Mechanism of microRNA-15a-5p in enhancing the sensitivity of glioma cells to temozolomide by modulating RUNX1
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摘要:目的
探讨微小RNA-15a-5p(miR-15a-5p)影响胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移及胶质瘤细胞对替莫唑胺(TMZ)敏感性的机制。
方法选取胶质瘤细胞H4、SHG-44、正常星形胶质细胞HA1800及TMZ耐药H4细胞, 将miR-NC、miR-15a-5p mimics质粒分别转染至H4细胞，记为miR-NC组、miR-15a-5p组; 将Vector、OE-RUNX1质粒分别转染至miR-15a-5p组细胞，并分别用400 μmoL/L TMZ处理，分别记为miR-15a-5p+Vector组、miR-15a-5p+RUNX1组、TMZ+Vector组及TMZ+RUNX1组。miR-NC组、miR-15a-5p组细胞用400 μmoL/L TMZ处理，记为TMZ+miR-NC组、TMZ+miR-15a-5p组。未进行任何处理的细胞设为Control组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力。采用Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力。采用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞RUNX1 mRNA及miR-15a-5p表达水平。采用Western blot检测细胞RUNX1蛋白表达水平。采用TargetScan在线网站预测miR-15a-5p与RUNX1的结合位点。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-15a-5p与RUNX1的靶向关系。
结果H4、SHG-44细胞的RUNX1 mRNA及其蛋白表达水平高于HA1800细胞, H4、SHG-44细胞miR-15a-5p表达水平低于HA1800细胞，差异有统计学意义(P < 0.000 1)。与Control组比较, TMZ耐药H4细胞miR-15a-5p表达水平降低，差异有统计学意义(t=18.89, P < 0.000 1); 与Control组比较, TMZ耐药H4细胞RUNX1 mRNA及其蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(t=34.11、18.07, P < 0.000 1)。上调miR-15a-5p、TMZ均可抑制细胞的增殖、侵袭及迁移，而上调miR-15a-5p联合TMZ可显著抑制细胞的增殖、侵袭及迁移。miR-15a-5p可负性调控RUNX1表达。RUNX1过表达可逆转上调miR-15a-5p、TMZ对胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移的抑制作用。
结论miR-15a-5p负性调控RUNX1抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，以及提高肿瘤细胞对TMZ的敏感性。
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关键词:
- 微小RNA-15a-5p /
- RUNX1基因 /
- 胶质瘤 /
- 替莫唑胺
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of microRNA-15a-5p (miR-15a-5p) on the proliferation, invasion and migration of and its mechanism of sensitivity of glioma cells to temozolomide (TMZ).
MethodsGlioma cell lines H4 and SHG-44, normal astrocytes HA1800 and TMZ-resistant H4 cells were selected. H4 cells were transfected with miR-NC or miR-15a-5p mimics and recorded as the miR-NC group and the miR-15a-5p group, respectively. The cells of miR-15a-5p group was further transfected with Vector or OE-RUNX1 plasmids and treated with 400 μmoL/L TMZ, and recorded as miR-15a-5p+Vector group, miR-15a-5p+RUNX1 group, TMZ+Vector group and TMZ+RUNX1 group. Additionally, the miR-NC and miR-15a-5p groups were treated with 400 μmoL/L TMZ, and recorded as TMZ+miR-NC group and TMZ+miR-15a-5p group, respectively. Untreated cells served as the Control group. Cell proliferation was assessed using the Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) assay. Invasion and migration were evaluated by Transwell assays. RUNX1 mRNA and miR-15a-5p expression levels were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). RUNX1 protein expression was analyzed by Western blot. The binding sites between miR-15a-5p and RUNX1 were predicted using the TargetScan online database. The targeting relationship between miR-15a-5p and RUNX1 was validated by dual-luciferase reporter assays.
ResultsRUNX1 mRNA and its protein expression levels were significantly higher in H4 and SHG-44 cells compared to HA1800 cells, while miR-15a-5p expression was significantly lower in H4 and SHG-44 cells (P < 0.000 1). Compared with Control group, the expression level of miR-15a-5p in TMZ-resistant H4 cells was significantly lower (t=18.89, P < 0.000 1); compared with Control group, the expression level of RUNX1 mRNA and protein in TMZ-resistant H4 cells was significantly higher (t=34.11, 18.07, P < 0.000 1). Upregulation of miR-15a-5p and TMZ treatment both inhibited cell proliferation, invasion and migration, and the combination of miR-15a-5p upregulation and TMZ significantly enhanced these inhibitory effects. MiR-15a-5p negatively regulated RUNX1 expression. Overexpression of RUNX1 reversed the inhibitory effects of miR-15a-5p upregulation and TMZ on glioma cell proliferation, invasion, and migration.
ConclusionMiR-15a-5p negatively regulates RUNX1, thereby inhibiting the proliferation, invasion and migration of glioma cells and enhancing their sensitivity to TMZ.
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Keywords:
- microRNA-15a-5p /
- RUNX1 gene /
- glioma /
- temozolomide
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急性心肌梗死等心血管疾病目前已经成为威胁人类健康的主要疾病[1]。经皮冠状动脉介入术(PCI)是临床上治疗心肌梗死等疾病常用的一种有效方法，有利于闭塞冠状动脉血运重建，但术后易发生支架内血栓、再狭窄，进而出现各种心血管不良事件[2-3]。肌酸激酶同工酶(CK-MB)、脑钠肽(BNP)在诊断急性心肌梗死时具有重要作用[4-5]。杨淑娟等[6]研究表明，超敏C反应蛋白(hs-CRP)可为急性心肌梗死早期诊断及治疗提供重要依据。目前, BNP、CK-MB、hs-CRP与急性心肌梗死患者PCI后预后不良的相关性报道较少。本研究探讨急性心肌梗死患者血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平与PCI后预后不良的相关性，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年10月—2019年10月收治并行PCI的182例急性心肌梗死患者为研究对象。根据术后3个月内是否发生心血管不良事件将其分为预后不良组58例和预后良好组124例。预后不良组患者年龄45~76岁，平均(60.04±13.16)岁，男30例，女28例; 预后良好组患者年龄43~78岁，平均(59.63±12.74)岁，男66例，女58例。纳入标准: ①患者均符合诊断标准[7]; ②病例资料及影像学信息齐全者; ③无心脏瓣膜病、心脏附壁血栓、心功能不全等其他心脏疾病者; ④未合并肿瘤、肝肾功能不全者; ⑤经本院临床研究伦理委员会批准，患者均自愿参加。排除标准: ①有感染性疾病者; ②伴有凝血异常者; ③ 1个月内有手术史者。
查阅并收集患者一般资料，主要包括高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、血糖、高血压、糖尿病、支架长度、支架直径水平。
1.2 方法
采集受试者术后24 h空腹外周静脉血样，收集血清后采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测hs-CRP、BNP、CK-MB水平。BNP ELISA试剂盒(货号: CK-E10216)购自武汉益普生物科技有限公司; hs-CRP ELISA试剂盒(货号: YS05225B)购自上海雅吉生物科技有限公司; CK-MB ELISA试剂盒(货号: CM-0881H1)购自上海淳麦生物科技有限公司。酶标仪(型号: HBS-1096A)购自上海研卉生物科技有限公司; 心血管造影机(型号: PHILIPS FD20)购自荷兰飞利浦公司; 全自动生化分析仪(型号: Selectra E)购自上海玉研科学仪器有限公司。
1.3 观察指标
比较2组患者hs-CRP、BNP、CK-MB水平。术后随访患者3个月，随访时间截至2020年1月。记录患者术后支架内再狭窄[8](支架内或支架两端5 mm范围内管腔直径狭窄程度>50%定义为再狭窄)、心血管原因死亡、心绞痛、缺血性卒中、支架内血栓形成等心血管不良事件。
1.4 统计学分析
采用SPSS 23.0统计分析数据，计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验; 计数资料采用[n(%)]表示，组间比较行卡方检验; 采用Pearson法分析急性心肌梗死PCI后预后不良患者血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平相关性; 采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平对急性心肌梗死PCI后预后不良的预测价值; 采用多因素Logistic回归分析影响急性心肌梗死患者PCI后预后不良的因素。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组一般资料比较
2组性别、年龄、BMI、吸烟史、血糖、糖尿病、支架长度、支架直径、TG、TC、HDL-C比较，差异均无统计学意义(P>0.05); 预后不良组高血压比率、LDL-C水平高于预后良好组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 预后良好组与预后不良组一般资料比较(x±s)指标 预后良好组(n=124) 预后不良组(n=58) t/χ2 P 性别 男 66 30 0.036 0.850 女 58 28 年龄/岁 59.63±12.74 60.04±13.16 0.200 0.842 BMI/(kg/m2) 24.25±2.84 24.73±2.96 1.048 0.296 吸烟史 是 36 19 0.260 0.610 否 88 39 血糖/(mmol/L) 8.38±2.13 9.04±2.61 1.809 0.072 高血压 是 28 26 9.373 0.002 否 96 32 糖尿病 是 21 14 1.320 0.251 否 103 44 支架长度/mm 22.46±5.83 22.51±6.23 0.053 0.958 支架直径/mm 2.71±0.62 2.62±0.83 0.816 0.416 TG/(mmol/L) 1.84±0.69 2.00±0.67 1.471 0.143 TC/(mmol/L) 4.49±1.21 4.54±0.96 0.276 0.782 LDL-C/(mmol/L) 2.86±1.92 4.74±2.01 6.064 0.000 HDL-C/(mmol/L) 0.96±0.41 0.92±0.39 0.623 0.534 BMI: 体质量指数; TG: 甘油三酯; TC: 总胆固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇; HDL-C: 高密度脂蛋白胆固醇。 2.2 2血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平比较
预后不良组血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平均高于预后良好组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 预后良好组与预后不良组血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平比较(x±s)指标 预后良好组(n=124) 预后不良组(n=58) BNP/(ng/L) 572.19±132.86* 846.23±175.46 hs-CRP/(mg/L) 7.64±2.13* 10.56±2.82 CK-MB/(μg/L) 12.86±2.71* 21.98±7.13 BNP: 脑钠肽; hs-CRP: 超敏C反应蛋白;
CK-MB: 肌酸激酶同工酶。与预后不良组比较, *P < 0.05。2.3 急性心肌梗死PCI后预后不良患者血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平相关性
Pearson法分析结果显示，急性心肌梗死PCI后预后不良患者血清BNP与hs-CRP、CK-MB水平呈正相关(r=0.527, P < 0.05; r=0.541, P < 0.05), CK-MB与hs-CRP呈正相关(r=0.511, P < 0.05), 见图 1、2、3。
2.4 血清BNP、hs-CRP、CK-MB水平对急性心肌梗死PCI后预后不良的预测价值
以血清BNP、hs-CRP、CK-MB单个指标检验值及3者联合预测概率值为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血清BNP、hs-CRP、CK-MB预测急性心肌梗死PCI后预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.872(95% CI: 0.814~0.930)、0.763(95% CI: 0.682~0.844)、0.921(95%CI: 0.871~0.972), 截断值分别为723.961 ng/L、9.564 mg/L、17.075 μg/L, 特异度分别为87.9%、82.3%、94.4%, 敏感度分别为74.1%、63.8%、81.0%; 3者联合预测的曲线下面积为0.949(95%CI: 0.906~0.92), 特异度为93.5%, 敏感度为87.9%, 见图 4。
2.5 影响急性心肌梗死患者PCI后预后不良的多因素Logistic回归分析
将急性心肌梗死患者PCI后是否发生预后不良作为因变量，以高血压、LDL-C、hs-CRP、BNP、CK-MB为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，BNP、CK-MB是影响急性心肌梗死患者PCI后预后不良的独立危险因素(P < 0.05), 见表 3。
表 3 影响急性心肌梗死患者PCI后预后不良的多因素Logistic回归分析影响因素 B SE Wald OR 95%CI P BNP 0.628 0.421 2.225 1.874 1.238~2.836 0.006 hs-CRP 0.249 0.348 0.512 0.779 0.394~1.542 0.316 CK-MB 0.785 0.537 2.137 2.191 1.545~3.108 0.003 高血压 0.445 0.435 1.047 1.561 0.827~2.945 0.072 LDL-C 0.398 0.424 0.881 1.488 0.913~2.426 0.145 BNP: 脑钠肽; hs-CRP: 超敏C反应蛋白; CK-MB: 肌酸激酶同工酶。LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇。 3. 讨论
随着近年来PCI技术的应用日益普遍，急性心肌梗死患者死亡率呈下降趋势，但支架内再狭窄、心血管原因死亡等并发症仍会发生[9]。PCI后发生支架内再狭窄等心血管不良事件的机制较为复杂，目前无较为明确的检测指标[10]。单一的生化指标检测一般存在敏感度或特异性较低等问题，因此目前临床中常采用多项指标联合检测[11]。本研究初步探究血清BNP、hs-CRP、CK-MB对急性心肌梗死患者PCI后预后不良的预测价值。
BNP是一种天然激素，在心脏中具有广泛的生物活性[12]。肌酸激酶(CK)主要分布于心脏组织线粒体中，心肌损伤出现时，总CK含量的升高缺乏特异性，但其同工酶CK-MB特异性远高于CK[13]。BNP、CK-MB作为突发心血管疾病的危险因子，在急性心肌梗死的早期诊断中具有重要价值[14]。本研究中, PCI后预后不良患者血清BNP、CK-MB水平显著高于预后良好患者，且BNP、CK-MB是预后不良的独立危险因素。本研究中BNP、CK-MB表达趋势与朱丽娟[15]研究结果基本一致，提示高表达的BNP、CK-MB对心肌梗死患者PCI后预后不良可能有一定的预警作用，推测PCI后部分患者心肌缺血坏死，影响心室压力、导致室壁张力改变，心室肌细胞中大量合成BNP、CK-MB, 造成血清BNP、CK-MB水平升高。hs-CRP是反映炎症的敏感指标，近年来也被广泛用于冠心病诊断和预后预测，其可能通过调控冠心病患者内皮细胞炎症影响其病情[16]。本研究结果显示, PCI后预后不良患者血清hs-CRP表达水平升高，与苑广洋等[17]及尚少红等[18]研究相似，且hs-CRP与BNP、CK-MB均呈一定的相关性。这提示病理状态下血清BNP、CK-MB水平升高，可导致患者体内炎症加重, hs-CRP水平升高进一步刺激血管内皮细胞的炎症反应，进而引发血管内皮增生及动脉粥样硬化，造成患者预后较差。本研究ROC曲线结果显示，BNP、hs-CRP、CK-MB对预后不良均有一定的预测价值，其中CK-MB的预测价值最高，其AUC为0.921, 且敏感度和特异性也最高。BNP、hs-CRP、CK-MB联合后的AUC和敏感度有一定的提高，建议临床可采取多项指标联合检测以提高预测效能。
综上所述，血清BNP、hs-CRP、CK-MB高表达与急性心肌梗死患者PCI后预后不良的发生有关，其可作为预测预后不良的潜在参考指标。临床中可通过联合检测BNP、hs-CRP、CK-MB水平，有效预测患者预后，并为临床制订、调整治疗方案提供重要依据。本研究作为回顾性研究，病例选择可能存在偏倚因素，且上述指标具体作用机制也还需进一步研究验证。
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图 1 胶质瘤细胞、正常星形胶质细胞miR-15a-5p、RUNX1表达水平
A: Western blot检测RUNX1蛋白水平; B: 蛋白条带灰度分析结果; C: RUNX1 mRNA表达水平; D: miR-15a-5p表达水平。两者比较, ****P＜0.000 1。
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图 2 miR-15a-5p、RUNX1在TMZ处理细胞中的表达
A: Western blot检测RUNX1蛋白水平; B: 蛋白条带灰度分析结果; C: RUNX1 mRNA表达水平; D: miR-15a-5p表达水平。与Control比较, ****P＜0.000 1。
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图 3 上调miR-15a-5p、TMZ对胶质瘤细胞表型的影响
A: MTT检测细胞增殖能力; B: 各组侵袭、迁移细胞数量统计结果; C: Transwell实验检测侵袭、迁移能力(标尺100 μm)。
两者比较, **P＜0.01, ***P＜0.001。![]()
图 4 miR-15a-5p与RUNX1的靶向关系
A: miR-15a-5p与RUNX1的核苷酸结合位点; B: 双荧光素报告基因实验结果; C: Western blot检测SHG-44细胞RUNX1蛋白水平; D: 蛋白条带灰度分析结果; E: SHG-44细胞RUNX1 mRNA表达水平。两者比较, ****P＜0.000 1。
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