Relationships of circulating tumor cells with prognosis and tumor status of triple-negative breast cancer
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摘要:目的
分析循环肿瘤细胞(CTC)与三阴性乳腺癌(TNBC)预后及肿瘤状态的关系。
方法从32例Ⅲ~Ⅳ期TNBC患者和30名健康对照者的外周血中分离出CTC, 进行分子特征分析。
结果与3.2 mL血样中CTC计数 < 5个的23例患者相比, CTC计数≥5个的8例患者无进展生存期、总生存期均更差, 差异有统计学意义(P=0.033、0.006), 表明CTC计数对TNBC患者预后具有评估价值; 3.2 mL血样中CTC计数≥5个的患者中, CTC簇的存在与患者较差的总生存期有关(P=0.001)。CTC的上皮、间充质和干性标志物基因表达显示出重要的细胞可塑性，表明上皮间充质转化的中间表型与肿瘤的有效转移有关，且CTC的分子特征可以有效预测患者预后。
结论CTC的分子特征能够反映晚期TNBC患者的肿瘤状态，或可作为高度特异的生物标志物用于无创预后监测。
Abstract:ObjectiveTo analyze the relationships of circulating tumor cell (CTC) with prognosis and tumor status of triple-negative breast cancer(TNBC).
MethodsCTC was isolated from the peripheral blood of 32 patients confirmed as TNBC and 30 healthy controls, and molecular characteristics were analyzed.
ResultsCompared with 23 patients with CTC count < 5 in 3.2 mL blood samples, 8 patients with CTC count≥5 had worse progression-free survival and overall survival, and the difference was statistically significant (P=0.033, 0.006), suggesting that the CTC count was valuable in evaluating the prognosis of TNBC patients; among patients with CTC count ≥5 in 3.2 mL blood samples, the presence of CTC clusters was associated with poorer overall survival (P=0.001). Epithelial, mesenchymal, and dry marker gene expression of CTC showed important cellular plasticity, suggesting that the intermediate phenotype of epithelial mesenchymal transformation was associated with effective tumor metastasis, and the molecular characteristics of CTC can effectively predict patients' prognosis.
ConclusionThe molecular features of CTC can reveal the tumor status of patients with advanced TNBC and can be used as highly specific biomarkers with the potential for noninvasive prognostic monitoring.
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神经外科重症患者由于颅内高压和下丘脑自主神经功能紊乱，易发生消化功能障碍，出现胃潴留及其他肠内营养液不耐受症状[1], 可引发反流、误吸或营养不良，继而延长住院时间，增加患者经济负担[2]。目前，床旁盲插鼻肠管置入治疗是临床治疗中常用的营养支持手段之一，但存在首次置管成功率低、置管时间长等缺点[3]。南京医科大学第一附属医院神经外科重症监护室(ICU)引进了一种全新的可视化技术用于鼻肠管置入，其原理是将传统鼻肠导管内钢制导丝更换为可视导丝，再通过专用图像处理器观察胃肠道黏膜的变化，指导定位方向和位置，置管完成后无需通过X线检查即可进行幽门后喂养。本研究分析并比较可视化鼻肠管置入术与传统盲插鼻肠管置入术在神经外科重症患者中的应用效果，以期为可视化鼻肠管置入术在临床中的推广应用提供参考依据，现报告如下。
1. 资料和方法
1.1 一般资料
选取2022年3月—2023年3月于南京医科大学第一附属医院神经外科ICU接受鼻肠管置入治疗的107例患者作为研究对象。纳入标准: ①无法经口进食、有吞咽功能障碍、误吸风险高者; ②出现喂养不耐受、胃潴留、反流、误吸症状者。排除标准: ①合并上消化道出血、胃穿孔、肠坏死、食管静脉曲张或食管狭窄症状者; ②外科术后胃肠道解剖结构改变者。根据不同鼻肠管置入方式，将107例患者分为可视组53例(通过可视化技术进行鼻肠管置入)和盲插组54例(通过传统盲插方式进行鼻肠管置入)。2组患者在年龄、性别、格拉斯哥昏迷评分法(GCS)评分、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分、Richmond躁动-镇静评分(RASS)、急性胃肠损伤(AGI)和机械通气方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05), 见表 1。本研究获得医院伦理委员会审核批准(2022-SR-203), 且所有患者(或其代理人)签署知情同意书。
表 1 2组患者一般资料比较(x±s)[n(%)]指标 分类 可视组(n=53) 盲插组(n=54) t/χ2 P 年龄/岁 58.77±12.58 59.72±14.29 0.364 0.717 性别 男 36(67.92) 29(53.70) 2.269 0.132 女 17(32.08) 25(46.30) GCS评分/分 6.25±2.37 6.78±2.70 1.084 0.281 APACHEⅡ评分/分 13.32±3.27 12.63±4.06 0.969 0.335 机械通气 使用 34(64.15) 31(57.41) 0.510 0.475 未使用 19(35.85) 23(42.59) RASS/分 -2.41±0.74 -2.70±0.59 1.741 0.086 急性胃肠损伤分级 2级 29(54.72) 22(40.74) 2.094 0.148 3级 24(45.28) 32(59.26) GCS: 格拉斯哥昏迷评分法; APACHEⅡ: 急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ; RASS: Richmond躁动-镇静评分。 1.2 方法
1.2.1 可视组
借助可视化技术进行鼻肠管置入，置入过程中各部位的可视化成像见图 1。操作前，患者需禁食4~6 h或胃肠减压，置管前10 min将10 mg盐酸甲氧氯普胺注射液以静脉注射方式输入患者体内。①先用碘伏纱布擦拭可视导丝，再用石蜡油润滑，然后插入导管，注意导管末端也需用石蜡油润滑; ②嘱患者取平卧位，从鼻腔插入导管，经食管、贲门进入胃内; ③使患者取左侧卧位，床头抬高45 °, 导管经胃体、胃窦进入肠道; ④见到肠绒毛后，说明可视化鼻肠管置入术操作成功，拔出可视导丝，固定好导管。
1.2.2 盲插组
借助传统盲插法置入鼻肠管，选用的置管材料为复尔凯螺旋型鼻肠管。置管前10 min, 将10 mg盐酸甲氧氯普胺注射液以静脉注射方式输入患者体内。将导管从患者鼻腔插入胃内后，使患者取右侧卧位，床头抬高45 °, 随患者的呼吸运动送管，若导管尾孔回抽见金黄色十二指肠液，则表明导管已通过幽门进入十二指肠，然后继续推送导管至体外保留10 cm左右，抽出引导钢丝，行腹部X线检查，若显示导管位于幽门后方，说明盲插鼻肠管放置成功。
1.3 观察指标
① 首次置管成功率: 分别统计2组首次置入鼻肠管成功患者的例数，首次置管成功率=首次置管成功患者例数/置管患者总例数×100%。②置管时间: 从鼻腔插入导管开始计时，直至可视导丝或引导钢丝完全抽出。③并发症发生情况: 包括鼻出血(置管过程中出现鼻出血)、消化道出血(置管结束后3d内大便隐血实验阳性)、导管误入气道(X线检查发现导管在呼吸道内)。
1.4 统计学分析
采用SPSS 23.0统计学软件处理本研究所得数据，计量资料采用(x±s)表示，比较行独立样本t检验或配对样本t检验，计数资料采用[n(%)]表示，比较行卡方检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 首次置管成功率和置管时间比较
可视组首次置管成功率高于盲插组，置管时间短于盲插组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 2组首次置管成功率和置管时间比较(x±s)[n(%)]组别 首次置管成功 置管时间/min 盲插组(n=54) 44(81.48) 38.00±3.59 可视组(n=53) 51(96.23)* 20.11±2.47* 与盲插组比较, *P < 0.05。 2.2 并发症发生情况比较
2组患者并发症发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表 3。虽然可视化鼻肠管置入术使用的导管直径(4.47 mm)大于盲插鼻肠管使用的导管直径(3.33 mm), 但并未引发更多的消化系统和呼吸系统问题，且2组均未出现导管误入气道。
表 3 2组患者并发症发生情况比较[n(%)]组别 鼻出血 消化道出血 导管误入气道 盲插组(n=54) 7(12.96) 3(5.56) 0 可视组(n=53) 7(13.21) 2(3.77) 0 3. 讨论
神经外科重症患者大多发病突然，病情进展迅速，由于处于高代谢和高分解状态，患者对能量的需求大幅增加[4]。神经外科重症患者常伴有意识障碍和吞咽功能障碍，可出现胃潴留、反流、误吸等现象[5-6]。《欧洲肠外肠内营养学会重症患者临床营养指南》[7]和《中国卒中肠内营养护理指南》[8]均提出，对于有喂养不耐受或有高误吸风险的患者，推荐进行幽门后喂养。
幽门后置管方式主要包括床旁盲插置管法[9]、超声引导下置管法[10]、电磁导航置管法[11]、胃镜引导下置管法[12]。床旁盲插置管法的成功率为61.9%~90.0%[13-14], 操作过程中需要观察患者呼吸运动送管情况，但机械通气使得传统盲插法很难通过幽门，且操作者只能凭借听诊法或抽吸液观察法判断位置，误差性较大，此外反复置管操作可引起呼吸系统和消化系统症状[15]。超声引导下置管法的成功率为80%~92%[16-17], 该法对肥胖者及肠袢间积气较多者敏感性下降，而且效果受限于超声医师的操作水平和判断力[18]。肖金敏等[19]和MANCINI F C等[20]报道的电磁导航置管法首次置管成功率分别为93.8%和93.2%, 该法需与库派导管配合使用，设备昂贵，检查费用高，此外用二维成像仪去描记三维立体的肠道会出现重叠堆积现象，不能准确描记出轨迹。胃镜引导下置管法的成功率接近100%, 但需要麻醉和充分的术前准备，操作不熟练可引起患者心律失常及肺通气障碍[21]。此外，若因条件限制无法开展床旁胃镜检查，患者需被转运至内镜中心进行置管，大大增加了此类患者病情加重的风险。
目前，临床判断鼻肠管尖端位置的金标准仍是腹部X线检查，但该法耗时长，不具备便捷和实时定位的特征，需在置管过程中辅以其他定位方式[22]。可视化鼻肠管置入术可通过观察肠绒毛判断是否通过幽门以及是否置管成功，不仅可缩短置管时间、肠内营养启动时间，还可避免患者过度辐射暴露[23]。前期经过充分培训后，有鼻肠管置入经验的医护人员均可进行可视化鼻肠管置入术的操作，故可视化鼻肠管置入术相比其他置管方式具有高效、操作便捷的优势。可视化鼻肠管置入术目前正处于临床试用推广阶段，置管费用略高于床旁盲插置管法和超声引导下置管法，低于电磁导航置管法和胃镜引导下置管法，但可视化鼻肠管置入术无需腹部X线检查判断导管是否在位，可减少一部分辅助检查费用，从而降低整体费用。
本研究结果显示，可视化鼻肠管置入术与传统盲插鼻肠管置入术在鼻出血、消化道出血、误入气道方面无显著差异。但郑亚东等[24]报道，神经外科昏迷患者的鼻胃管不良事件发生率高达56.41%。另有研究[25]指出，临床应尽量避免盲插胃管相关不良事件，而幽门后置管较胃管置管难度更大，更应尽量选择可视化操作，以提升安全性。
可视化鼻肠管置入术目前亦存在一定缺陷: 一方面，该术式使用的导管末端为光滑的直开口，由于十二指肠的抗蠕动运动，相对螺旋型鼻空肠管而言，其可能存在迁移回胃的概率[26], 后期可优化导管头端设计，增加“子弹头”或“重力锤”结构，使导管末端锚定在小肠，防止迁移回胃; 另一方面，为了保证视野清晰，可视鼻肠管置入术需要向导管里打气或打水冲洗镜头，但由于仪器没有抽吸装置，空气进入胃肠道后不会被吸收，患者易发生肠胀气和腹部不适，未来可开发抽吸功能或CO2吹入设备，以减轻患者不适。
综上所述，与传统盲插鼻肠管置入术相比，可视化鼻肠管置管术应用于神经外科重症患者中的首次置管成功率更高，置管时间更短，且操作简单，安全性较高。
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图 1 TNBC患者CTC和健康对照者CTC的基因表达谱比较
A: 上皮相关基因(CDH1、EPCAM); B: 间充质相关基因(VIM、SNAIL1、TIMP1、CRIPTO1、ZEB1、ZEB2、LOXL2);
C: 干细胞特征基因(CD49F、ALDH2、CD44、BCL11A、ALDH1和CD133); D: AR、ANXA2基因。
灰色圆点代表健康对照者(n=30)基因表达水平，黑色圆点代表TNBC患者(n=32)基因表达水平。表 1 31例TNBC患者CTC水平与预后情况
指标 分类 n 无进展生存期/月 总生存期/月 平均值(95%CI) P 平均值(95%CI) P CTC计数 < 5个 23 22.7(14.3~31.3) 0.033 32.3(23.7~40.8) 0.006 ≥5个 8 6.5(1.6~11.4) 11.9(4.8~19.1) CTC簇 无(0个) 28 20.7(13.2~28.3) 0.071 29.4(21.7~37.1) 0.001 有(≥1个) 3 6.0(0~14.3) 6.04(0~14.3) CTC总况 < 5个CTC 23 22.7(14.3~31.2) 0.077 32.3(23.7~40.8) 0.001 ≥5个CTC但无CTC簇 5 6.8(0.8~13.4) 15.5(5.8~25.0) ≥5个CTC且有≥1个CTC簇 3 6.0(0~14.3) 6.04(0~14.3) CTC计数、CTCs簇结果均基于3.2 mL血样进行检测。 
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表 2 CTC标记物的诊断价值
基因 AUC P 95%CI EPCAM 0.697 0.013 0.560~0.843 AR 0.758 0.001 0.633~0.884 TIMP1 0.764 0.001 0.636~0.891 CRIPTO1 0.727 0.004 0.595~0.858 CDH1 0.712 0.008 0.571~0.853 VIM 0.659 0.046 0.515~0.803 CD49F 0.755 0.001 0.624~0.887 ALDH2 0.648 0.063 0.502~0.795 CD44 0.696 0.014 0.554~0.837 SNAIL1 0.793 < 0.001 0.673~0.912 BCL11A 0.766 0.001 0.637~0.894 GAPDH 0.665 0.027 0.520~0.811
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表 3 CTC标志物的单变量Cox回归分析
预后指标 基因 RR(95%CI) P 总生存期 CD49F 5.12(1.61~15.25) 0.006 ALDH2 3.12(1.16~8.41) 0.024 CD44 3.70(1.37~9.95) 0.010 TIMP1 5.12(1.87~14.02) 0.001 GAPDH 5.18(1.49~15.29) 0.004 无进展生存期 CD49F 3.33(1.23~9.01) 0.018 TIMP1 3.86(1.39~10.70) 0.004 GAPDH 3.56(1.34~10.17) 0.014
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