ultrastructure of the cells was detected by electron microscopy; the expression of NLRP3 and caspase-1 protein was detected by protein blotting.
ResultsCompared with the blank group, the cell survival rate was reduced, and apoptosis rate, the level of IL-6, IL-1β, and TNF-α in the cells of the LPS group were significantly decreased (P < 0.05). The cell survival rates in the low concentration group, medium concentration group, and high concentration group were higher than those in the LPS group, while the apoptosis rate and the levels of IL-6, IL-1β, and TNF-α in the cells were lower than those in the LPS group (P < 0.05). Compared with the blank group, LPS group showed obvious programmed necrosis, cell volume increased, cell membrane ruptured and cell necrosis. Compared with LPS group, the cells in the low concentration group, medium concentration group and high concentration group were significantly improved, the number of necrotic cells was reduced, and only a few cell mitochondria were slightly swollen and vacuole-like changes were observed in a dose-dependent manner. Compared with the blank group, the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in the cells of the LPS group was significantly increased (P < 0.05). The protein expressions of NLRP3 and caspase-1 in the cells of the low concentration group, medium concentration group, and high concentration group were significantly lower than those in the LPS group (P < 0.05), and the protein expressions of NLRP3 and caspase-1 in the cells of the high concentration group were significantly lower than those in the low concentration group and medium concentration group (P < 0.05).
ConclusionShenqitang Shen'an Capsule containing serum can inhibit apoptosis of LPS-injured renal tubular epithelial cells, increase cell survival rate, improve ultrastructure, inhibit NLRP3 inflammatory vesicle-mediated inflammatory response, and exert protective effects on AKI.
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颅脑损伤是由外力打击、交通事故、高处坠落等原因引起的头部损伤。根据损伤程度，颅脑损伤可分为轻型、中型和重型[1]。轻型颅脑损伤通常不会造成长期或严重的神经功能障碍。中型颅脑损伤患者可能会出现剧烈头痛、频繁呕吐、意识障碍等症状。重型颅脑损伤患者则可能出现嗜睡、昏睡、昏迷甚至死亡[2-3]。虽然及时予以手术干预可提高患者生存率，但疾病自身和术中有创操作均可导致脑室内液体过度积聚，继而促使部分患者术后出现继发性脑积水[4]。继发性脑积水不仅会导致患者颅内压力增加，甚至还可能引发脑疝。因此，早期识别重型颅脑损伤患者术后发生继发性脑积水的相关因素显得尤为重要[5]。目前，已有学者[6]对重型颅脑损伤术后继发性脑积水的相关因素进行报道，但关于这些因素的确切性仍存在争议，且缺乏有效预测术后继发性脑积水的风险预测模型。本研究筛选继发性脑积水的影响因素，并构建列线图模型，以期为术后继发性脑积水的临床预防和治疗提供依据。
1. 对象与方法
1.1 研究对象
回顾性分析2022年1月—2023年5月收治的360例重型颅脑损伤患者的临床资料。所有患者均参考《颅脑创伤临床救治指南》[7]规范，行开颅手术，术后予以规范化治疗方案。术后对患者进行为期半年的随访，并根据是否发生继发性脑积水将其分为脑积水组和非脑积水组。纳入标准: ①符合《现代颅脑损伤学》[8]中相关诊断标准者; ②年龄≥18周岁，符合手术适应证者; ③经颅脑MRI或颅脑CT确诊，格拉斯哥昏迷评分法(GCS)评分≤8分，且临床资料齐全者; ④手术治疗后生存期长于半年者。排除标准: ①有颅脑手术史者; ②伴有脑血管疾病、血液性疾病及神经退行性疾病者; ③放弃治疗或未完成随访者; ④中途转院治疗或在随访期间死亡者。
1.2 方法
资料收集: 根据院内相关专家建议收集临床资料，包括性别、年龄、体质量指数、居住地、吸烟、饮酒、致伤原因、骨瓣位置、开放性颅脑损伤、颅内感染、脑室出血、中线移位程度、术前GCS评分、平均手术时间、去骨瓣减压、腰穿脑脊液置换以及硬膜敞开等资料。
脑积水诊断标准[9]: CT检查显示，患者侧脑室扩大，前角或颞角增宽2 mm以上; 第三脑室、第四脑室以及基底池均扩大，脑沟正常或消失; MRI检查显示，患者侧脑室扩张, T2加权像呈现高信号，两侧脑室顶夹角小于120 °。
1.3 统计学分析
采用SPSS 26.0软件进行数据分析。采用R(R3.5.3)软件包和rms程序包绘制列线图。计数资料以[n(%)]表示，行χ2检验。计量资料以(x±s)描述，行t检验。采用Logistic回归分析法筛选术后继发性脑积水的危险因素。检验水准α=0.05。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 脑积水组和非脑积水组患者的临床资料比较
360例患者中，术后发生继发性脑积水34例，继发性脑积水发生率为9.44%(34/360)。2组患者性别、年龄、体质量指数、居住地、吸烟、饮酒、致伤原因、骨瓣位置、平均手术时间资料比较，差异无统计学意义(P>0.05); 2组开放性颅脑损伤、颅内感染、脑室出血、中线移位程度、术前GCS评分、去骨瓣减压、腰穿脑脊液置换、硬膜敞开情况比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。
表 1 脑积水组和非脑积水组临床资料比较(x±s)[n(%)]临床资料 分类 脑积水组(n=34) 非脑积水组(n=326) t/χ2 P 性别 男 20(58.82) 196(60.12) 0.022 0.883 女 14(41.18) 130(39.88) 年龄/岁 53.24±8.26 54.77±9.13 0.938 0.349 体质量指数/(kg/m2) 22.71±2.02 22.35±2.43 0.834 0.405 居住地 乡村 18(52.94) 169(51.84) 0.015 0.903 城镇 16(47.06) 157(48.16) 吸烟 是 11(32.35) 126(38.65) 0.518 0.472 否 23(67.65) 200(61.35) 饮酒 是 14(41.18) 132(40.49) 0.006 0.938 否 20(58.82) 194(59.41) 致伤原因 交通伤 18(52.94) 152(46.63) 0.493 0.483 坠落伤 16(47.06) 174(53.37) 骨瓣位置 单侧 6(17.65) 62(19.02) 0.038 0.846 双侧 28(82.35) 264(80.98) 开放性颅脑损伤 是 20(58.82) 134(41.10) 3.949 0.047 否 14(41.18) 192(58.90) 颅内感染 是 16(47.06) 76(23.31) 9.125 0.003 否 18(52.94) 250(76.69) 脑室出血 是 22(64.71) 124(38.04) 9.083 0.003 否 12(35.29) 202(61.96) 中线移位程度 ≥12 mm 24(70.59) 140(42.94) 9.486 0.002 < 12 mm 10(29.41) 186(57.06) 术前GCS评分 3~5分 13(38.24) 52(15.95) 10.334 0.001 6~8分 21(61.76) 274(84.05) 平均手术时间 ≥3 h 19(55.88) 177(54.29) 0.031 0.860 < 3 h 15(44.12) 149(45.71) 去骨瓣减压 是 21(61.76) 111(34.05) 10.186 0.001 否 13(38.24) 215(65.95) 腰穿脑脊液置换 是 10(27.41) 52(15.95) 3.913 0.048 否 24(70.59) 274(84.05) 硬膜敞开 是 25(73.53) 148(45.40) 9.760 0.002 否 9(26.47) 178(54.60) GCS: 格拉斯哥昏迷评分法。 2.2 术后继发性脑积水的危险因素
以术后是否发生脑积水为因变量(发生=1, 未发生=0), 以表 1分析结果中P < 0.05的项目为自变量(赋值见表 2), 进行Logistic回归分析。分析结果显示，颅内感染、脑室出血、中线移位程度≥12 mm、术前GCS评分3~5分、去骨瓣减压、硬膜敞开是术后继发性脑积水的危险因素(P < 0.05)。见表 3。
表 2 变量赋值方式变量 赋值方式 术后是否继发性脑积水 未发生=0, 发生=1 开放性颅脑损伤 否=0, 是=1 颅内感染 否=0, 是=1 脑室出血 否=0, 是=1 中线移位程度 < 12 mm=0, ≥12 mm=1 术前GCS评分 6~8分=0, 3~5分=1 去骨瓣减压 否=0, 是=1 腰穿脑脊液置换 否=0, 是=1 硬膜敞开 否=0, 是=1 表 3 重型颅脑损伤患者术后继发性脑积水的危险因素分析因素 回归系数 标准误 Wald P OR 95%置信区间 下限 上限 颅内感染 1.021 0.408 6.254 0.012 2.777 1.247 6.183 脑室出血 1.156 0.412 7.871 0.005 3.176 1.417 7.119 中线移位程度≥12 mm 1.157 0.426 7.385 0.007 3.180 1.381 7.324 术前GCS评分3~5分 1.254 0.436 8.274 0.004 3.505 1.491 8.239 去骨瓣减压 1.151 0.411 7.842 0.005 3.162 1.413 7.076 硬膜敞开 1.318 0.439 9.033 0.003 3.736 1.582 8.823 常数 -5.552 0.681 66.513 < 0.001 0.004 — — 2.3 重型颅脑损伤患者术后继发性脑积水的列线图风险模型
基于颅内感染、脑室出血、中线移位程度≥12 mm、术前GCS评分3~5分、去骨瓣减压、硬膜敞开6项危险因素，构建预测重型颅脑损伤患者术后继发性脑积水风险的列线图模型，见图 1。模型一致性指数为0.874(95%CI: 0.839~0.909), 校正曲线与理想曲线基本相符，见图 2; 受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积为0.831(95%CI: 0.801~0.861), 见图 3。
3. 讨论
既往研究[10]显示，重型颅脑损伤患者术后继发性脑积水的发生率为15.2%。本研究随访期间发现34例患者发生继发性脑积水，继发性脑积水发生率为9.44%, 结果低于上述研究。究其原因可能与地区差异、研究设计及样本选取等多种因素有关，提示医务人员在临床治疗中应增加对术后继发性脑积水高危患者的关注。建议早期制定术后继发性脑积水的干预方案，以降低其发生率，从而促进患者康复。
存在颅内感染的重型颅脑损伤患者术后更易发生继发性脑积水[11]。正常情况下，脑脊液通过脑室系统进行循环并被吸收，但颅内感染可能导致脑组织水肿和血管扩张，从而增加颅内压力。这种压力的增加会阻塞脑室系统并干扰脑脊液的正常流动，进而使患者在术后更容易发生继发性脑积水。研究[12]发现，脑室出血患者术后更易发生继发性脑积水，与本研究结果一致。脑室出血会破坏脑室壁和脑脊液通路，导致脑脊液流动受阻并在脑室内积聚，继而导致患者术后更易出现继发性脑积水。另有研究[13]表明，中线移位程度较大的重型颅脑损伤患者，术后发生继发性脑积水的风险相对较高。中线移位程度的增加会压迫颅内结构，干扰脑脊液流动，从而使患者在术后更易出现继发性脑积水。GCS是临床常用于评估患者意识状态和神经功能损害程度的工具。GCS评分较低表明患者的神经功能受损更为严重，导致患者术后更易发生继发性脑积水。研究[14]发现，行去骨瓣减压治疗的重型颅脑损伤患者，术后发生继发性脑积水的风险较高。去骨瓣减压术通过切除部分颅骨以减轻颅内压力，然而，颅骨切除和颅内压力的减轻均可能引发脑脊液排出障碍，从而增加继发性脑积水的发生风险。列线图是一种基于历史数据的风险预测工具，通过分析时间序列数据的趋势和周期性变化来预测未来的发展趋势[15-16]。本研究构建的列线图模型的校正曲线与理想曲线基本一致，通过ROC曲线分析发现，列线图模型的曲线下面积为0.831, 提示该列线图模型对重型颅脑损伤患者术后发生继发性脑积水具有较好的预测效能。
综上所述，颅内感染、脑室出血、中线移位程度≥12 mm、术前GCS评分3~5分、去骨瓣减压、硬膜敞开是重型颅脑损伤患者术后继发性脑积水的危险因素。本研究构建的重型颅脑损伤患者术后继发性脑积水的列线图模型具有良好的风险预测效能，可为该类患者的早期防治提供参考。
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图 1 各组细胞存活率比较
A: 不同浓度含药血清细胞存活率比较，与LPS比较, *P < 0.05; B: 各组细胞存活率比较，与空白组比较, *P < 0.05; 与LPS组比较, #P < 0.05; 与低浓度组比较, △P < 0.05; 与中浓度组比较, ▲P < 0.05。
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图 2 各组细胞凋亡率比较
与空白组比较, *P < 0.05; 与LPS组比较, #P < 0.05; 与低浓度组比较, △P < 0.05; 与中浓度组比较, ▲P < 0.05。
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图 3 各组细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较
A: 各组IL-6水平比较; B: 各组IL-1β水平比较; C: 各组TNF-α水平比较。与空白组比较, *P < 0.05; 与LPS组比较, #P < 0.05; 与低浓度组比较, △P < 0.05; 与中浓度组比较, ▲P < 0.05。
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