Associations of serum transforming growth factor-β1 and klotho expression levels with disease severity and cognitive function in patients with epilepsy
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摘要:目的
分析血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、Klotho表达水平与癫痫患者病情严重程度及认知功能的关系。
方法选取188例癫痫患者纳入癫痫组，选取同期体检的健康志愿者188例(未患癫痫)纳入对照组。依据癫痫发作情况将188例癫痫患者分为部分性发作组(n=84)和全身性发作组(n=104)。依据简易精神状态检查表(MMSE)评分将188例癫痫患者分为认知正常组(n=76)和认知障碍组(n=112)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中TGF-β1、Klotho水平。采用Spearman相关性分析法分析血清TGF-β1、Klotho水平与患者癫痫病情严重程度、认知功能的相关性。采用多因素Logistic回归分析法筛选癫痫患者认知功能的影响因素。
结果癫痫组血清TGF-β1、Klotho水平低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。全身性发作组的血清TGF-β1、Klotho水平低于部分性发作组，英国国立医院癫痫严重程度量表(NHS3)评分高于部分性发作组，差异有统计学意义(P < 0.05)。血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫病情严重程度呈负相关(P < 0.05))。认知障碍组的血清TGF-β1、Klotho水平低于认知正常组，差异有统计学意义(P < 0.05)。血清TGF-β1、Klotho水平与认知功能呈负相关(P < 0.05)。TGF-β1、Klotho是癫痫患者认知功能的影响因素(P < 0.05)。
结论癫痫患者血清TGF-β1、Klotho水平显著降低，二者与癫痫病情严重程度呈负相关，且与患者认知功能密切相关。
Abstract:ObjectiveTo investigate the associations of serum transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and klotho expression levels with the severity of epilepsy and cognitive function in patients with epilepsy.
MethodsA total of 188 patients with epilepsy were enrolled as epilepsy group, and 188 healthy volunteers (without epilepsy) who underwent physical examinations during the same period were recruited as control group. Based on seizure types, 188 patients with epilepsy were further divided into partial seizure group (n=84) and generalized seizure group (n=104). According to the Mini-Mental State Examination (MMSE) scores, the patients were also divided into cognition normal group (n=76) and cognition impairment group (n=112). Enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) was utilized to measure the serum levels of TGF-β1 and klotho. Spearman correlation analysis was conducted to explore the correlations of serum levels of TGF-β1 and klotho with the severity of epilepsy as well as cognitive function. Multivariate Logistic regression analysis was performed to identify the factors influencing cognitive function in patients with epilepsy.
ResultsThe serum levels of TGF-β1 and klotho in the epilepsy group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). The serum levels of TGF-β1 and klotho in the generalized seizure group were significantly lower than those in the partial seizure group, and the National Hospital Seizure Severity Scale (NHS3) score was significantly higher than that in the partial seizure group (P < 0.05). There were negative correlations of serum levels of TGF-β1 and klotho with the severity of epilepsy (P < 0.05). The levels of TGF-β1 and klotho in the cognition impairment group were significantly lower than those in the cognition normal group (P < 0.05). Negative correlations were observed between serum levels of TGF-β1 as well as klotho and cognitive function (P < 0.05). TGF-β1 and klotho were identified as significant factors influencing cognitive function in patients with epilepsy (P < 0.05).
ConclusionThe serum levels of TGF-β1 and klotho are significantly decreased in patients with epilepsy, and they are negatively correlated with the severity of epilepsy and closely associated with cognitive function.
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Keywords:
- epilepsy /
- cognitive function /
- transforming growth factor-β1 /
- klotho /
- correlation /
- influencing factors
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癫痫发作被认为是由大脑中异常、过度或同步神经元活动引起的突发性短暂体征和症状[1]。研究[2]统计，认知合并症在癫痫患者中普遍存在，约70%的癫痫患者存在认知功能下降。转化生长因子-β1(TGF-β1)是一种重要的信号转导蛋白，在细胞生长、分化和凋亡等生理过程中发挥多重作用[3]。研究[4]显示，上调TGF-β1可减少癫痫小鼠的神经元凋亡，改善其癫痫症状。Klotho是一种抗衰老基因，可通过增加血浆中多种血小板因子水平，进而改善患者认知功能[5]。此外, Klotho能够提高谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX-4)和谷胱甘肽(GSH)水平，改善颞叶癫痫小鼠认知缺陷，发挥神经保护作用[6]。探讨癫痫患者相关血清指标与认知功能的关系对及时预防和干预认知功能下降、改善癫痫患者预后具有积极意义。目前, TGF-β1、Klotho与癫痫患者病情及认知功能关系的研究较少。本研究分析血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫患者病情及认知功能的关系，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性选取2022年4月—2024年3月河南省南阳市中心医院收治的188例癫痫患者为癫痫组，采用倾向性得分匹配法匹配188例同期体检的健康志愿者(未患癫痫)为对照组。癫痫组患者年龄为59~83岁，平均(73.64±8.15)岁; 男性占比为53.19%(100/188), 女性占比为46.81%(88/188); 平均体质量指数(BMI)为(21.43±2.11) kg/m2; 吸烟76例，饮酒51例; 受教育程度为中学以下32例，中学69例，中学以上87例。对照组志愿者年龄为57~85岁，平均(72.96±8.42)岁; 男性占比为50.53%(95/188), 女性占比为49.47%(93/188); 平均BMI为(21.18±2.30) kg/m2; 吸烟74例，饮酒45例; 受教育程度为中学以下30例，中学64例，中学以上94例。2组年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、受教育程度等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。
癫痫组纳入标准: ①年龄≥18岁，符合癫痫诊断标准[7]且经脑电图检查确诊者; ②依从性较好，且1周内有癫痫发作者; ③病历资料完整者; ④患者及其家属知情同意。排除标准: ①难治性癫痫或伴有其他颅脑损伤、脑外伤等颅内病变者; ②临床癫痫发作不典型或仅有1次临床发作者; ③因低血糖、脑出血等引起的抽搐者; ④伴有先天性心脏病或肝肾功能不全者; ⑤伴有血液系统疾病或免疫系统疾病或恶性肿瘤者; ⑥严重精神疾病者。对照组纳入标准: ①无肝脏、脾、肾、骨骼等相关疾病者; ②无肿瘤或慢性病史者; ③白细胞、红细胞、血小板等实验室指标在正常范围内者; ④既往无癫痫史且脑电图无异常者。
本研究符合《赫尔辛基宣言》的医学伦理原则，并获得本院伦理委员会批准(批准文号: LL202204016)。
1.2 方法
1.2.1 血清TGF-β1、Klotho水平检测
分别于癫痫患者入院时、志愿者体检时各抽取3 mL空腹静脉血。在室温条件下，采用TD-5M台式低速离心机(由四川蜀科仪器有限公司提供)以4 000 r/min(半径16 cm)离心10 min, 取血清。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中TGF-β1、Klotho水平, YP-96酶联免疫分析仪由山东优云谱光电科技有限公司提供。TGF-β1-ELISA试剂盒(货号TL16537)由天津肽链生物科技有限公司提供, Klotho-ELISA试剂盒(货号YSH604722)由上海仪盛和生物技术有限公司提供。
1.2.2 癫痫严重程度以及认知功能评估
根据英国国立医院癫痫发作严重程度量表(NHS3)[8]对188例患者癫痫病情严重程度进行评估。量表总分27分，分数越高表示癫痫发作程度越严重。此外，根据简易精神状态检查表(MMSE)[9]对188例癫痫患者认知功能进行评估。MMSE评分包括定向力、记忆力、注意力和计算力以及语言能力和回忆能力共5个部分，总分30分, ≥27分为认知正常, 21~26分为轻度认知障碍, 10~20分为中度认知障碍, 0~9分为重度认知障碍。
1.2.3 癫痫患者分组
根据癫痫发作表现将188例癫痫患者分为部分性发作组84例和全身性发作组104例; 依据MMSE评分将188例癫痫患者分为认知正常组(≥27分)76例和认知障碍组(< 27分)112例。
1.3 观察指标
① 比较癫痫组与对照组血清TGF-β1、Klotho水平; ②比较不同发作表现癫痫患者的血清TGF-β1、Klotho水平及NHS3评分; ③分析血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫病情严重程度的相关性; ④比较不同认知功能患者一般资料及血清TGF-β1、Klotho水平; ⑤分析血清TGF-β1、Klotho水平与认知功能的关系。
1.4 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计量资料以(x±s)表示，行t检验; 计数资料以[n(%)]表示，行χ2检验。采用Spearman相关性分析法分析血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫病情严重程度及认知功能的相关性。采用多因素Logistic回归分析法筛选癫痫患者认知功能的影响因素。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 癫痫组与对照组血清TGF-β1、Klotho水平比较
癫痫组血清TGF-β1、Klotho水平低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 癫痫组与对照组血清TGF-β1、Klotho水平比较(x±s)pg/mL 组别 n TGF-β1 Klotho 癫痫组 188 191.84±57.43* 171.58±53.16* 对照组 188 371.05±95.69 269.37±70.79 TGF-β1: 转化生长因子-β1。与对照组比较, *P < 0.05。 2.2 不同发作表现癫痫患者的血清TGF-β1、Klotho水平及NHS3评分比较
全身性发作组患者的血清TGF-β1、Klotho水平低于部分性发作组, NHS3评分高于部分性发作组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 不同发作表现癫痫患者的血清TGF-β1、Klotho水平及NHS3评分比较(x±s)组别 n TGF-β1/(pg/mL) Klotho/(pg/mL) NHS3评分/分 部分性发作组 84 219.47±55.93 192.75±51.37 10.98±3.51 全身性发作组 104 150.62±42.16* 142.38±30.52* 15.03±4.17* 与部分性发作组比较, *P < 0.05。 2.3 血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫病情严重程度的相关性分析
血清TGF-β1、Klotho水平与患者癫痫病情严重程度均呈负相关(r=-0.380、-0.448, P < 0.05), 见图 1、图 2。
2.4 不同认知功能患者一般资料及血清TGF-β1、Klotho水平比较
认知障碍组的年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、受教育程度与认知正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05); 认知障碍组血清TGF-β1、Klotho水平低于认知正常组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 不同认知功能患者的一般资料以及血清TGF-β1、Klotho水平比较(x±s)[n(%)]指标 分类 认知正常组(n=76) 认知障碍组(n=112) 年龄/岁 71.84±10.26 74.86±12.07 性别 男 42(55.26) 58(51.79) 女 34(44.74) 54(48.21) 体质量指数/(kg/m2) 21.93±2.26 21.50±2.06 吸烟 30(39.47) 46(41.07) 饮酒 25(32.89) 26(23.21) 受教育程度 中学以下 14(18.42) 18(16.07) 中学 32(42.11) 37(33.04) 中学以上 30(39.47) 57(50.89) TGF-β1/(pg/mL) 206.83±56.97 166.96±53.15* Klotho/(pg/mL) 207.19±49.95 137.08±50.45* 与认知正常组比较, *P < 0.05。 2.5 血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫患者认知功能的关系
Spearman相关性分析结果显示，血清TGF-β1、Klotho水平与认知功能呈负相关(r=-0.447、-0.428, P < 0.05)。以认知功能为因变量(认知正常=0, 认知障碍=1), 以TGF-β1(原值输入)、Klotho(原值输入)为自变量行多因素Logistic回归分析，在校正了相关混杂因素(年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、受教育程度)后发现, TGF-β1、Klotho是癫痫患者认知功能的影响因素(P < 0.05), 见表 4。
表 4 血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫患者认知功能的关系因素 B SE Wald χ2 OR 95%CI P TGF-β1 -1.474 0.461 10.224 0.229 0.093~0.565 0.001 Klotho -1.149 0.408 7.929 0.317 0.142~0.705 0.005 3. 讨论
癫痫发作特征为慢性、无明显诱因且易反复，多见于儿童时期和老年期[10]。目前，癫痫的发病机制尚未完全明确，普遍认为其与大脑皮质发育障碍、颅脑外伤、睡眠、年龄等因素相关[11]。研究[12]证实，癫痫与认知障碍密切相关，癫痫患者常伴有不同程度的认知功能损伤。因此，寻找恰当的生物学标志物以反映癫痫病情及认知功能，对癫痫患者的诊断、治疗及预后至关重要。
TGF-β1信号通过调节神经传递、突触重塑和脑连接，在脑发育和再生过程中发挥重要作用[13]。研究[14]表明, TGF-β1可能参与癫痫的发生及认知功能障碍的病理过程。研究[15]发现，局部TGF-β1过表达可改善成年脂多糖诱导小鼠的海马功能、突触可塑性和记忆能力，与上述研究趋势一致。本研究发现，癫痫组患者血清TGF-β1水平显著低于对照组，且与癫痫病情严重程度呈负相关。全身性发作组患者血清TGF-β1水平和NHS3评分显著低于部分性发作组，提示TGF-β1可能与癫痫的发生及类型相关，且与癫痫的病情严重程度密切相关，尤其在全身性发作患者中表现更为显著。本研究结果显示，认知障碍组血清TGF-β1水平显著降低，血清TGF-β1水平与认知功能呈负相关，且TGF-β1是癫痫患者认知功能的影响因素，提示血清TGF-β1水平降低可能增加癫痫患者认知障碍的发生风险。分析其作用机制: TGF-β1通过促进大脑磷酸化Smad家族成员2(p-Smad2)和Smad家族成员3(Smad3)共定位，同时增强M2型小胶质细胞极化，减弱M1型小胶质细胞活性，进而改善癫痫患者认知功能[16]。
Klotho除了与衰老相关外，还对大脑中的神经性疾病具有保护作用[17-18]。研究[19]发现, Klotho可减轻海马组织炎症和氧化应激，改善衰老，同时还能够增强M2型小胶质细胞的极化，减轻神经炎症。本研究中，癫痫患者血清Klotho水平显著下降，且全身性发作癫痫患者更低，提示Klotho可能参与癫痫发作，并与癫痫发作类型相关。本研究进一步分析发现，血清Klotho水平与患者癫痫病情严重程度、认知功能呈负相关，提示Klotho可能参与癫痫的病程进展，并与认知障碍的发生相关。Klotho是癫痫患者认知功能的影响因素，提示Klotho水平升高可能降低癫痫患者认知障碍的发生风险。分析Klotho在认知功能中的作用可能是: Klotho通过降低海马区Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶1(CASPAS1)蛋白的表达，激活核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)表达，减轻由癫痫引起的神经炎症、海马神经元损伤，进而改善患者认知功能[20]。但本研究存在一定的不足：本研究纳入的样本量较少，结果可能存在偏倚，且为单中心研究，未针对患者不同时点的血清TGF-β1、Klotho水平展开动态监测，因此研究结果可能不够全面，后续将扩大样本量并结合多中心研究，分析血清TGF-β1、Klotho水平在癫痫患者中的动态变化，进一步深入探讨二者参与癫痫发生与发展的具体机制。
综上所述，TGF-β1、Klotho在癫痫患者血清中呈异常低表达，二者与癫痫病情严重程度及患者认知功能相关。TGF-β1、Klotho是癫痫患者认知功能的影响因素。
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表 1 癫痫组与对照组血清TGF-β1、Klotho水平比较(x±s)
pg/mL 组别 n TGF-β1 Klotho 癫痫组 188 191.84±57.43* 171.58±53.16* 对照组 188 371.05±95.69 269.37±70.79 TGF-β1: 转化生长因子-β1。与对照组比较, *P < 0.05。 
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表 2 不同发作表现癫痫患者的血清TGF-β1、Klotho水平及NHS3评分比较(x±s)
组别 n TGF-β1/(pg/mL) Klotho/(pg/mL) NHS3评分/分 部分性发作组 84 219.47±55.93 192.75±51.37 10.98±3.51 全身性发作组 104 150.62±42.16* 142.38±30.52* 15.03±4.17* 与部分性发作组比较, *P < 0.05。
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表 3 不同认知功能患者的一般资料以及血清TGF-β1、Klotho水平比较(x±s)[n(%)]
指标 分类 认知正常组(n=76) 认知障碍组(n=112) 年龄/岁 71.84±10.26 74.86±12.07 性别 男 42(55.26) 58(51.79) 女 34(44.74) 54(48.21) 体质量指数/(kg/m2) 21.93±2.26 21.50±2.06 吸烟 30(39.47) 46(41.07) 饮酒 25(32.89) 26(23.21) 受教育程度 中学以下 14(18.42) 18(16.07) 中学 32(42.11) 37(33.04) 中学以上 30(39.47) 57(50.89) TGF-β1/(pg/mL) 206.83±56.97 166.96±53.15* Klotho/(pg/mL) 207.19±49.95 137.08±50.45* 与认知正常组比较, *P < 0.05。
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表 4 血清TGF-β1、Klotho水平与癫痫患者认知功能的关系
因素 B SE Wald χ2 OR 95%CI P TGF-β1 -1.474 0.461 10.224 0.229 0.093~0.565 0.001 Klotho -1.149 0.408 7.929 0.317 0.142~0.705 0.005
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