Regulating effect and mechanism of SLC1A5-TM4SF1 complex on cisplatin resistance in esophageal squamous cell carcinoma cells
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摘要:目的
探讨氨基酸转运载体溶质载体家族1成员5(SLC1A5)-四跨膜蛋白超家族成员1(TM4SF1)复合物对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞顺铂耐药的调控作用及分子机制。
方法通过慢病毒载体构建SLC1A5稳定过表达的Eca109细胞, 通过细胞活力试验检测SLC1A5对细胞顺铂敏感性的影响。采用蛋白质免疫印迹法(WB)检测SLC1A5在Eca109细胞及顺铂耐药Eca109细胞(Eca109-R)中的表达。在Eca109-R细胞中通过慢病毒载体敲低SLC1A5表达，检测敲低SLC1A5表达后细胞对顺铂的敏感性。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SLC1A5敲低对Eca109-R细胞中DNA损伤修复关键基因表达的影响。在SLC1A5敲低的Eca109-R细胞中，通过细胞活力试验检测过表达RAD50后细胞对顺铂的敏感性。在Eca109细胞中，利用慢病毒载体分别或共同过表达SLC1A5、TM4SF1, 通过细胞活力试验检测SLC1A5-TM4SF1复合物对RAD50表达及细胞顺铂耐药的影响。
结果与对照细胞相比，过表达SLC1A5的Eca109细胞对顺铂的耐药性增强，差异有统计学意义(P < 0.05)。Eca109-R细胞的SLC1A5蛋白表达升高，且与对照细胞相比，敲低SLC1A5表达的细胞对顺铂更敏感，差异有统计学意义(P < 0.05)。顺铂处理条件下, RAD50基因表达水平在敲低SLC1A5后显著下调(P < 0.05)。敲低SLC1A5会抑制RAD50蛋白表达，且与对照细胞相比，在SLC1A5敲低细胞中过表达RAD50可以大幅度恢复细胞对顺铂的耐药，差异有统计学意义(P < 0.05)。SLC1A5与TM4SF1同时过表达可进一步上调RAD50表达，且与对照细胞相比，细胞对顺铂的耐药性增强，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论SLC1A5-TM4SF1复合物通过上调RAD50表达，促进ESCC细胞对顺铂的耐药。
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关键词:
- 氨基酸转运载体溶质载体家族1成员5 /
- 四跨膜蛋白超家族成员1 /
- RAD50双链断裂修复蛋白 /
- 食管鳞状细胞癌 /
- 耐药 /
- 膜蛋白复合物
Abstract:ObjectiveTo investigate the regulatory effect and molecular mechanism of solute carrier family 1 member 5 (SLC1A5) -tetraspanin superfamily member 1 (TM4SF1) complex on cisplatin resistance in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cells.
MethodsSLC1A5-overexpressing Eca109 cells were constructed using lentiviral vectors, and the effect of SLC1A5 on cisplatin sensitivity was assessed through cell viability assays. Western blotting (WB) was employed to detect SLC1A5 expression in Eca109 cells and cisplatin-resistant Eca109 cells (Eca109-R). SLC1A5 expression was knocked down in Eca109-R cells using lentiviral vectors, and cisplatin sensitivity was examined thereafter. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was utilized to analyze the influence of SLC1A5 knockdown on the expression of key genes involved in DNA damage repair in Eca109-R cells. In SLC1A5-knockdown Eca109-R cells, cell viability assays were performed to evaluate the sensitivity to cisplatin after RAD50 overexpression. Additionally, Eca109 cells were separately or co-overexpressed with SLC1A5 and TM4SF1 using lentiviral vectors, and the effect of the SLC1A5-TM4SF1complex on RAD50 expression and cisplatin resistance was examined through cell viability assays.
ResultsCompared with control cells, Eca109 cells overexpressing SLC1A5 exhibited enhanced cisplatin resistance (P < 0.05). Eca109-R cells showed increased SLC1A5 protein expression, and knockdown of SLC1A5 cells were more sensitivity to cisplatin (P < 0.05). RAD50 gene expression was significantly downregulated upon SLC1A5 knockdown under cisplatin treatment (P < 0.05). Knockdown of SLC1A5 inhibited RAD50 protein expression, and overexpression of RAD50 in SLC1A5-knockdown cells significantly restored cisplatin resistance (P < 0.05). Co-overexpression of SLC1A5 and TM4SF1 can further up-regulate the expression of RAD50, and the drug resistance of the cells to cisplatin was enhanced compared with the control cells(P < 0.05).
ConclusionThe SLC1A5-TM4SF1 complex promotes cisplatin resistance in ESCC cells by upregulating RAD50 expression.
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癫痫是一种脑部神经元异常放电引起的慢性神经系统疾病，表现为短暂的意识丧失、肢体抽搐及意识状态改变等症状[1]。随着全球老龄化进程的加速，癫痫发病率呈逐年上升趋势，严重影响患者的心理健康和生活质量[2]。癫痫治疗方法主要包括药物治疗、手术治疗和其他辅助治疗[3]。目前，国内外关于癫痫护理质量的研究均侧重于对护理措施的制订和应用，且护理质量评价量表多为普适性量表，缺乏针对癫痫患者的特异性指标，故为癫痫患者的护理质量评估提供更为准确和全面的工具有重要意义。关于护理质量的评价方法在2016年被提出，主要以Donabedian结构-过程-结果理论模型作为框架，运用德尔菲法进行护理质量敏感指标研究[4]。本研究依据上述理论框架及方法，对癫痫患者护理质量敏感指标体系进行构建，旨在为提高癫痫患者护理质量提供参考依据。
1. 资料与方法
1.1 成立研究小组
研究小组成员共9名，包括本科室擅长癫痫诊治的主任医师1名、本科室护士长1名、本科及以上学历护士3名、心理咨询师1名、心理科护士1名、有护理研究学习背景的护士2名。研究小组成员中男1名，女8名，年龄28~39岁; 工龄6~17年; 职称为正高1名、副高级2名、中级6名; 学历为本科6名、硕士及以上3名。小组成员分别负责证据检索、质量评价、编制并发放函询问卷、整理分析专家意见和拟定护理质量敏感指标及统计分析等工作。
1.2 初步构建癫痫患者护理质量敏感指标条目池
1.2.1 文献检索策略
由研究组成员通过计算机检索中英文数据库，获取癫痫患者护理质量敏感指标研究的相关文献。中文文献数据库包括维普数据库、万方数据库、中国知网和中国生物医学文献数据库，检索词包括癫痫、羊癫风、羊角风、抽搐、护理敏感指标、护理质量、敏感指标、质量改进、护理质量改进、护理质量评价、评价指标、敏感性指标、质量指标及质量管理。英文文献数据库包括检索词检索英国国家医疗保健优化研究所(NICE)网站、国际指南协作网(GIN)、美国医师协会指南网(ACP)、英国国家临床医学研究所指南库以及PubMed、Cochrane Library、Embase、Wiley Online Library、Ovid、Web of Science、BMJ-Best Practice、Up To Date及JBI循证卫生保健中心网站等，检索词包括seizure、epilepsy、convulsion、quality indicators、sensitive indicators、nursing sensitive indicators、nursing-sensitive quality indicators、nursing indicator、assessment、index、quality indicator、index of nursing，检索时限均为建库至2022年6月1日。排除质量差、重复发表、无法获得全文的文献及非学术性文献，最终筛选出47篇文献。
1.2.2 文献纳入与排除标准
(1) 纳入标准。①文献中研究对象符合癫痫诊断标准; ②国内外公开发表并被学术数据库收录的文献; ③研究结果具有明确的敏感性、特异性和诊断效能值等指标的文献; ④依据Kendall的样本量估计方法，计算结果样本量充足且具有良好代表性的文献[5]。(2) 排除标准。①重复发表、质量差、信息报道不全且无法获取全文的文献; ②会议论文、摘要、新闻、宣传资料等非学术性文献; ③研究中未涉及癫痫患者护理内容且与癫痫患者护理质量不直接相关的文献。
1.2.3 文献筛选与质量评价
2名研究员采用霍普金斯证据级别与质量指南标准共同对纳入研究进行评价。在讨论后形成最终的文献质量评价，如遇分歧，咨询第3名研究者。
1.2.4 癫痫患者敏感指标条目池初稿形成
研究成员根据纳入文献的内容，并结合工作经验、临床护理相关政策、护理指南等，提炼护理质量评价指标，并进行整合和完善，构建癫痫患者护理质量敏感指标条目池。一级指标，包括结构、过程和结果质量；二级指标，包括科室配置、素养及技能、院内护理、院后护理、急救效果、护理效果、护理满意度和护理事故，并逐一细化上述指标；三级指标共46个，要求能够包含癫痫护理的各个环节。
1.3 确立癫痫患者护理质量敏感指标
1.3.1 选择函询专家
根据德尔菲法，至少纳入15名专家进行专家函询[6], 本研究于2022年1—6月选取郑州市、北京市、武汉市、重庆市的共20名该领域诊疗及护理专家进行调查。纳入标准: ①神经内科或癫痫诊疗领域专家; ②精神卫生或心理治疗领域专家; ③护理心理学领域专家; ④护理研究领域专家; ⑤专家职称为中级及以上; ⑥专家职务为护理部主任及副主任、科护士长、病区护士长及护理骨干。排除标准: ①长期不在职者，如离职、退休; ②罹患严重疾病者，如恶性肿瘤; ③存在认知功能及语言沟通功能退化者; ④不会使用电子邮件等电子往来设备者; ⑤近期无法及时沟通反馈者; ⑥专科学历者; ⑦本研究的研究组成员。所有纳入函询的专家均签署知情同意书，并表示积极参与，按时保质回馈信息。
1.3.2 制定专家函询问卷
第1轮专家函询问卷包括3个部分: ①前言，简明扼要说明本研究的背景、目的、意义、方法及填表注意事项; ②专家匿名基本资料调查，包括性别、年龄、职称、工作年限、地区等，以及对该领域内容的熟知程度; ③专家函询问卷正文，包括一级指标3项(结构质量、过程质量和结果质量)，二级指标共7项(科室配置、素养及技能、院内护理、院后护理、护理效果、护理满意度和护理事故)，三级指标共46项(学历、职称、护士和患者比例、排班方式、编制、离职率、急救物品完好率、急救护理培训或学习背景、急救药物使用合格率、癫痫镇静药物使用合格率、癫痫病情评估、癫痫发作期护理评估、病房环境、生命体征变化监测、心理护理、用药指导、健康教育、睡眠质量、饮食指导、急救用时、健康教育接受度、心理状态、住院时间及费用、再入院次数、康复效果、生活质量、患者满意度、家属满意度、陪护满意度、坠床、跌倒、感染、死亡、用药错误、急救延误、护患纠纷等)，并给予各级指标的评分(必填，其中1分表示很不重要; 2分表示不重要; 3分表示一般重要; 4分表示重要; 5分表示极其重要)，设置意见及建议栏。
1.4 统计学方法
采用SPSS 23.0软件进行数据分析。分类变量采用[n(%)]描述; 连续变量采用($\mathop x\limits^ - $ ±s)描述，专家积极程度通过计算调查表的回收率表示，专家权威程度通过专家权威系数(Cr)表示，计算公式为Cr=(Ca+Cs)/2, 其中Cs为专家熟悉程度系数, Ca为专家判断依据系数。专家意见协调程度通过变异系数(CV)和肯德尔协调系数(Kendall′s W)表示，要求筛选出的指标同时符合以下条件: CV < 0.3、0 < Kendall′s W < 1。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 文献检索及质量评价结果
检索时限均为建库至2022年6月1日，按文献纳入和排除标准，最终筛选出47篇文献。采用霍普金斯证据级别与质量指南标准进行评价，文献质量等级评定结果见表 1。
表 1 文献质量评价结果证据级别 质量评估 文献数量/篇 Ⅰ级 B 11 Ⅱ级 A 15 Ⅲ级 B 9 Ⅳ级 A 7 Ⅴ级 A 5 2.2 函询专家积极性及权威程度
依据专家纳入、排除标准，结合德尔菲法，本次函询共遴选专家20名，见表 2。第1轮发放问卷20份，回收有效问卷19份，回收率为95%; 第2轮函询专家为第1轮有效问卷回收专家，第2轮回收率为100%, 表明专家积极性高。第1轮与第2轮之间间隔4周，第1轮专家Ca为0.864, Cs为0.880, Cr为0.891。第2轮专家Ca为0.871, Cs为0.892, Cr为0.890。
表 2 函询专家基本情况表(n=20)基本资料 分类 n 占比/% 年龄 35~44岁 3 15.00 45~54岁 9 45.00 55~64岁 8 40.00 性别 男 8 40.00 女 12 60.00 学历 本科 8 40.00 硕士及以上 12 60.00 职称 中级 3 15.00 副高级 10 50.00 正高级 7 35.00 工作环境 学校 8 40.00 医院 12 60.00 工作年限 10~20年 4 20.00 >20~30年 10 50.00 >30年 6 30.00 专家来源地区 郑州市 6 30.00 武汉市 5 25.00 北京市 4 20.00 重庆市 5 25.00 2.3 专家意见协调程度
采用Kendall′s W系数反映专家对一组或全部指标进行重要性评分的一致程度。Kendall′s W为0~1, 表明专家对各项指标条目意见一致性良好，见表 3。
表 3 2轮专家函询各类型指标协调系数及其检验结果轮次 指标 W χ2 P 第1轮 一级指标 0.672 63.503 0.017 二级指标 0.566 124.489 0.002 三级指标 0.821 205.891 <0.001 第2轮 一级指标 0.742 83.240 <0.001 二级指标 0.736 104.937 <0.001 三级指标 0.865 194.535 <0.001 2.4 第1轮专家函询结果
第1轮专家函询后，根据筛选原则进行指标筛选，依据专家建议进行删除、修改与添加。删除10条:“急救用时”“住院时间及费用”“再入院次数”“死亡”“居家环境”“编制”“职称”“癫痫病情评估”“生命体征变化监测”和“睡眠质量”。修改12条:将“急救护理培训或学习背景”和“护理记录书写合格率”改成“岗位胜任力”;将“急救药物使用合格率”和“急救技术考核合格率”合并成“急救技能考察合格率”;将“陪护满意度”改成“合作医务人员(包括非家属陪护护工)满意度”;将“院内护理”中的“癫痫病情评估”和“生命体征变化监测”改成“病情控制”;将“急救物品完好率”改成“仪器保养与维护”将“健康教育接受度”改成“患者及家属健康教育知识掌握度”;将“癫痫药物使用合格率”改成“癫痫镇静药物10 min内执行时间符合率”;将“院后护理”中的“癫痫发作期评估”改成“家属对患者癫痫发作期评估”，并将其中的“心理护理”改成“心理及情绪调节技能指导”。添加6条:“疾病发作诱因控制”“定期随访”“性生活及运动指导”“睡眠调节指导”“并发症”和“原发病控制”。
2.5 第2轮专家函询结果
第2轮专家函询后，依据专家建议和统计分析数值判断将“离职率”和“病房环境”这2条指标删除[离职率重要性得分为(3.05±1.64)分, CV为0.42; 病房环境重要性得分为(3.22±0.65)分, CV为0.39]。
最终构建的癫痫患者护理质量敏感指标体系，包括一级指标3项、二级指标7项和三级指标35项。其中，“岗位胜任力”“癫痫镇静药物10 min内执行时间符合率”“原发病控制”“患者及家属健康教育知识掌握度”“心理调节技能指导”和“性生活及运动指导”是重要的敏感指标，见表 4。
表 4 癫痫护理质量敏感指标体系第2轮专家函询结果(±s)一级指标 二级指标 三级指标 重要性得分/分 变异系数 结构质量 配置 学历 4.00±0.87 0.22 护士和患者比例 4.94±0.24 0.05 排班方式 4.24±0.83 0.20 仪器保养与维护 4.29±0.59 0.14 素养及技能 岗位胜任力 4.35±0.60 0.14 急救技能考察合格率 4.88±0.33 0.07 癫痫镇静药物10 min内执行时间符合率 4.94±0.24 0.05 过程质量 院内护理 病情控制 4.94±0.24 0.05 癫痫发作期护理评估 4.01±0.36 0.19 并发症 4.24±0.83 0.20 心理护理 4.94±0.24 0.05 用药指导 4.24±0.83 0.20 健康教育 4.77±0.44 0.09 原发病控制 4.94±0.24 0.05 睡眠质量 4.94±0.24 0.05 院后护理 疾病发作诱因控制 4.94±0.24 0.05 家属对患者癫痫发作期评估 4.88±0.33 0.07 心理及情绪调节技能指导 4.65±0.61 0.13 用药及饮食指导 4.59±0.62 0.14 睡眠调节指导 4.94±0.24 0.05 性生活及运动指导 4.94±0.24 0.05 定期随访 4.94±0.24 0.05 结果质量 护理效果 患者及家属健康教育知识掌握度 4.71±0.59 0.13 心理状态 4.94±0.24 0.05 康复效果 4.94±0.24 0.05 生活质量 4.94±0.24 0.05 护理满意度 患者满意度 4.94±0.24 0.05 家属满意度 3.82±0.81 0.21 合作医务人员(包括非家属陪护护工)满意度 4.94±0.24 0.05 护理事故 坠床 4.94±0.24 0.05 跌倒 4.94±0.24 0.05 感染 4.94±0.24 0.05 用药错误 4.94±0.24 0.05 急救延误 4.94±0.24 0.05 护患纠纷 4.71±0.59 0.13 3. 讨论
国内外较为成熟的提高护理质量的方法有PDCA循环法、目标导向、需求导向等一系列方法[7-10], 但均偏于主观性。敏感指标为监测护理质量、可提供有效数据的量化评测工具，其应用于癫痫患者护理的研究较少[11-14]。本研究通过研究组查阅相关文献，结合工作经验构建癫痫患者的护理质量敏感指标体系。其中，针对药物治疗患者，护理质量敏感指标中“癫痫镇静药物10 min内执行时间符合率”“用药指导”等可有效提高患者服药依从性，控制癫痫发作，防止患者脑部进一步损伤。针对手术治疗患者，为防止其发生语言障碍、伤口感染以及出血等，将“心理护理”“健康教育”“并发症”和“睡眠调节指导”等护理质量敏感指标贯穿于术前、术中、术后护理中，最大限度减少手术应激反应，促进患者康复。此外，针对其他辅助治疗患者，护理质量敏感指标中“疾病发作诱因控制”“心理及情绪调节技能指导”等指标可有助于控制患者病情，提高护理质量。
癫痫患者护理质量敏感指标体系中全部指标重要性得分均>4分、CV为0~0.30。本研究结果显示，结构质量这一指标主要包括人力物力等配置，最终确定7项指标，包括学历、护士患者的比例、排班方式、仪器保养与维护、岗位胜任力、急救技能考核合格率和癫痫镇静药物10 min内执行时间符合率。病房环境重要性、离职率重要性得分均<4分, CV均>0.30, 予以删除。有7名专家认为病房环境属于结构指标，是仪器设备与人文素养共同营造的，并在结构指标中已有涵盖，根据评分予以删除。专家共同认为，相对一些客观性较强、外界影响因素较多的指标，如“岗位胜任力”，其是内在能力的展现[15], 对护理实施质量有一定的影响。此外，根据建议细化修改并添加癫痫药物的使用这一指标[16]。根据专家建议，将癫痫病情评估改成病情控制，更符合护理实施内容。本研究结果指标建设符合以患者为中心的护理理念。
本研究构建了癫痫患者护理质量敏感指标体系，以用于护理质量监测及方案制订，但只进行了初步构建，未来还需深入探讨，评估其信效度，以提高护理质量。
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图 1 SLC1A5对Eca109细胞顺铂耐药的影响
A: WB检测SLC1A5在Eca109细胞中的过表达效率; B: 不同浓度顺铂处理的Con组和SLC1A5-OE组Eca109细胞活力比较; C: WB检测SLC1A5在Eca109细胞和Eca109-R细胞中的表达。
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图 1 SLC1A5对Eca109细胞顺铂耐药的影响
A: WB检测SLC1A5在Eca109细胞中的过表达效率; B: 不同浓度顺铂处理的Con组和SLC1A5-OE组Eca109细胞活力比较; C: WB检测SLC1A5在Eca109细胞和Eca109-R细胞中的表达。
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图 2 干扰SLC1A5表达对ESCC细胞顺铂耐药的影响
A: WB验证SLC1A5在Eca109-R细胞中的干扰及回复效率; B: 不同浓度顺铂处理下的SLC1A5敲低及回复表达细胞活力比较。
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图 2 干扰SLC1A5表达对ESCC细胞顺铂耐药的影响
A: WB验证SLC1A5在Eca109-R细胞中的干扰及回复效率; B: 不同浓度顺铂处理下的SLC1A5敲低及回复表达细胞活力比较。
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图 4 SLC1A5对RAD50表达及ESCC细胞顺铂耐药的影响
A: WB验证SLC1A5和RAD50在各稳转细胞中的表达; B: 不同浓度顺铂处理下SLC1A5敲低及RAD50过表达细胞活力比较。
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图 4 SLC1A5对RAD50表达及ESCC细胞顺铂耐药的影响
A: WB验证SLC1A5和RAD50在各稳转细胞中的表达; B: 不同浓度顺铂处理下SLC1A5敲低及RAD50过表达细胞活力比较。
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图 5 SLC1A5-TM4SF1复合物对RAD50表达及ESCC细胞顺铂耐药的影响
A: WB验证SLC1A5、TM4SF1和RAD50在各稳转细胞中的表达; B: 不同浓度顺铂处理下SLC1A5、TM4SF1单一及共同过表达的稳转细胞活力比较。
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图 5 SLC1A5-TM4SF1复合物对RAD50表达及ESCC细胞顺铂耐药的影响
A: WB验证SLC1A5、TM4SF1和RAD50在各稳转细胞中的表达; B: 不同浓度顺铂处理下SLC1A5、TM4SF1单一及共同过表达的稳转细胞活力比较。
表 1 qRT-PCR相关引物序列
基因 方向 序列 53BP1 正向 5′-GCCTGATCAATGGACCCTACTGGAAGTCAGG-3′ 反向 5′-CCGCTCGAGTTAGTGAGAAACATAATCGTGT-3′ MDC1 正向 5′-TGCTCTTCACAGGAGTGGTG-3′ 反向 5′-GGGCACACAGGAACTTGACT-3′ BRCA1 正向 5′-CTGAAGACTGCTCAGGGCTATC-3′ 反向 5′-AGGGTAGCTGTTAGAAGGCTGG-3′ BARD1 正向 5′-AGCGTAGGGATGGACCTCTT-3′ 反向 5′-CCATTGAGAATCCCAAGCAT-3′ CHK1 正向 5′-ATATGAAGCGTGCCGTAGACT-3′ 反向 5′-TGCCTATGTCTGGCTCTATTCTG-3′ CHK2 正向 5′-AAGAAGTTGTTGGTAGTG-3′ 反向 5′-TTCCTCAGACAGAAGATC-3′ LIG4 正向 5′-TGCTGCTGAGTTGCATAATGT-3′ 反向 5′-AGCAGCTAGCATTGGTTTTGA-3′ RAD50 正向 5′-TCCACGATAGGTACTTCGCC-3′ 反向 5′-TGAGGACAACAGAACTTGTGAAC-3′ RAD51 正向 5′-GGTCTGGTGGTCTGTGTTGA-3′ 反向 5′-GGTGAAGGAAAGGCCATGTA-3′ RAD52 正向 5′-CTGGCACTGTCCAAAGCATA-3′ 反向 5′-TAGATCGAGCTCCCTGTGTG-3′ NHEJ1 正向 5′-TGCAGATTCATGACAAAGGG-3′ 反向 5′-ACTACCAGGAGAGTGGGGCT-3′ XRCC3 正向 5′-CGTCTTCCGTGCAGATGTAG-3′ 反向 5′-CATCACTGAGCTGGCCG-3′ XRCC4 正向 5′-TTTCAGCTGAGATGTGCTCC-3′ 反向 5′-AGGAGACAGCGAATGCAAAG-3′ XRCC5 正向 5′-GAAGGCTCGGATGCAGTCTA-3′ 反向 5′-CCTGCTGAAAACTTCCGTGT-3′ XRCC6 正向 5′-TGGTTCATTTGTTTCCCGAT-3′ 反向 5′-AGACCAGGAAGCGAGCACT-3′ GAPDH 正向 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′ 反向 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′ 
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表 1 qRT-PCR相关引物序列
基因 方向 序列 53BP1 正向 5′-GCCTGATCAATGGACCCTACTGGAAGTCAGG-3′ 反向 5′-CCGCTCGAGTTAGTGAGAAACATAATCGTGT-3′ MDC1 正向 5′-TGCTCTTCACAGGAGTGGTG-3′ 反向 5′-GGGCACACAGGAACTTGACT-3′ BRCA1 正向 5′-CTGAAGACTGCTCAGGGCTATC-3′ 反向 5′-AGGGTAGCTGTTAGAAGGCTGG-3′ BARD1 正向 5′-AGCGTAGGGATGGACCTCTT-3′ 反向 5′-CCATTGAGAATCCCAAGCAT-3′ CHK1 正向 5′-ATATGAAGCGTGCCGTAGACT-3′ 反向 5′-TGCCTATGTCTGGCTCTATTCTG-3′ CHK2 正向 5′-AAGAAGTTGTTGGTAGTG-3′ 反向 5′-TTCCTCAGACAGAAGATC-3′ LIG4 正向 5′-TGCTGCTGAGTTGCATAATGT-3′ 反向 5′-AGCAGCTAGCATTGGTTTTGA-3′ RAD50 正向 5′-TCCACGATAGGTACTTCGCC-3′ 反向 5′-TGAGGACAACAGAACTTGTGAAC-3′ RAD51 正向 5′-GGTCTGGTGGTCTGTGTTGA-3′ 反向 5′-GGTGAAGGAAAGGCCATGTA-3′ RAD52 正向 5′-CTGGCACTGTCCAAAGCATA-3′ 反向 5′-TAGATCGAGCTCCCTGTGTG-3′ NHEJ1 正向 5′-TGCAGATTCATGACAAAGGG-3′ 反向 5′-ACTACCAGGAGAGTGGGGCT-3′ XRCC3 正向 5′-CGTCTTCCGTGCAGATGTAG-3′ 反向 5′-CATCACTGAGCTGGCCG-3′ XRCC4 正向 5′-TTTCAGCTGAGATGTGCTCC-3′ 反向 5′-AGGAGACAGCGAATGCAAAG-3′ XRCC5 正向 5′-GAAGGCTCGGATGCAGTCTA-3′ 反向 5′-CCTGCTGAAAACTTCCGTGT-3′ XRCC6 正向 5′-TGGTTCATTTGTTTCCCGAT-3′ 反向 5′-AGACCAGGAAGCGAGCACT-3′ GAPDH 正向 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′ 反向 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′
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