Relationship between clinical features of vitiligo and balance of T helper cell 17 and regulatory T cell in peripheral blood
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摘要:目的 分析白癜风患者外周血辅助性T细胞17(Th17)与调节性T细胞(Treg)的平衡与临床特征的关系。方法 选取白癜风患者109例，其中进展期患者56例，稳定期患者53例，另选取同期本院健康体检者59例为对照组。采用流式细胞术检测3组受试者外周血Th17、Treg细胞数量; 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测3组受试者白介素-17(IL-17)、叉头盒蛋白P3(Foxp3)水平; 采用Pearson法分析白癜风患者Th17、Treg细胞及IL-17、Foxp3的关系。结果 对照组、稳定期组、进展期组Th17细胞含量、Th17/Treg、IL-17水平逐渐升高, Treg细胞含量、Foxp3水平逐渐降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。随着白癜风皮损面积的增加, Th17细胞含量、Th17/Treg、IL-17水平逐渐升高, Treg细胞含量、Foxp3水平逐渐降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。白癜风患者Th17细胞与Treg细胞、IL-17与Foxp3均呈显著负相关(r=-0.449、-0.497, P < 0.05)。结论 Th17/Treg细胞平衡可能与白癜风的发生及临床特征有关。Abstract:Objective To analyze the correlation between progression of disease and balance of T helper cell 17 (Th17) and regulatory T cell (Treg) in peripheral blood of patients with vitiligo.Methods A total of 109 patients with vitiligo were selected, including 56 patients in progressive stage and 53 patients in stable stage. At the same time, 59 healthy people with physical examinations were selected as control group. The number of Th17 and Treg cells in peripheral blood of the three groups was detected by flow cytometry. The levels of interleukin-17 (IL-17) and forkhead-box-protein P3 (Foxp3) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pearson method was used to analyze the relationships between Th17, Treg cells and IL-17, Foxp3 in patients with vitiligo.Results With the progress of the disease, the Th17 cell content, Th17/Treg and IL-17 levels in the control group, stable group and advanced group increased gradually, while the Treg cell content and Foxp3 level decreased gradually (P < 0.05). With the increase of vitiligo lesion area, Th17 cell content, Th17/Treg and IL-17 levels gradually increased, while Treg cell content and Foxp3 level gradually decreased (P < 0.05). There were significant negative correlations between Th17 cells and Treg cells, IL-17 and Foxp3 in vitiligo patients (r=-0.449, -0.497, P < 0.05).Conclusion Conclusion Th17/Treg cell balance may be related to the occurrence and clinical features of vitiligo.
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Keywords:
- T helper cell 17 /
- regulatory T cell /
- cell balance /
- vitiligo /
- forkhead-box-protein P3 /
- correlation
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白癜风是一种因皮肤黑素细胞功能消失或数量减少引起的后天色素脱失性皮肤病，好发于面部、背侧、四肢末端等部位[1]。根据白癜风病史及体征，可将白癜风分为进展期和稳定期2个阶段。目前研究[2]认为白癜风是一种多基因遗传的自身免疫性疾病，其发病机制主要与遗传、自身免疫、氧化应激等有关，但具体发病机制尚不清楚。辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)是CD4+T细胞的2个亚群，Th17细胞主要通过分泌炎症细胞因子如白介素-17(IL-17)、白介素-22(IL-22)等介导炎症反应，Treg细胞则主要是通过直接接触有效的免疫细胞来维持自身耐受性，从而抑制自身免疫[3]。Th17与Treg细胞能够相互影响，与相应的细胞因子及转录因子形成复杂的调控网络，研究[4-6]表明Th17/Treg细胞失衡与包括白癜风在内的多种自身免疫性疾病的发生有关。本研究对白癜风患者外周血Th17、Treg细胞数量及相关细胞因子进行检测，分析Th17/Treg细胞平衡与白癜风临床特征的关系，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院皮肤科门诊2017年4月—2018年6月确诊的白癜风患者109例，其中白癜风进展期患者56例，男31例，女25例，年龄8~60岁，平均(23.15±7.66)岁，平均病程(32.61±11.35)个月; 白癜风稳定期患者53例，男29例，女24例，年龄7~58岁，平均(22.53±6.87)岁，平均病程(31.78±15.62)个月。根据外科常用体表面积算法，手掌面积为其体表面积的1%, 将患者分为皮损面积 < 1%者38例, 1%~10%者45例, >10%者26例。
白癜风诊断参考《白癜风诊疗共识(2018版)》[7]中相关标准。纳入标准: ①临床及病理诊断为白癜风患者; ② 3个月内未接受紫外线、免疫抑制剂等系统治疗者; ③患者知情并同意参与本研究。排除标准: ①白癜风合并晕痣患者; ②患有其他自身免疫系统疾病者; ③肝、肾等脏器功能不全者; ④妊娠期和哺乳期妇女; ⑤免疫功能低下者。选取本院健康体检者59例为对照组，男33例，女26例，年龄8~62岁，平均(24.24±8.13)岁。本研究经本院伦理道德委员会审核通过。
1.2 主要试剂及仪器
淋巴细胞分离液，购自美国Sigma公司; 鼠抗人CD3-APC、CD4-FITC、CD25-PE、IL-17A-PE、Foxp3-APC抗体，购自美国eBioscience公司; 破膜剂(Fix/Perm)、固定剂/破膜剂(Perm/Wash)购自美国BD公司; 佛波酯(PMA)、离子霉素购自美国Sigma公司; FACS calibur流式细胞仪购自美国BD公司。IL-17、叉头盒蛋白P3(Foxp3)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司。
1.3 研究方法
1.3.1 血液样本采集
抽取白癜风患者及对照组体检者空腹外周静脉血7 mL, 2 mL置于普通离心管中, 4 ℃下3 000转/min离心10 min, 取上清并保存在-80 ℃冰箱。其余血样置于EDTA抗凝管中，立即行流式细胞术检测。
1.3.2 单个核细胞(PBMC)的分离
灭菌离心管中加入5 mL淋巴分离液，之后加入EDTA抗凝血, 4 ℃下3 000转/min离心20 min, 此后采用密度梯度法分离PBMC。
1.3.3 流式细胞术检测Th17、Treg细胞
准备Treg细胞检测，将PBMC细胞悬浮液稀释至1×106个/mL, 之后吸取100 μL加至流式管中，依次加入鼠抗人CD4-FITC、CD25-PE抗体，并混合均匀, 4 ℃遮光孵育; 此后加入流式细胞染色缓冲液(PBS), 混匀，离心，弃上清; 再加Fix/Perm重悬细胞, 4 ℃遮光孵育，再加入Fix/Perm, 离心弃上清; 在细胞悬液中加入正常大鼠血清进行阻断, 4 ℃遮光孵育，加入Foxp3-APC抗体, 4 ℃遮光孵育; 再加入Fix/Perm, 离心，弃上清; 最后加入固定液重悬细胞，流式细胞仪上检测Treg细胞。准备Th17细胞检测，取PBMC细胞悬浮液，加入至24孔培养板中，依次加入PMA、离子霉素和阻断剂，置于CO2培养箱中, 35 ℃、5%CO2孵育4 h, 此后收集细胞，离心，弃上清; 加入PBS重悬细胞，加入鼠抗人CD3-APC、CD4-FITC, 混匀, 4 ℃遮光孵育; 再加入PBS, 混匀，离心，弃上清; 加入破膜打孔液，混匀, 4 ℃遮光孵育; 加入Perm/Wash, 离心，弃上清; 加入IL-17A-PE单抗，混匀, 4 ℃遮光孵育，再加入Perm/Wash缓冲液进行洗涤，离心，弃上清; 加入固定液重悬细胞，流式细胞仪检测Th17细胞。
1.3.4 ELISA检测细胞因子水平
采用ELISA试剂盒检测IL-17、Foxp3水平，操作严格按照说明书进行。
1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0进行数据统计分析，计数资料采用(x±s)表示，组间比较采用t检验, 3组间差异比较采用单因素方差分析，采用SNK法进行两两组间比较; 计量资料采用n表示，行χ2检验; 采用Pearson法分析白癜风患者Th17、Treg及IL-17、Foxp3的关系, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料比较
3组受试者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P > 0.05); 白癜风进展期组及白癜风稳定期组患者面部发病率均高于其他部位，但组间颜面、手足、四肢及躯干发病率比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 1。
表 1 3组受试者一般资料比较(x±s)组别 n 性别 年龄/岁 发病部位 男 女 颜面 手足 四肢 躯干 白癜风进展期组 56 31 25 23.15±7.66 31 11 13 20 白癜风稳定期组 53 29 24 22.53±6.87 25 8 11 15 对照组 59 33 26 24.24±8.13 — — — — 2.2 3组受试者外周血Th17、Treg细胞及细胞因子水平比较
与对照组比较，白癜风进展期组和白癜风稳定期组患者Th17细胞含量、Th17/Treg、IL-17水平升高，Treg细胞含量、Foxp3水平降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。与白癜风稳定期组患者比较，白癜风进展期组患者Th17细胞含量、Th17/Treg、IL-17水平较高, Treg细胞含量、Foxp3水平较低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
表 2 3组受试者外周血Th17、Treg细胞及细胞因子水平比较(x±s)组别 n Th17细胞/% Treg细胞/% Th17/Treg IL-17/(pg/mL) Foxp3/(ng/mL) 白癜风进展期组 56 1.35±0.55*# 3.56±0.68*# 0.35±0.11*# 35.19±6.48*# 6.85±3.18*# 白癜风稳定期组 53 1.12±0.52* 4.11±0.77* 0.29±0.12* 24.64±5.69* 10.33±3.26* 对照组 59 0.75±0.49 4.85±0.72 0.19±0.11 16.51±5.94 13.49±3.54 Th17: 辅助性T细胞17; Treg: 调节性T细胞; IL-17: 白介素-17; Foxp3: 叉头盒蛋白P3。
与对照组比较, *P < 0.05; 与白癜风稳定期组比较, #P < 0.05。2.3 不同皮损面积白癜风患者外周血Th17、Treg细胞及细胞因子水平比较
与白癜风皮损面积%组患者比较，皮损面积1%~10%组、>10%组患者Th17细胞含量、Th17/Treg、IL-17水平升高，Treg细胞含量、Foxp3水平降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。与皮损面积1%~10%组患者比较，皮损面积>10%组患者Th17细胞含量、Th17/Treg、IL-17水平较高，Treg细胞含量、Foxp3水平较低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。
表 3 不同皮损面积白癜风患者外周血Th17、Treg细胞及细胞因子水平(x±s)组别 n Th17细胞/% Treg细胞/% Th17/Treg IL-17/(pg/mL) Foxp3/(ng/mL) 皮损面积 < 1%组 38 1.02±0.26*# 4.45±0.42*# 0.23±0.12*# 21.37±4.42*# 15.28±2.53*# 皮损面积1%~10%组 45 1.24±0.29* 3.98±0.46* 0.31±0.11* 29.43±4.67* 11.59±2.61* 皮损面积>10%组 26 1.39±0.31 3.24±0.41 0.39±0.13 38.46±4.78 6.42±2.89 Th17: 辅助性T细胞17; Treg: 调节性T细胞; IL-17: 白介素-17; Foxp3: 叉头盒蛋白P3。
与皮损面积>10%组比较, *P < 0.05; 与皮损面积1%~10%组比较, #P < 0.05。2.4 白癜风患者Th17、Treg细胞及细胞因子的相关性
白癜风患者Th17细胞与Treg细胞呈显著负相关(r=-0.449, P < 0.05), 血清IL-17与Foxp3水平呈显著负相关(r=-0.497, P < 0.05), 见图 1、2。
3. 讨论
白癜风是一种慢性自身免疫性疾病，产生的白斑病变严重影响患者的身心健康，尤其是青少年患者。压力、晒伤、妊娠、感染等多种不良刺激均可能导致免疫系统失调，从而引发白癜风。白癜风免疫学说[8]认为白癜风是因自身免疫细胞攻击黑素细胞导致黑素细胞凋亡，从而导致白斑的产生。研究表明Th17/Treg细胞失衡参与类风湿性关节炎[9]、系统性红斑狼疮[5]、自身免疫性肝病[10]等自身免疫性疾病。临床研究[11]表明白癜风常伴发一些自身免疫性疾病，如自身免疫甲状腺疾病，且患有自身免疫性疾病患者白癜风发病率较一般人群高10~15倍。本研究结果表明，白癜风患者存在Th17/Treg细胞失衡，提示白癜风与其他自身免疫性疾病可能具有相似的发病机制。
CD4+T细胞在受到外来抗原刺激后会增殖、分化为各种效应的T细胞，包括Th1、Th2、Th17及Treg细胞，进而产生多种炎症细胞因子，参与疾病的发生与发展。Th17细胞因能够大量分泌IL-17而被命名为Th17细胞, Th17细胞还可以分泌IL-22、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种细胞因子，参与机体的自身免疫，发挥特定功能[12]。IL-17能够诱导免疫细胞产生促炎因子和趋化因子，参与炎症发展、免疫应答和免疫排斥等多种生物学过程，与多种免疫性疾病的发生机制有关[13]。线粒体功能障碍可诱导过量活性氧产生，是多种炎症和自身免疫性疾病的潜在机制，研究[14]表明IL-17能够抑制正常人表皮黑素细胞的生成，而IL-17能够促进线粒体功能障碍和活性氧的积累，从而诱导白癜风黑素细胞的凋亡。霍晶等[15]研究表明，白癜风患者外周血Th17水平、血清IL-17水平均显著高于正常对照组，且进展期白癜风患者Th17、IL-17水平高于稳定期患者。本研究结果表明，白癜风患者外周血Th17细胞水平、IL-17表达水平均高于对照组，且白癜风进展期患者高于稳定期患者，随着白癜风患者皮损面积的增加，外周血Th17细胞及IL-17表达显著升高，提示Th17、IL-17可能与白癜风的发生及发展有关。
Treg细胞是除Th1、Th2、Th17之外的T细胞亚群，能够分泌多种细胞因子参与免疫反应，在免疫平衡中具有免疫抑制的作用。Foxp3是叉状头转录因子家族的成员，是Treg细胞的关键转录因子，其能够与染色体特异性结合而影响Treg细胞的增殖与分化，从而参与免疫调节。ZHANG Q等[16]研究表明，活动期白癜风患者外周血中Treg细胞数量显著减少，且相应的细胞因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)的表达也相应降低。BHARDWAJ S等[17]研究表明，非节段性白癜风患者Foxp3 mRNA水平显著降低。本研究结果表明，白癜风患者Treg细胞、Foxp3水平均低于对照组，进展期患者Treg细胞、Foxp3水平低于稳定期患者，差异均有统计学意义(P < 0.05)，提示Treg细胞可能参与白癜风发病，原因可能是Treg细胞引起白癜风患者的免疫失常。Th17细胞与Treg细胞在细胞免疫功能上相互抑制，TGF-β是Treg与Th17细胞分化共同的调控因子，仅TGF-β存在的条件下，可以促进Treg细胞的分化和维持免疫耐受，但在炎症因子存在的条件下, TGF-β可以诱导Th17细胞分化，且可以诱导Foxp3表达的减少，并且在炎性条件下, Treg细胞能够产生IL-17, 从而转化为Th17细胞，导致Th17/Treg细胞的失衡[3]。本研究结果表明，进展期、稳定期白癜风患者Th17/Treg均显著高于对照组，且白癜风患者血清Th17细胞与Treg细胞呈显著负相关, IL17与Foxp3呈显著负相关。总之, Th17/Treg细胞平衡可能与白癜风的发生及临床特征有关。
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表 1 3组受试者一般资料比较(x±s)
组别 n 性别 年龄/岁 发病部位 男 女 颜面 手足 四肢 躯干 白癜风进展期组 56 31 25 23.15±7.66 31 11 13 20 白癜风稳定期组 53 29 24 22.53±6.87 25 8 11 15 对照组 59 33 26 24.24±8.13 — — — — 
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表 2 3组受试者外周血Th17、Treg细胞及细胞因子水平比较(x±s)
组别 n Th17细胞/% Treg细胞/% Th17/Treg IL-17/(pg/mL) Foxp3/(ng/mL) 白癜风进展期组 56 1.35±0.55*# 3.56±0.68*# 0.35±0.11*# 35.19±6.48*# 6.85±3.18*# 白癜风稳定期组 53 1.12±0.52* 4.11±0.77* 0.29±0.12* 24.64±5.69* 10.33±3.26* 对照组 59 0.75±0.49 4.85±0.72 0.19±0.11 16.51±5.94 13.49±3.54 Th17: 辅助性T细胞17; Treg: 调节性T细胞; IL-17: 白介素-17; Foxp3: 叉头盒蛋白P3。
与对照组比较, *P < 0.05; 与白癜风稳定期组比较, #P < 0.05。
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表 3 不同皮损面积白癜风患者外周血Th17、Treg细胞及细胞因子水平(x±s)
组别 n Th17细胞/% Treg细胞/% Th17/Treg IL-17/(pg/mL) Foxp3/(ng/mL) 皮损面积 < 1%组 38 1.02±0.26*# 4.45±0.42*# 0.23±0.12*# 21.37±4.42*# 15.28±2.53*# 皮损面积1%~10%组 45 1.24±0.29* 3.98±0.46* 0.31±0.11* 29.43±4.67* 11.59±2.61* 皮损面积>10%组 26 1.39±0.31 3.24±0.41 0.39±0.13 38.46±4.78 6.42±2.89 Th17: 辅助性T细胞17; Treg: 调节性T细胞; IL-17: 白介素-17; Foxp3: 叉头盒蛋白P3。
与皮损面积>10%组比较, *P < 0.05; 与皮损面积1%~10%组比较, #P < 0.05。
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