MicroRNA-34a regulates the CaMKⅡ/CREB pathway to improve isoflurane anesthesia-induced cognitive dysfunction in aged rats
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摘要:目的
探讨微小RNA(miR)-34a对异氟烷麻醉引起的老年大鼠认知功能障碍的影响及其作用机制。
方法将40只20月龄大鼠随机分为正常(Con)组、模型(Model)组、miR-34a抑制剂(miR-34a inhibitor)组和miR-34a激动剂(miR-34a mimics)组，每组10只。miR-34a inhibitor组和miR-34a mimics组大鼠尾静脉注射100 nmol/kg对应药物, Con组和Model组大鼠尾静脉注射等剂量生理盐水, 1次/d, 连续5 d。第6天，除正常组外，其余组大鼠均进行单次异氟烷麻醉6 h, 构建术后认知功能障碍(POCD)模型。建模完成后12 h, 采用Morris水迷宫实验观察大鼠逃避潜伏期和目标象限停留时间。采用免疫荧光染色观察大鼠海马组织中离子钙结合衔接分子1(Iba-1)阳性表达率。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测大鼠海马组织中miR-34a以及B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达量。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、活性氧(ROS)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平以及海马组织中谷氨酸(Glu)、Ca2+和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B(NMDAR2B)含量。采用蛋白质印迹(Western blotting)检测大鼠海马组织中钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、pCaMKⅡ、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、磷酸化CREB(pCREB)蛋白相对表达量。
结果与Con组比较, Model组大鼠逃避潜伏期、血清中IL-6、IL-1β、ROS水平以及海马组织中Iba-1阳性表达率、miR-34a、Bax mRNA相对表达水平和Glu、Ca2+、NMDAR2B含量延长或升高, 目标象限停留时间、血清中GSH-Px水平、海马组织中Bcl-2 mRNA相对表达水平、Bcl-2/Bax以及pCaMKⅡ/CaMKⅡ和PCREB/CREB缩短或降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。下调miR-34a表达可缩短模型大鼠逃避潜伏期，以及降低血清中IL-6、IL-1β、ROS水平和海马组织中Iba-1阳性表达率、miR-34a、Bax mRNA相对表达水平和Glu、Ca2+、NMDAR2B含量(P < 0.05), 还可延长目标象限停留时间，以及血清中GSH-Px水平、海马组织中Bcl-2 mRNA相对表达水平、Bcl-2/Bax以及pCaMKⅡ/CaMKⅡ和PCREB/CREB(P < 0.05)。上调miR-34a表达可通过促进小胶质细胞的异常激活以及炎症、氧化应激和凋亡，抑制CaMKⅡ/CREB信号通路活化，加重模型大鼠认知障碍。
结论miR-34a在POCD老年大鼠中高表达，抑制miR-34a表达可通过激活CaMKⅡ/CREB信号通路改善老年大鼠因异氟烷麻醉引起的认知功能障碍。
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关键词:
- 微小RNA-34a /
- 异氟烷 /
- 认知功能障碍 /
- 炎症 /
- 钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ /
- 环磷腺苷效应元件结合蛋白
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects and underlying mechanisms of microRNA (miR)-34a on isoflurane anesthesia-induced cognitive dysfunction in aged rats.
MethodsForty rats at 20 months of age were randomly divided into control (Con) group, model group, miR-34a inhibitor group and miR-34a mimics group, with 10 rats in each group. Rats in the miR-34a inhibitor and miR-34a mimics groups received a tail vein injection of 100 nmoL/kg of the corresponding drug, while those in the Con and model groups received an equal volume of saline, once daily for 5 consecutive days. At the 6th day, all groups except the Con group underwent a single 6-hour isoflurane anesthesia to establish a postoperative cognitive dysfunction (POCD) model. Twelve hours after modeling, the Morris water maze test was used to assess the escape latency and time spent in the target quadrant. Immunofluorescence staining was performed to observe the positive expression rate of ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1) in the hippocampal tissue. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to measure the relative expression levels of miR-34a, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and Bcl-2-associated X-protein (Bax) mRNA in the hippocampal tissue. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted to detect serum levels of interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β), reactive oxygen species (ROS) and glutathione peroxidase (GSH-Px), as well as the content of glutamate (Glu), Ca2+ and N-methyl-D-aspartate receptor 2B (NMDAR2B) in the hippocampal tissue. Western blotting was used to determine the relative expression levels of calcium-calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ (CaMKⅡ), phosphorylated CaMKⅡ (pCaMKⅡ), cyclophosphoadenosine effector-binding protein (CREB), and phosphorylated CREB (pCREB) in the hippocampal tissue.
ResultsCompared with the Con group, the Model group exhibited significantly prolonged escape latency, elevated serum levels of IL-6 and IL-1β and ROS, as well as increased positive expression rate of Iba-1, relative expression levels of miR-34a and Bax mRNA, contents of Glu, Ca2+ and NMDAR2B in the hippocampal tissue; in contrast, the time spent in the target quadrant, serum GSH-Px levels, Bcl-2 mRNA relative expression levels, Bcl-2/Bax, as well as pCaMKⅡ/CaMKⅡ and pCREB/CREB in the hippocampal tissue were significantly reduced (P < 0.05). Downregulation of miR-34a expression shortened the escape latency and decreased serum levels of IL-6, IL-1β and ROS, as well as Iba-1 positive expression rate, relative expression levels of miR-34a and Bax mRNA, Glu, Ca2+ and NMDAR2B content in the hippocampal tissue (P < 0.05). It also extended the time spent in the target quadrant and increased serum GSH-Px levels, Bcl-2 mRNA expression levels, Bcl-2/Bax, as well as pCaMKⅡ/CaMKⅡ and pCREB/CREB in the hippocampal tissue (P < 0.05). Upregulation of miR-34a expression promoted abnormal activation of microglia, inflammation, oxidative stress and apoptosis, inhibited the activation of the CaMKⅡ/CREB signaling pathway, and exacerbated cognitive dysfunction in the model rats.
ConclusionMiR-34a is highly expressed in POCD in aged rats. Inhibition of miR-34a expression can improve isoflurane anesthesia-induced cognitive dysfunction in aged rats by activating the CaMKⅡ/CREB signaling pathway.
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术后认知功能障碍(POCD)是一种神经系统并发症，常见于老年人，其主要特征为麻醉/手术后出现认知功能障碍，例如出现记忆、执行、语言、方向、情绪、视觉空间结构等能力异常[1]。研究[2]发现，在接受非心脏手术麻醉的患者中，约12%的患者会出现POCD。POCD具有自限性，但仍可能延长患者的住院时间，增加术后恢复期及围术期死亡率等风险。寻求实现术中循环稳定，加速术后复苏与康复，以及改善POCD的药物或麻醉技术尤为重要。研究[3]显示，经异氟烷麻醉的老年鼠易产生认知功能障碍，其机制可能与海马区域小胶质细胞激活和炎性因子浸润有关。钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)信号通路在调节机体学习记忆能力中具有重要作用。激活CaMKⅡ/CREB信号通路，可通过减少细胞凋亡，抑制炎症反应及氧化应激，进而改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍和神经元损伤[4]。微小RNA(miR)-34a是一种肿瘤抑制性miRNA, 其可抑制结肠癌、前列腺癌和胰腺癌等多种癌症的发展[5]。研究[6]表明, miR-34a在阿尔兹海默症小鼠中过度表达，过度表达的miR-34a可导致小鼠认知能力下降，但其在POCD中的作用有待阐明。本研究探讨miR-34a调控CaMKⅡ/CREB信号通路对大鼠POCD的影响及其潜在作用机制，以期为围术期麻醉策略在POCD预防与治疗中的应用提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
20月龄(相当于老年期)SPF级SD大鼠40只，雄性[7], 体质量500~600 g, 购自湖北贝恩特生物科技有限公司，生产许可证号: SCXK(鄂)2021-0027。动物饲养于温度为20~24 ℃、湿度50%~60%、12 h明暗交替，并提供正常饮食和饮水的实验室环境中。本研究已通过医院伦理委员会审批(院科伦审: 202300063)。
1.2 主要试剂及仪器
异氟烷购自深圳瑞沃德生命科技有限公司; miR-34a inhibitor及miR-34a mimics购自广州锐博生物科技有限公司; 大鼠白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、活性氧(ROS)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司; 谷氨酸(Glu)、Ca2+和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B(NMDAR2B)的ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司; miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司; PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)、TB Green® Fast qPCR Mix购自日本TAKARA公司; 离子钙结合衔接分子1(Iba-1)抗体、CaMKⅡ抗体、pCaMKⅡ抗体、CREB抗体、pCREB抗体和GAPDH抗体购自英国Abcam公司; R550多通道小动物麻醉机购自深圳瑞沃德生命科技有限公司; RD1101-MWM-G Morris大小鼠水迷宫分析系统购自上海玉研科学仪器有限公司; RT1000湿式血气分析仪购自武汉明德生物科技股份有限公司; ABI7500实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪购自美国Thermo Fisher公司; Infinite F50酶标仪购自瑞士Tecan公司; JP-2880全自动凝胶成像分析系统购自上海金鹏分析仪器有限公司; ECLIPSE C1正置荧光显微镜购自日本尼康公司。
1.3 分组及大鼠POCD模型建立
将40只大鼠随机分为正常(Con)组、模型(Model)组、miR-34a抑制剂(miR-34a inhibitor)组和miR-34a激动剂(miR-34a mimics)组，每组10只。第1~5天, miR-34a inhibitor组和miR-34a mimics组大鼠尾静脉注射100 nmoL/kg miR-34a inhibitor和miR-34a mimics, Con组和Model组大鼠尾静脉注射等剂量生理盐水, 1次/d, 连续5 d。第6天，除正常组外，其余组大鼠均进行单次异氟烷麻醉6 h, 构建POCD模型[7]。建模过程: 将异氟烷加入小动物呼吸麻醉机中，打开呼吸泵，以氧气作为载气，调整气体流量为2 L/min, 大鼠放入麻醉诱导箱中，持续吸入1.4%(体积分数)异氟烷6 h, 期间使用监测仪检测异氟烷含量。建模完毕后，关闭呼吸泵和异氟烷挥发罐。
1.4 Morris水迷宫实验
各组大鼠建模前，进行连续5 d实验训练, 4次/d。训练时，将大鼠面向池壁从4个入水点分别放入水池，记录大鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为逃避潜伏期，用秒(s)表示，大鼠找到平台后，让其在平台上站立10 s。若入水后60 s, 大鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留10 s, 然后进行下一次训练。每只大鼠从4个入水点分别放入水池为一次训练, 2次训练间隔30 s。建模完成后12 h, 撤去平台，从同一入水点将大鼠放入水中，记录逃避潜伏期和目标象限停留时间。
1.5 免疫荧光染色
Morris水迷宫实验检测结束后，各组大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠，腹主动脉采血收集血液和血清，血液用血气分析仪进行血气分析，并检测血糖，而血清冻存备用。收集大鼠双侧海马组织冻存备用。将左侧冻存的海马组织制成冰冻切片(厚度5 μm), 并置于37 ℃烘箱烘烤10 min, 控干水分。切片放入固定液固定30 min, 进行抗原修复。切片用组化笔在组织周围画圈，滴加10%(体积分数)驴血清封闭30 min。滴加一抗Iba-1抗体(1∶ 500), 切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。将切片与荧光标记的二抗避光室温孵育50 min。复染细胞核，加DAPI染液，避光室温孵育10 min。淬灭组织自发荧光，封片。在荧光显微镜下于494~520 nm(FITC, 绿色)和360~460 nm(DAPI, 蓝色)激发波长采集海马组织CA1区图片。随机选取3个视野，使用Image J软件计算Iba-1阳性表达率(%)=Iba-1阳性细胞面积/视野细胞面积×100%。
1.6 qRT-PCR检测
检测右侧海马组织中miR-34a的表达: 取10 μL合成的cDNA进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃ 5 min, 预变性; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 循环40次; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s, 融解曲线。检测右侧海马组织中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达: 以合成的cDNA为模板进行PCR, 在50 ℃ 2 min, 循环1次; 95 ℃ 10 min, 循环1次, 95 ℃ 15 s, 循环40次; 60 ℃ 1 min, 循环1次。miR-34a引物序列5′-TGCGCTGGCAGTGTCTTAGCTG-3′; Bcl-2 引物F: 5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCA-3′, R: 5′-CAGCCAGGAGAAAT CAAACA-3′; Bax引物F: 5′-GGTTGTCGCCCTTTTCTACTT-3′, R: 5′-GGAGGAAGTCCAATGTCCAG-3′; U6 引物序列5′-CAAGGATGACACGCAAATTCG-3′; β-actin引物F: 5′-AAGATCAAGATCCATTGCT-3′, R: 5′-TAACFCAACTAAGTCATA-3′。miR-34a以 U6 为内参, Bcl-2 和Bax以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算miR-34a及 Bcl-2 、Bax的mRNA相对表达水平。
1.7 ELISA检测
按照试剂盒说明书于450 nm处检测各组血清中的炎性因子(IL-6、IL-1β)、氧化应激指标(ROS、GSH-Px)水平以及海马组织中Glu、Ca2+和NMDAR2B含量。
1.8 蛋白质印迹(Western blotting)检测
将各组右侧海马组织进行蛋白提取并定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转聚偏二氟乙烯膜，进行5%(质量分数)脱脂奶粉封闭1 h, 加入一抗CaMKⅡ抗体、pCaMKⅡ抗体、CREB抗体、pCREB抗体和GAPDH抗体(均1∶1 000), 于4 ℃孵育过夜。加入以辣根酶标记的二抗(1∶10 000)室温振荡孵育1 h, 使用混合发光液曝光显色，放入凝胶成像仪成像，采用Image J软件计算蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值。
1.9 统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料以(x±s)表示; 多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 miR-34a对POCD老年大鼠血气分析及血糖的影响
4组大鼠的pH值、动脉血脉分压[pa(O2)]、动脉血二氧化碳分压[pa(CO2)]和血糖结果比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1。
表 1 各组大鼠血气分析指标及血糖比较(x±s)(n=10)组别 pH值 pa(O2)/mmHg pa(CO2)/mmHg 血糖/(mmol/L) Con组 7.38±0.05 119.30±8.99 39.33±4.01 5.12±0.53 Model组 7.42±0.08 118.45±11.04 41.77±6.28 4.89±0.60 miR-34a inhibitor组 7.40±0.07 120.68±8.32 39.90±4.57 5.00±0.45 miR-34a组mimics 7.41±0.08 117.97±10.11 40.80±5.63 4.97±0.58 pa(O2): 动脉血氧分压; pa(CO2): 动脉血二氧化碳分压。 2.2 miR-34a对POCD老年大鼠学习记忆能力的影响
与Con组比较, Model组大鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间缩短，差异有统计学意义(P＜0.05); 与Model组比较, miR-34a inhibitor组大鼠逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间延长，而miR-34a mimics组大鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间缩短，差异有统计学意义(P＜0.05); 与miR-34a inhibitor组比较, miR-34a mimics组大鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间缩短，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2。
表 2 各组大鼠Morris水迷宫实验结果(x±s)(n=10)s 组别 逃避潜伏期 目标象限停留时间 Con组 22.70±3.12 46.31±8.10 Model组 39.45±4.19* 28.57±5.34* miR-34a inhibitor组 30.02±2.96# 41.16±7.20# miR-34a mimics组 45.24±4.60#△ 23.87±4.51#△ 与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05;
与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。2.3 miR-34a对POCD老年大鼠海马组织小胶质细胞激活程度的影响
与Con组比较, Model组大鼠海马组织中Iba-1阳性表达率增加，差异有统计学意义(P＜0.05), 提示POCD老年大鼠海马组织小胶质细胞异常激活; 与Model组比较, miR-34a inhibitor组大鼠海马组织中Iba-1阳性表达率降低，而miR-34a mimics组大鼠海马组织中Iba-1阳性表达率增加，差异有统计学意义(P＜0.05); 与miR-34a inhibitor组比较, miR-34a mimics组大鼠海马组织中Iba-1阳性表达率增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 1。
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图 1 各组大鼠海马CA1区Iba-1阳性表达情况(免疫荧光，放大200倍)绿色为Iba-1阳性表达。与Con组比较, *P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。2.4 miR-34a对POCD老年大鼠海马组织中细胞凋亡的影响
与Con组比较, Model组大鼠海马组织中miR-34a和Bax的mRNA相对表达水平升高, Bcl-2 mRNA相对表达水平和Bcl-2/Bax比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05); 与Model组比较, mR-34a inhibitor组大鼠miR-34a和Bax的mRNA相对表达水平降低, Bcl-2 mRNA相对表达水平和Bcl-2/Bax比值升高，而miR-34a mimics组大鼠海马组织中miR-34a和Bax的mRNA相对表达水平升高, Bcl-2 mRNA相对表达水平和Bcl-2/Bax比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05); 与miR-34a inhibitor组比较, miR-34a mimics组大鼠海马组织中miR-34a和Bax的mRNA相对表达水平升高, Bcl-2 mRNA相对表达水平和Bcl-2/Bax比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 3。
表 3 各组大鼠海马组织中miR-34a及Bcl-2和Bax mRNA的相对表达水平比较(x±s)(n=10)组别 miR-34a Bcl-2 mRNA Bax mRNA Bcl-2/Bax Con组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.01 1.00±0.02 Model组 1.87±0.10* 0.40±0.03* 1.73±0.12* 0.23±0.09* miR-34a inhibitor组 0.26±0.04# 0.87±0.15# 1.24±0.11# 0.70±0.11# miR-34a mimics组 7.35±0.51#△ 0.31±0.05#△ 2.34±0.20#△ 0.13±0.10#△ 与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。 2.5 miR-34a对POCD老年大鼠炎症和氧化应激反应的影响
与Con组比较, Model组大鼠血清中IL-6、IL-1β、ROS水平升高, GSH-Px水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05); 与Model组比较, miR-34a inhibitor组大鼠血清中IL-6、IL-1β、ROS水平降低, GSH-Px水平升高，而miR-34a mimics组大鼠血清中IL-6、IL-1β、ROS水平升高, GSH-Px水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05); 与miR-34a inhibitor组比较, miR-34a mimics组大鼠血清中IL-6、IL-1β、ROS水平升高，GSH-Px水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 4。
表 4 各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、ROS、GSH-Px水平比较(x±s)(n=10)组别 IL-6/(ng/L) IL-1β/(ng/L) ROS/(ng/L) GSH-Px/(U/mL) Con组 9.20±0.62 3.38±0.24 44.68±3.35 76.59±11.21 Model组 14.93±1.05* 7.25±0.36* 81.52±5.17* 39.96±5.73* miR-34a inhibitor组 10.80±0.78# 4.81±0.35# 54.43±4.22# 62.87±8.08# miR-34a mimics组 19.97±1.33#△ 9.11±0.44#△ 96.64±5.60#△ 30.05±4.32#△ IL-6: 白细胞介素-6; IL-1β: 白细胞介素-1β; ROS: 活性氧; GSH-Px: 谷胱甘肽过氧化物酶。
与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。2.6 miR-34a对POCD老年大鼠CaMKⅡ/CREB信号通路的影响
与Con组比较, Model组大鼠海马组织中Glu、Ca2+、NMDAR2B含量升高, pCaMKⅡ/CaMKⅡ和PCREB/CREB降低，差异有统计学意义(P＜0.05); 与Model组比较, miR-34a inhibitor组大鼠海马组织中Glu、Ca2+、NMDAR2B含量降低, pCaMKⅡ/CaMKⅡ和PCREB/CREB升高，而miR-34a mimics组大鼠海马组织中Glu、Ca2+、NMDAR2B含量升高, pCaMKⅡ/CaMKⅡ和PCREB/CREB降低，差异有统计学意义(P＜0.05); 与miR-34a inhibitor组比较, miR-34a mimics组大鼠海马组织中Glu、Ca2+、NMDAR2B含量升高, pCaMKⅡ/CaMKⅡ和PCREB/CREB降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 5、图 2。
表 5 各组大鼠海马组织中Glu、Ca2+和NMDAR2B含量以及CaMKⅡ/CREB信号通路相关蛋白表达量比较(x±s)(n=10)组别 Glu/(μg/g pro) Ca2+/(μmoL/g pro) NMDAR2B/(ng/g pro) pCaMKⅡ/CaMKⅡ PCREB/CREB Con组 483.94±14.62 50.06±9.88 14.62±6.49 0.93±0.07 0.89±0.08 Model组 630.91±21.04* 81.43±16.91* 27.97±9.23* 0.41±0.03* 0.43±0.04* miR-34a inhibitor组 527.85±17.27# 62.34±12.06# 19.78±7.14# 0.80±0.06# 0.77±0.06# miR-34a mimics组 750.18±26.56#△ 149.99±18.67#△ 39.90±10.06#△ 0.19±0.02#△ 0.22±0.04#△ Glu: 谷氨酸; NMDAR2B: N-甲基-D-天冬氨酸受体2B; CaMKⅡ: 钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ;
CREB: 环磷腺苷效应元件结合蛋白。与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。3. 讨论
POCD是一种主要表现为认知功能损害的术后并发症，常见于心脏大血管手术患者及老年人群。POCD可导致患者的近期记忆、注意力、语言理解和社交功能受损，降低生活质量，并增加住院和院外护理的成本。研究[8]报道, 41.4%的60岁以上患者进行非心脏手术后出现认知功能障碍。因此，避免和治疗认知功能障碍是围手术期医生在处理老年手术人群时面临的挑战之一。
异氟醚是一种常用的吸入麻醉剂，已被证实可在啮齿动物模型中引起认知障碍，并且与人类POCD的发生相关，其可模拟POCD。既往研究[9]表明，异氟醚暴露与神经炎症、细胞凋亡及线粒体功能障碍相关，但其诱导认知功能下降的具体机制仍不完全清楚。研究[10-12]表明神经炎症起着关键作用，可能影响许多神经病理学机制，包括血脑屏障完整性受损、线粒体功能障碍、氧化应激和神经元凋亡。神经炎症很可能是大脑主要免疫细胞-小胶质细胞活化产生的结果[13]。在衰老的大脑中，小胶质细胞对刺激的响应表现为产生更高水平的促炎细胞因子，例如IL-1β和IL-6, 并且这种反应持续的时间比年轻大脑中的小胶质细胞更长[13]。OKELLO A等[14]研究发现，患有轻度认知障碍的老年患者小胶质细胞活化高于未患有轻度认知障碍的老年患者。ALAM J J等[15]研究报道，老年大鼠和小鼠在伴有小胶质细胞激活及海马区IL-1β表达增加的情况下，均表现出显著的记忆与学习功能障碍。本研究结果显示，经异氟烷干预后的老年大鼠，逃避潜伏期延长，目标象限停留时间缩短，提示大鼠认知能力下降; 海马组织中Iba-1阳性表达率显著升高，提示大鼠海马组织小胶质细胞异常激活; 海马组织中Bax mRNA相对表达水平以及血清中IL-6、IL-1β、ROS水平升高，海马组织中 Bcl-2 mRNA相对表达水平和Bcl-2/Bax以及血清中GSH-Px水平降低，提示大鼠出现炎症、氧化应激和细胞凋亡。本研究结果与上述研究报道结果一致，提示成功构建POCD老年大鼠模型。进一步研究发现, POCD老年大鼠海马组织中miR-34a高表达。
miR-34是一个进化保守的家族，在脊椎动物基因组中包含miR-34a、miR-34b和miR-34c共3个成员，而在无脊椎动物物种中则存在单个直系同源物[16]。miR-34a最初被认为是神经母细胞瘤中的潜在肿瘤抑制因子，在大脑中表达最高[17]。miR-34a能调节小鼠神经干细胞的分化以及大鼠海马神经元中突触可塑性相关基因的表达[17]。近期研究[18-19]发现, miR-34a在阿尔兹海默症小鼠海马组织中异常表达，主要调节皮层淀粉样蛋白，可引起记忆缺失; miR-34a在糖尿病小鼠中高表达，而沉默miR-34a可通过减少糖尿病小鼠海马细胞的凋亡来改善记忆障碍。本研究结果显示，下调miR-34a表达可通过抑制小胶质细胞异常激活以及降低炎症、氧化应激和凋亡，从而改善POCD老年大鼠认知障碍，其作用机制可能为激活CaMKⅡ/CREB信号通路。
CaMKⅡ/CREB通路在学习和记忆中起着至关重要的作用。当大脑的认知功能出现异常时，海马神经元中Glu升高, NMDAR2B过度激活, Ca2+细胞膜通透性增加，大量Ca2+流入导致细胞钙超负荷[20]。CaMKⅡ是调节突触可塑性和海马依赖性学习与记忆的关键分子，参与神经递质的合成、释放及信号转导过程[21-22]。Ca2+与CaMKⅡ结合并激活p-CREB, p-CREB通过调控与学习、记忆及神经保护相关的基因转录和翻译，调节学习和记忆能力，从而参与突触可塑性、长时程增强和大脑保护等过程[22]。研究[23]报道，患有CaMKⅡ缺陷的小鼠可能表现出海马依赖性空间学习和记忆的损伤。本研究结果显示, POCD老年大鼠海马组织中Glu、Ca2+、NMDAR2B含量升高, pCaMKⅡ/CaMKⅡ和PCREB/CREB降低，与上述研究结果一致。下调miR-34a表达后, POCD老年大鼠海马组织中Glu降低，NMDAR2B活化被抑制，导致海马组织中Ca2+含量减少, pCaMKⅡ和p-CREB被激活; 而上调miR-34a表达可再次抑制CaMKⅡ/CREB信号通路活化，进而加重认知障碍。
综上所述, miR-34a在POCD老年大鼠中高表达，抑制miR-34a表达可通过激活CaMKⅡ/CREB信号通路来改善老年大鼠由异氟烷引起的认知功能障碍。
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图 1 各组大鼠海马CA1区Iba-1阳性表达情况(免疫荧光，放大200倍)
绿色为Iba-1阳性表达。与Con组比较, *P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。
表 1 各组大鼠血气分析指标及血糖比较(x±s)(n=10)
组别 pH值 pa(O2)/mmHg pa(CO2)/mmHg 血糖/(mmol/L) Con组 7.38±0.05 119.30±8.99 39.33±4.01 5.12±0.53 Model组 7.42±0.08 118.45±11.04 41.77±6.28 4.89±0.60 miR-34a inhibitor组 7.40±0.07 120.68±8.32 39.90±4.57 5.00±0.45 miR-34a组mimics 7.41±0.08 117.97±10.11 40.80±5.63 4.97±0.58 pa(O2): 动脉血氧分压; pa(CO2): 动脉血二氧化碳分压。 
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表 2 各组大鼠Morris水迷宫实验结果(x±s)(n=10)
s 组别 逃避潜伏期 目标象限停留时间 Con组 22.70±3.12 46.31±8.10 Model组 39.45±4.19* 28.57±5.34* miR-34a inhibitor组 30.02±2.96# 41.16±7.20# miR-34a mimics组 45.24±4.60#△ 23.87±4.51#△ 与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05;
与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。
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表 3 各组大鼠海马组织中miR-34a及Bcl-2和Bax mRNA的相对表达水平比较(x±s)(n=10)
组别 miR-34a Bcl-2 mRNA Bax mRNA Bcl-2/Bax Con组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.01 1.00±0.02 Model组 1.87±0.10* 0.40±0.03* 1.73±0.12* 0.23±0.09* miR-34a inhibitor组 0.26±0.04# 0.87±0.15# 1.24±0.11# 0.70±0.11# miR-34a mimics组 7.35±0.51#△ 0.31±0.05#△ 2.34±0.20#△ 0.13±0.10#△ 与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。
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表 4 各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、ROS、GSH-Px水平比较(x±s)(n=10)
组别 IL-6/(ng/L) IL-1β/(ng/L) ROS/(ng/L) GSH-Px/(U/mL) Con组 9.20±0.62 3.38±0.24 44.68±3.35 76.59±11.21 Model组 14.93±1.05* 7.25±0.36* 81.52±5.17* 39.96±5.73* miR-34a inhibitor组 10.80±0.78# 4.81±0.35# 54.43±4.22# 62.87±8.08# miR-34a mimics组 19.97±1.33#△ 9.11±0.44#△ 96.64±5.60#△ 30.05±4.32#△ IL-6: 白细胞介素-6; IL-1β: 白细胞介素-1β; ROS: 活性氧; GSH-Px: 谷胱甘肽过氧化物酶。
与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。
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表 5 各组大鼠海马组织中Glu、Ca2+和NMDAR2B含量以及CaMKⅡ/CREB信号通路相关蛋白表达量比较(x±s)(n=10)
组别 Glu/(μg/g pro) Ca2+/(μmoL/g pro) NMDAR2B/(ng/g pro) pCaMKⅡ/CaMKⅡ PCREB/CREB Con组 483.94±14.62 50.06±9.88 14.62±6.49 0.93±0.07 0.89±0.08 Model组 630.91±21.04* 81.43±16.91* 27.97±9.23* 0.41±0.03* 0.43±0.04* miR-34a inhibitor组 527.85±17.27# 62.34±12.06# 19.78±7.14# 0.80±0.06# 0.77±0.06# miR-34a mimics组 750.18±26.56#△ 149.99±18.67#△ 39.90±10.06#△ 0.19±0.02#△ 0.22±0.04#△ Glu: 谷氨酸; NMDAR2B: N-甲基-D-天冬氨酸受体2B; CaMKⅡ: 钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ;
CREB: 环磷腺苷效应元件结合蛋白。与Con组比较, * P＜0.05; 与Model组比较, #P＜0.05; 与miR-34a inhibitor组比较, △P＜0.05。
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