Experimental study in vitro of ziyuglycoside Ⅱ in inhibition of proliferation, migration, invasion and induction of apoptosis of colon cancer cells
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摘要:目的
探讨地榆皂苷Ⅱ对结肠癌细胞HT-29增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用并探讨其作用机制。
方法采用CCK-8法检测地榆皂苷Ⅱ对细胞增殖的影响, 采用划痕试验检测地榆皂苷Ⅱ对细胞迁移能力的影响，采用Transwell小室实验检测地榆皂苷Ⅱ对细胞侵袭能力的影响，采用流式细胞术测定地榆皂苷Ⅱ对细胞凋亡的影响，分别采用实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法测定地榆皂苷Ⅱ对细胞中蛋白激酶B (AKT)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路mRNA和蛋白表达的影响。
结果地榆皂苷Ⅱ(0、1、5、10、20、40、60和80 μmol/mL)可剂量依赖性抑制结肠癌细胞HT-29的增殖; 地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性抑制结肠癌细胞HT-29的迁移能力; 地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性抑制结肠癌细胞HT-29的侵袭能力; 地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性促进结肠癌细胞HT-29的凋亡; 地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性降低结肠癌细胞HT-29中AKT和PI3K mRNA的表达，增加Caspase-3和Caspase-9 mRNA的表达; 地榆皂苷Ⅱ(5、10和20 μmol/mL)可剂量依赖性地降低结肠癌细胞HT-29中磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)蛋白的表达，增加Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白的表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论地榆皂苷Ⅱ具有抑制结肠癌细胞HT-29的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡作用，可能与其促进AKT和PI3K蛋白磷酸化、Caspase-3和Caspase-9蛋白活化而调节AKT/PI3K信号通路有关。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and its mechanism of ziyuglycoside Ⅱ on proliferation, migration, invasion and apoptosis of colon cancer cells HT-29.
MethodsThe effect of ziyuglycoside Ⅱ on cell proliferation of colon cancer cells HT-29 was determined by CCK-8 method; the effect of ziyuglycoside Ⅱ on cell migrative capacity of colon cancer cells HT-29 was determined by scratch assay; the effect of ziyuglycoside Ⅱ on cell invasive capacity of colon cancer cells HT-29 was determined by transwell assay; the effects of ziyuglycoside Ⅱ on cell apoptosis of colon cancer cells HT-29 was determined by flow cytometry; the effects of ziyuglycoside Ⅱ on mRNA and protein expression of protein kinase B (AKT)/phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) signal pathway were determined by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) and western-blot, respectively.
ResultsZiyuglycoside Ⅱ (0, 1, 5, 10, 20, 40, 60 and 80 μmol/mL) inhibited proliferation of colon cancer cells HT-29 in a dose-dependent manner. Ziyuglycoside Ⅱ (5, 10 and 20 μmol/mL) inhibited migration of colon cancer cells HT-29 in a dose-dependent manner. Ziyuglycoside Ⅱ (5, 10 and 20 μmol/mL) inhibited invasion of colon cancer cells HT-29 in a dose-dependent manner. Ziyuglycoside Ⅱ (5, 10 and 20 μmol/mL) promoted apoptosis of colon cancer cells HT-29 in a dose-dependent manner. Ziyuglycoside Ⅱ (5, 10 and 20 μmol/mL) increased mRNA expression of AKT and PI3K, decreased mRNA expression of Caspase-3 and Caspase-9. Ziyuglycoside Ⅱ (5, 10 and 20 μmol/mL) increased protein expression of phosphorylated protein kinase B(p-AKT) and phosphorylphosphatidylinositol-3-kinase (p-PI3K), increased the expression of Cleaved-Caspase-3 and Cleaved-Caspase-9 protein.
ConclusionZiyuglycoside Ⅱ can inhibit proliferation, migration and invasion of colon cancer cells HT-29, and promote the apoptosis of colon cancer cells HT-29. Its mechanism may be related to regulating the signal pathway of AKT/PI3K via promoting phosphorylation of AKT and PI3K protein, activation of Caspase-3 and Caspase-9 protein.
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Keywords:
- ziyuglycoside Ⅱ /
- colon cancer /
- cell proliferation /
- cell migration /
- cell invasion /
- cell apoptosis /
- AKT/PI3K signaling pathway
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表 1 qRT-PCR引物序列
引物 序列 AKT 上游: 5′-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3′ 下游: 5′-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3′ PI3K 上游: 5′-CAATACTTGATGTGGCTGAC-3′ 下游: 5′-CCTCGCAATAGGTTCTCC-3′ Caspase-3 上游: 5′- CAAGAGGTCCTGTCTTCAGATGA-3′ 下游: 5′- TCTGTTTCCGTTTCCTGGTTC-3′ Caspase-9 上游: 5′- GTGATAAAG GTTTCGGTTGCTG -3′ 下游: 5′- TGTTTTCTGTGGCTCCTCCTCTGG -3′ GAPDH 上游: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCTA-3′ 下游: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCTA-3′ 
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表 2 地榆皂苷Ⅱ抑制结肠癌HT-29细胞增殖作用的测定结果(n=6)(x±s)
% 地榆皂苷Ⅱ浓度/(μmol/mL) 培养24 h 培养48 h 0 0.62±0.65 0.72±0.57 1 5.17±1.28 11.47±1.75 5 12.63±1.65 21.64±1.63 10 35.36±2.36 45.46±2.75 20 47.52±2.75 59.31±3.49 40 55.41±3.81 71.28±4.32 60 64.37±4.50 84.67±4.75 80 72.75±4.14 91.52±4.67
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表 3 地榆皂苷Ⅱ抑制结肠癌HT-29细胞迁移作用的测定结果(n=6)(x±s)
地榆皂苷Ⅱ浓度/(μmol/mL) 相对迁移率/% 0 62.75±5.39 5 46.45±4.35* 10 31.27±2.87*# 20 12.34±1.43*#△ 与0 μmol/L比较, *P＜0.05; 与5 μmol/L比较, #P＜0.05; 与10 μmol/L比较, △P＜0.05。
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表 4 地榆皂苷Ⅱ抑制结肠癌HT-29细胞侵袭作用的测定结果(n=6)(x±s)
地榆皂苷Ⅱ浓度/(μmol/mL) 相对侵袭率/% 0 54.61±4.79 5 41.28±4.52* 10 27.43±3.17*# 20 15.68±2.25*#△ 与0 μmol/L比较, *P＜0.05; 与5 μmol/L比较, #P＜0.05; 与10 μmol/L比较, △P＜0.05。
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表 5 地榆皂苷Ⅱ促进结肠癌HT-29细胞凋亡作用的测定结果(n=6)(x±s)
地榆皂苷Ⅱ浓度/(μmol/mL) 细胞凋亡率/% 0 3.12±0.54 5 14.53±2.67* 10 29.15±3.45*# 20 42.49±4.12*#△ 与0 μmol/L比较, *P＜0.05; 与5 μmol/L比较, #P＜0.05; 与10 μmol/L比较, △P＜0.05。
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表 6 结肠癌HT-29细胞中AKT/PI3K信号通路相关mRNA表达水平的测定结果(n=6)(x±s)
地榆皂苷Ⅱ浓度/(μmol/mL) AKT PI3K Caspase-3 Caspase-9 0 4.87±0.27 4.35±0.27 2.54±0.15 1.69±0.15 5 4.35±0.31* 3.74±0.25* 3.16±0.18* 2.01±0.14* 10 3.34±0.29*# 3.12±0.21*# 3.68±0.17*# 2.25±0.13*# 20 2.27±0.25*#△ 2.03±0.15*#△ 4.12±0.21*#△ 2.87±0.15*#△ AKT: 蛋白激酶B; PI3K: 磷脂酰肌醇-3-激酶。与0 μmol/L比较, *P＜0.05;
与5 μmol/L比较, #P＜0.05; 与10 μmol/L比较, △P＜0.05。
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表 7 地榆皂苷Ⅱ调节结肠癌HT-29细胞中AKT/PI3K信号通路蛋白表达水平的测定结果(x±s)
地榆皂苷Ⅱ浓度 AKT p-AKT PI3K p-PI3K Caspase-3 Cleaved-Caspase-3 Caspase-9 Cleaved-Caspase-9 0 μmol/mL 1.54±0.07 1.17±0.08 1.61±0.09 1.78±0.13 2.01±0.12 0.87±0.05 1.09±0.09 0.35±0.04 5 μmol/mL 1.57±0.09 1.01±0.09* 1.63±0.12 1.52±0.11* 1.98±0.10 1.11±0.06* 1.12±0.08 0.63±0.05* 10 μmol/mL 1.63±0.10 0.73±0.08*# 1.67±0.10 1.37±0.07*# 1.96±0.09 1.36±0.08*# 1.07±0.07 0.84±0.08*# 20 μmol/mL 1.55±0.11 0.57±0.06*#△ 1.60±0.14 1.02±0.08*#△ 2.04±0.10 1.73±0.11*#△ 1.10±0.06 1.03±0.07*#△ AKT: 蛋白激酶B; p-AKT: 磷酸化蛋白激酶B; PI3K: 磷脂酰肌醇-3-激酶; p-PI3K: 磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶。
与0 μmol/L比较, *P＜0.05; 与5 μmol/L比较, #P＜0.05; 与10 μmol/L比较, △P＜0.05。
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