Application of breastfeeding combined with additionof human milk fortifier in the feeding of premature infants with very low birth weight
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摘要:目的 探讨母乳喂养联合母乳强化剂在早产极低出生体质量儿喂养中的应用效果。方法 选取80例出生体质量极低的早产儿，按随机数字表法分为对照组与观察组，各40例。对照组采用常规母乳喂养，观察组在此基础上添加母乳强化剂。观察2组早产儿在喂养前与喂养2个月后的发育情况(身长、体质量、头围)、血清骨代谢指标[钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)]、甲状腺指标[促甲状腺激素(TSH)、甲状腺激素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)]、免疫功能[T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD4+/CD8+)、血清免疫球蛋白IgA含量]的水平变化。结果 喂养2个月后, 2组出生体质量极低的早产儿头围、身长、体质量较喂养前显著增加(P＜0.05), 血清Ca、ALP、T4、T3、IgA与T淋巴细胞亚群水平均较喂养前显著升高(P＜0.05), P、TSH水平均较喂养前显著下降(P＜0.05), 且观察组上述各指标均较对照组变化更显著(P＜0.05)。结论 母乳喂养联合母乳强化剂可促进早产极低出生体质量儿的生长发育及骨骼钙化, 提高甲状腺功能，增强免疫力。Abstract:Objective To explore the application of breastfeeding combined with addition of human milk fortifier in the feeding of premature infants with very low birth weight.Methods Eighty premature infants with very low birth weight in our hospital were enrolled. They were divided into control group and observation group according to the random number table method, with 40 cases in each group. The control group was fed with conventional breast milk, and observation group was added human milk fortifier. The developmental status (body length, body weight, head circumference), and serum bone metabolism indexes [calcium (Ca), phosphorus (P), alkaline phosphatase (ALP)], thyroid indexes [thyroid stimulating hormone (TSH), thyroid hormone (T4), triiodothyronine (T3)], immune function [T lymphocyte subsets (CD3+, CD4+, CD4+/CD8+), serum immunoglobulin (IgA)]were observed among premature infants with very low birth weight in the two groups before feeding and after 2 months of feeding.Results After 2 months of feeding, the head circumference, body length and body weight and levels of serum Ca, ALP, T4, T3, IgA and T lymphocyte subsets of premature infants with very low birth weight were significantly increased compared with those before feeding (P < 0.05), while the P and TSH levels were decreased compared with those before feeding (P < 0.05). The changes of the above indexes in observation group were obvious than those in control group (P < 0.05).Conclusion Addition of human milk fortifier in breastfeeding can promote the growth and development and bone calcification, improve thyroid function and increase immunity of premature infants with very low birth weight.
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脑卒中是导致中国人群死亡的重要原因，其中缺血性脑卒中约占卒中总数的70%[1]。缺血性脑卒中是一种复杂的、受遗传等多因素影响的疾病，不但发病率和病死率高，而且复发和残疾的风险也很高[2]。研究[3-4]表明载脂蛋白E(ApoE)基因多态性等遗传因素参与缺血性脑卒中的发生、治疗和预后，ApoE基因多态性可能通过调节血脂水平影响动脉粥样硬化和缺血性脑卒中的发生。与高加索地区人群相比，携带ε4等位基因的亚洲人群发生缺血性脑卒中的风险更高[5]。在中国人群中，研究[6-8]也证实ApoEε4等位基因携带者罹患缺血性脑卒中的风险更大。此外, ApoE基因多态性不仅与缺血性脑卒中密切相关，而且与其危险因素如高血压、糖尿病[10]、冠状动脉粥样硬化[11]及高胆固醇血症[12]等疾病也密切相关，较之ε2和ε3等位基因，ε4等位基因携带者发生上述疾病的风险明显增高。
ApoE由人类19号染色体上的ApoE基因编码，是一种主要在肝脏合成的多态性蛋白[13], 在脂质运输和代谢过程中发挥重要作用，参与多种疾病的发生和预后。ApoE基因有2个常见、非同义多态性位点526C>T和388T>C, 二者形成3种等位基因[ε2(388T-526T)、ε3(388T-526C)、ε4(388C-526C)]及6种基因表型[14](ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4)。目前有关ApoE基因多态性的研究多集中在与阿尔兹海默病[15]、脑卒中[6]、糖尿病[6]等疾病相关性方面，目前有关河北地区ApoE基因多态性与缺血性脑卒中及其危险因素的相关研究较少。本研究采用聚合酶链式反应(PCR)-荧光探针法对河北地区缺血性脑卒中患者进行ApoE基因多态性检测，并检测卒中人群脂蛋白a[Lp(a)]、尿酸(UA)及血脂水平等，分析缺血性脑卒中患者ApoE基因多态性分布及其与缺血性脑卒中危险因素(如糖尿病、高血压、高尿酸血症、高血脂等)的相关性，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2019年10—12月河北医科大学第一医院神经内科门诊就诊的1 027例缺血性脑卒中患者为研究对象。缺血性脑卒中纳入标准: ①年龄≥40岁者; ②缺血性脑卒中诊断参考《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[6]，脑CT或MRI检查确认脑内有缺血性病变者。排除标准: ①近1个月内(通过确认患者的病历)服用降脂药物者; ②合并严重感染、肿瘤、严重的肝肾功能障碍和其他影响血脂的疾病者; ③合并阿尔茨海默病、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病者。
为进一步分析ApoE基因多态性与缺血性脑卒中危险因素的相关性，筛选门诊中住院的资料齐全的患者716例，将其分为3组，即ε2等位基因携带者(ε2/ε2、ε2/ε3)、ε3等位基因携带者(ε3/ε3)、ε4等位基因携带者(ε3/ε4、ε4/ε4)。排除ε2/ε4基因型(因其对血脂代谢的相反作用)。本研究经河北医科大学第一医院伦理委员会审批(批准号20190418), 患者及其家属对研究项目知情并签署知情同意书。
1.2 仪器和试剂
PCR扩增仪及DNA提取仪: 全自动核酸提纯及荧光PCR分析仪Anadus9850(厦门安普利生物工程有限公司); 人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(武汉友芝友医疗科技有限公司，批号19052008); 血液基因组DNA提取试剂盒(厦门安普利生物工程有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 血液基因组DNA提取
抽取受试者空腹静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，使用核酸提取试剂盒(厦门安普利生物工程有限公司)提取血液中的基因组DNA，严格按试剂盒说明书进行提取和检测。
1.3.2 PCR反应体系和扩增条件
在2 μL待测样本的基因组DNA(推荐浓度为5~15 ng/μL)、弱阳性对照和空白对照反应管中分别加入装有23 μL SLCO1B1*lb、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4的反应液，再进行PCR扩增检测。PCR反应条件: 尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理阶段为37 ℃下10 min, 循环1次; 预变性阶段为95 ℃下5 min, 循环1次; PCR阶段为95℃下15 s、60 ℃下45 s, 循环40次(设置在此阶段结束时采集荧光信号)。
1.3.3 血液学指标检测
于清晨抽取患者空腹静脉血2 mL进行血液学指标检测，采用Beckman LX20全自动血生化分析仪检测UA、Lp(a)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。高胆固醇血症标准为TC≥5.72 mmol/L, HDL≤0.90 mmol/L, LDL-C≥3.64 mmol/L[17]。
1.4 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析, Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验或Fisher精确检验; 采用方差分析或Wilcoxon秩和检验评估尿酸、Lp(a)、血脂等与ApoE基因多态性的关系; 通过单因素和多因素Logistic回归分析计算95%置信区间(CI)和优势比(OR)。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 河北地区缺血性脑卒中患者ApoE基因型和等位基因分布特点
河北地区缺血性脑卒中患者ApoE基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.87、0.27)。在汉族人群的6种ApoE基因型中, ε3/ε3型占69.52%, 其余由高至低依次为ε2/ε3型(15.00%)、ε3/ε4型(12.46%)、ε2/ε4型(2.14%)、ε4/ε4型(0.49%)和ε2/ε2型(0.39%), ApoE基因型和等位基因在男性和女性患者中的分布差异无统计学意义(P=0.395、0.641)。见表 1。
表 1 缺血性脑卒中患者等位基因和基因型频率分布[n(%)]等位基因/基因型 男性(n=582) 女性(n=445) 总病例(n=1 027) ε2/ε2 2(0.34) 2(0.45) 4(0.39) ε2/ε3 85(14.60) 69(15.51) 154(15.00) ε2/ε4 13(2.23) 9(2.02) 22(2.14) ε3/ε3 410(70.45) 304(68.31) 714(69.52) ε3/ε4 69(11.86) 59(13.26) 128(12.46) ε4/ε4 3(0.52) 2(0.45) 5(0.49) ε2 * 102(8.76) 82(9.21) 184(8.96) ε3 * 974(83.68) 736(82.70) 1710(83.25) ε4 * 88(7.56) 72(8.09) 160(7.79) *表示计算ε2、ε3、ε4比率时，基因型总数为2 054(1 027×2), 其中男性基因型总数为1 164, 女性基因型总数为890。 2.2 缺血性脑卒中患者的临床特征及其与危险因素的相关性
ε2等位基因携带组、ε3等位基因携带组、ε4等位基因携带组的高血压、糖尿病发生率及UA、同型半胱氨酸(Hcy)水平无差异，但3组Lp(a)、TG、LDL-C及高胆固醇血症发生率比较，差异有统计学意义(P=0.003、0.042、0.019、0.013), 表现为ε2等位基因携带者TG水平高于ε4等位基因携带者，而ε4等位基因携带者Lp(a)、LDL-C水平及高胆固醇血症发生率高于ε2等位基因携带者。见表 2、图 1。ε4等位基因携带组TC水平有升高趋势, HDL-C水平有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05); ε2等位基因携带组与ε3等位基因携带组TG、TC、LDL-C、HDL-C水平差异无统计学意义(P>0.05)。
表 2 ε2、ε3和ε4等位基因携带组患者临床资料的比较[n(%)][M(P25, P75)]临床资料 ε2等位基因携带组(n=104) ε3等位基因携带组(n=515) ε4等位基因携带组(n=97) P 年龄/岁 60(52, 68) 62(54, 68) 63(52, 69) 0.633 BMI/(kg/m 2) 25.27(22.89, 27.31) 25.06(23.44, 27.34) 25.24(23.44, 27.23) 0.866 男性 59(56.73) 296(57.48) 54(55.67) 0.944 高血压 61(58.65) 318(61.75) 56(57.73) 0.678 糖尿病 21(20.19) 112(21.75) 22(22.68) 0.908 饮酒史 23(22.12) 134(26.02) 27(27.84) 0.619 吸烟史 24(23.08) 141(27.38) 54(55.67) 0.652 UA/(mmol/L) 312.4(258.00, 397.60) 319.90(271.45, 366.60) 319.10(253.00, 379.00) 0.380 Lp(a)/(mmol/L) 94.10(63, 45, 226.00) 154.00(85.70, 323.30) 164(96.30, 286.70) 0.003 * Hcy/(mmol/L) 14.94(11.03, 20.94) 13.90(11.22, 20.38) 14.38(11.78, 18.97) 0.965 TG/(mmol/L) 1.49(1.12, 1.95) 1.30(0.96, 1.81) 1.37(0.95, 1.89) 0.042 * TC/(mmol/L) 4.43(4.00, 5.18) 4.69(3.94, 5.45) 4.80(3.97, 5.71) 0.128 HDL-C/(mmol/L) 1.10(0.89, 1.27) 1.05(0.91, 1.25) 0.99(0.88, 1.19) 0.129 LDL-C/(mmol/L) 2.87(2.37, 3.31) 3.01(2.43, 3.55) 3.17(2.58, 3.84) 0.019 * 高胆固醇血症 47(45.19) 230(44.66) 59(60.82) 0.013 * BMI: 体质量指数; UA: 尿酸; Lp(a): 脂蛋白a; Hcy: 同型半胱氨酸; TG: 甘油三酯; TC: 总胆固醇;
HDL-C: 高密度脂蛋白胆固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇。
*表示ε2或ε3等位基因携带组与ε4等位基因携带组比较, 差异有统计学意义。![]()
图 1 ε2、ε3和ε4等位基因携带组患者临床指标水平比较A: 3组TG水平比较; B: 3组TC水平比较; C: 3组HDL-C水平比较; D: 3组LDL-C水平比较; E: 3组UA水平比较; F: 3组Hcy水平比较; G: 3组Lp(a)水平比较。*表示组间差异有统计学意义, ns表示组间差异无统计学意义。2.3 ApoE基因多态性与高胆固醇血症的相关性
为进一步探讨ApoE基因多态性与高胆固醇血症的关系，以高胆固醇血症为因变量, ApoE基因型及临床指标为自变量，进行单因素Logistic回归分析，各项变量赋值见表 3。结果显示, ApoE ε4等位基因(OR=1.924, 95%CI为1.235~2.997, P=0.004)、糖尿病(OR=1.963, 95%CI为1.367~2.820, P < 0.001)是高胆固醇血症发生的危险因素，见表 4。
表 3 高胆固醇相关危险因素的变量赋值表变量 赋值 0 1 2 性别 男 女 — 高血压 无 有 — 糖尿病 无 有 — 吸烟史 无 有 — 饮酒史 无 有 — ApoE基因型 (ε2/ε2+ε2/ε3) (ε3/ε3) (ε3/ε4+ε4/ε4) 表 4 高胆固醇血症相关危险因素的单因素Logistic回归分析变量 OR 95%CI P 年龄 0.776 0.576~1.044 0.094 性别 0.829 0.615~0.117 0.218 体质量指数 1.039 0.997~1.083 0.069 高血压 1.095 0.811~1.480 0.553 糖尿病 1.963 1.367~2.820 <0.001 饮酒史 1.081 0.773~1.512 0.694 吸烟史 0.913 0.654~1.274 0.592 ApoE基因型 1.924 1.235~2.997 0.004 在校正单因素回归分析中P < 0.10的因素后，将年龄、ε4等位基因、糖尿病、体质量指数(BMI)纳入多因素回归方程中，使用前进法分析，结果发现以ε3/ε3基因型为参照, ApoEε4等位基因与高胆固醇血症的风险增加相关(OR=1.943, 95%CI为1.240~3.043)。见表 5。回归分析的Hosmer-Lymeshaw检验显示, χ2=12.171、P=0.144, 表明该模型与原始数据吻合良好。
表 5 高胆固醇血症危险因素的多因素逐步法Logistic回归分析变量 OR(95%CI) P 年龄 0.993(0.978~1.007) 0.324 体质量指数 1.035(0.992~1.079) 0.110 糖尿病 2.001(1.384~2.893) < 0.001 ApoE ε3(ε3/ε3) 1.000 — ε2(ε2/ε2+ε2/ε3) 1.032(0.672~1.585) 0.885 ε4(ε3/ε4+ε4/ε4) 1.943(1.240~3.043) 0.004 多因素回归分析以ε3/ε3基因型为参照。 3. 讨论
ApoE基因多态性的分布在不同种族间存在差异。本研究中，缺血性脑卒中患者中ε3/ε3基因型比率最高(69.52%), 而ε2/ε2基因型比率最低(0.39%), 与河北地区[18]、华中地区[19]和南部地区[20]数据相似。在等位基因分布数据方面，河北地区缺血性脑卒中患者ε2等位基因频率(8.96%)略低于健康(9.4%)或无缺血性脑卒中(6.51%~19.40%)[2, 7, 21]的中国人群, ε4等位基因频率(7.79%)亦低于既往研究[2, 3, 7, 22]报告的数据。本研究还发现, ApoE等位基因频率与既往研究[23]报道的白种人等位基因频率差异较大，后者ε4、ε2、ε3的等位基因频率分别为15%、8%和77%。这提示不同种族和地区间ApoE基因多态性分布存在明显的差异。作者分析本研究与既往中国人群报道存在差异的原因为: 本研究对纳入患者进行了详细的筛选，排除了合并有严重认知功能障碍、冠心病等与ε4等位基因比率升高密切相关的疾病，更准确地反映了ε4等位基因在缺血性脑卒中人群中的分布特征。
ApoE基因多态性与缺血性脑卒中相关，但ApoE是对缺血性脑卒中有直接影响，还是通过影响其危险因素进而间接影响疾病的发生，目前尚无定论。本研究针对缺血性脑卒中人群，分析了ApoE与其危险因素(如高血压、糖尿病、高UA、高Hcy、高胆固醇血症等)的相关性，结果并未发现ApoE基因多态性与高血压、糖尿病等疾病的发生率具有相关性。本研究发现ε4等位基因携带者高胆固醇血症的发病率及Lp(a)、LDL-C水平显著增高，考虑到ApoE基因多态性可显著影响脂质代谢，而脂质异常代谢又会造成胆固醇水平升高，不仅使患者罹患缺血性脑卒中的风险升高，也增加了高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等相关危险因素的发生风险，从而进一步影响脑卒中的发生。
本研究进行了单因素和多因素回归分析，发现在调整年龄、BMI、糖尿病和ApoE基因型后, ε4等位基因增加了患者罹患高胆固醇血症的风险; 与ε3/ε3基因型相比, ε4等位基因使缺血性脑卒中患者发生高胆固醇血症的风险增加了1.943倍(OR=1.943, 95%CI为1.240~3.043), 这也与既往研究[12, 24]相似。上述结果提示，无论是通过影响高血压、冠状动脉粥样硬化、高胆固醇血症等危险因素，还是对其产生直接影响, ApoE基因多态性对缺血性脑卒中的影响都与血脂代谢紊乱这一环节紧密相连, ApoE基因多态性作为脂质代谢的重要影响因素，对缺血性脑卒中的发生产生一定的影响。
因此，对于携带ε4等位基因的缺血性脑卒中患者，应鼓励其控制胆固醇摄入量，坚持少食多餐的原则，倡导良好的生活方式，戒烟和限酒，并进行适当的活动。此外，本研究也发现ε2等位基因携带者TG水平偏高，建议患者在满足日常基本营养需求的基础上，控制总能量的摄入，合理搭配各营养元素的组成比例，控制体质量，戒烟限酒，并坚持定期中强度代谢运动[25], 从而维持体内血脂水平的稳定，预防高胆固醇血症及缺血性脑卒中等疾病的发生。
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表 1 2组早产极低出生体质量儿喂养前后头围、身长、体质量比较(x±s)
组别 时点 头围/cm 身长/cm 体质量/kg 观察组(n=40) 喂养前 34.02±1.17 49.85±2.13 3.26±0.22 喂养2个月后 39.33±1.25*# 58.13±1.63*# 5.33±0.34*# 对照组(n=40) 喂养前 34.02±1.19 49.56±1.98 3.26±0.22 喂养2个月后 37.81±1.31* 55.12±1.49* 4.85±0.35* 与喂养前比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05。 
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表 2 2组早产极低出生体质量儿喂养前后血清骨代谢指标比较(x±s)
组别 时点 Ca/(mmol/L) P/(mmol/L) ALP/(U/L) 观察组(n=40) 喂养前 2.09±0.15 2.09±0.28 257.80±56.05 喂养2个月后 3.01±0.09*# 1.43±0.34*# 468.93±92.97*# 对照组(n=40) 喂养前 2.02±0.13 2.10±0.22 240.33±79.03 喂养2个月后 2.25±0.15* 2.00±0.34* 385.00±77.28* Ca: 钙; P: 磷; ALP: 碱性磷酸酶。与喂养前比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05。
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表 3 2组早产极低出生体质量儿喂养前后甲状腺指标比较(x±s)
mmol/L 组别 时点 TSH T4 T3 观察组(n=40) 喂养前 12.34±3.14 7.87±1.45 24.45±4.89 喂养2个月后 5.98±1.76*# 12.53±2.05*# 143.21±15.02*# 对照组(n=40) 喂养前 12.12±3.15 7.56±1.51 25.31±5.02 喂养2个月后 8.87±2.27* 8.89±1.79* 109.67±13.32* TSH: 促甲状腺激素; T4: 甲状腺激素; T3: 三碘甲状腺原氨酸。与喂养前比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05。
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表 4 2组早产极低出生体质量儿喂养前后免疫功能比较(x±s)
组别 时点 CD3+/% CD4+/% CD4+/CD8+ IgA/(mg/L) 观察组(n=40) 喂养前 45.90±6.98 31.49±4.32 1.06±0.25 2.90±1.93 喂养2个月后 63.91±8.98*# 44.10±5.93*# 1.87±0.25*# 7.88±2.93*# 对照组(n=40) 喂养前 46.18±6.13 31.54±4.41 1.04±0.68 2.89±1.10 喂养2个月后 53.18±8.21* 35.86±4.79* 1.24±0.69* 5.78±1.96* 与喂养前比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05。
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