Analysis in mutation in MITF gene in type Ⅱ Waardenburg syndrome
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摘要:目的 探讨1例瓦登伯格综合征(WS)家系遗传性致病因素，以期通过遗传咨询而实现WS型耳聋的一级预防。方法 纳入三代5名家系成员(汉族)为研究对象，详细询问病史，采集外周静脉血并抽提DNA, 采用Sanger测序对3大常见耳聋基因和瓦登伯格综合征候选基因进行全序列筛查。结果 MITF基因截短突变c.C763T(p.R255X)在该家系内呈现基因型-表型共分离。结论 截短突变c.C763T导致第255位精氨酸密码子突变为终止密码子，蛋白质合成提前终止，很可能为该家系的遗传性致病因素。MITF蛋白正常功能丧失所致的单倍体剂量不足很可能为该突变的致病机制。遗传咨询、婚育指导和产前诊断技术的应用，可避免由该突变导致的后代耳聋。Abstract:Objective To explore the genetic factors of a hereditary disease named Waardenburg syndrome (WS) in one case so as to achieve the goal of its prevention by genetic counseling.Methods Five family members (Han nationality) of three generations were included in the study. Peripheral venous blood samples were collected and DNA was extracted after a detailed medical history inquiry. Mutation screening of all exons for three common deaf genes and six WS candidate genes was performed by Sanger sequencing.Results The c.C763T (p.R255X) in MITF truncated mutation segregated with the phenotypes within the family.Conclusion The truncated mutated p.R255X results in the mutation of the 255th arginine codon into termination codon, leading to premature termination of protein synthesis, which is probably the hereditary pathogenic factor of this family. The lack of haploid dose caused by the normal function loss of MITF protein is likely to be the pathogenic mechanism of this mutation. Genetic counseling, marital guidance and prenatal diagnostic techniques can prevent deafness in offspring caused by the mutation.
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Keywords:
- MITF gene /
- truncated mutation /
- Waardenburg syndrome /
- haplo-insufficiency /
- genetic counseling
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瓦登伯格综合征(WS)是一种常染色体显性遗传综合征性耳聋，感音神经性聋及色素异常为其特征性表型[1]。该病的主要发病机制为来源于神经嵴的黑色素细胞缺失，进而引起一系列的相应症状[2]。WS发病率在全部耳聋中占0.9%~2.8%, 在先天性耳聋中占2%~5%[1]。根据是否伴有额外的临床表型, WS可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型4种亚型[3-4]。Ⅰ型和Ⅱ型最为常见[5-6], Ⅱ型患者内眦间距正常[7], 临床通常采用W指数鉴别Ⅰ型和Ⅱ型(W指数≥1.95为Ⅰ型, W指数 < 1.95为Ⅱ型)[8]。Ⅲ型除了具有Ⅰ型表型外，还常伴有肌肉骨胳系统异常，如上肢骨胳肌肉发育不良或上臂畸形等。Ⅳ型除了具有Ⅱ型表型外，还伴有先天性巨结肠病(HD)[9]或慢性假性肠梗阻[10]。
迄今为止，临床研究[11]已报道6个基因与WS相关，分别为SOX10、SNAI2、PAX3、MITF、EDNRB和EDN3。其中, MITF基因(NM_000 248.4)全称为小眼畸形相关转录因子，含有9个高度保守的外显子。约15%的WS Ⅱ型由MITF基因突变引起[11], 这些突变主要集中在MITF基因的6~9号外显子之间，对应于MITF蛋白的bHLH-Zip结构域。近年来，相关研究[12-14]发现MITF基因纯合突变还可能分别与多发性原发性黑色素瘤和WS Ⅳ型相关。因此, MITF基因的基因型和表型异质性高，有待进一步探索。本课题组前期收集到1例疑似WS家系成员样本，并拟用遗传性疾病常用检查手段探寻该家系遗传性病因，旨在通过遗传咨询及婚育指导实现耳聋的一级预防。
1. 资料与方法
1.1 病例资料
本研究纳入WS家系由江苏省泰州市人民医院耳鼻咽喉-头颈外科门诊招募，共三代5名家系成员(汉族)，其中患者3名(Ⅲ-1、Ⅱ-2、Ⅰ-2)，正常家系成员2名(Ⅱ-1和Ⅰ-1)。征得家系成员同意并签署知情同意书(未成年人由其法定监护人代理)后，研究人员对该家系成员进行详细病史询问及体格检查，绘制家系图，采集静脉全血样本。本研究获得泰州市人民医院伦理委员会审核批准，符合《赫尔辛基宣言》。
详细询问家系成员病史，排除外伤、中耳炎、耳毒性药物等因素导致的耳聋或者伴有其他特殊临床表型的综合征性遗传性耳聋，如Pendred综合征、Alport综合征、Usher综合征等。对所有家系成员进行耳科、眼科、毛发、皮肤色素、腹部、肌肉骨骼和四肢关节等全面体格检查，并行智力评估。采用听力学检查方法评估听力损伤程度，包括电测听、声导抗、耳声发射、多重听觉稳态诱发反应测验等。采用影像学检查方法如内耳核磁共振(MRI)评估家系成员是否有内耳畸形，同时特别关注毛发、虹膜及皮肤色素的变化，以及与WS相关的其他发育缺陷(如内眦外移、肢体畸形、胃肠道症状等)。测量相关数据，计算并比较家系成员的W指数[8]。W指数计算方法: 测量内眦间距(A)、双瞳间距(B)、外眦间距(C), W指数=(2A-0.211 9C-3.909)/C +(2A-0.247 9B-3.909)/B+A/B, 其中W指数≥1.95表示内眦外移。本研究涉及到的全部检查均在江苏省泰州市人民医院相应科室中由专科医生完成。
1.2 方法
1.2.1 采集静脉血抽提DNA
抽取家系成员外周静脉血2 mL, 采用天根生化科技(北京)有限公司生产的离心柱型血液全基因组DNA抽提试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit: DP318-03)提取基因组DNA, 使用核酸检测仪(Thermo NANODROP 2000)对DNA原液进行定量和纯度分析, -20 ℃保存备用。
1.2.2 大常见耳聋基因全序列筛查
GJB2、SLC26A4、MT-RNR1基因引物序列及扩增条件参考文献[15]。
1.2.3 WS相关候选基因全序列筛查
PAX3、MITF、SNAI2、EDN3、EDNRB和SOX10基因扩增引物参考相关研究[5]。所有PCR反应均在ABI2720热循环仪上完成，上述基因的第1轮和第2轮PCR扩增条件相同，即95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸35 s, 变性、退火和延伸3个步骤重复35个循环，循环结束后72 ℃延伸5 min, PCR产物于4 ℃保存。以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。将通过凝胶电泳鉴定合格的巢式PCR产物送测序公司进行双向测序，并采用Sequencher 5.4.6软件对测序结果进行分析。
1.2.4 家系内验证
利用家系成员样本对可疑突变进行进一步验证，以寻找基因型-表型共分离位点。
1.2.5 评估可疑突变可能的致病效应
利用Exome Variant Server、ExAC Browser、Mutation Taster、Polyphen-2、PROVEAN(阈值< 1.3)和SIFT(阈值< 0.05)等软件评估可疑错义突变位点进行致病性预测。
1.2.6 遗传咨询和婚育指导
WS主要为常染色体显性遗传，找到该家系遗传学病因后，根据孟德尔遗传定律，对该家系成员进行遗传咨询和婚育指导。
2. 结果
2.1 临床结果
该家系所有成员无慢性中耳炎、耳外伤等病史和耳毒性药物使用史。先证者(Ⅲ-1)表现为双侧极重度感音神经性聋、日益增多的面部暗褐色斑点和偶发便秘。先证者母亲(Ⅱ-2)表现为右侧极重度感音神经性聋、早白发、偶发便秘和面部、全身大量暗褐色斑点。先证者外婆(Ⅰ-2)表现为双侧极重度感音神经性聋、双侧虹膜异色、早白发、面部及全身大量暗褐色斑点、肠道功能紊乱。先证者已适龄行右侧人工耳蜗植入，日常生活中交流基本正常。先证者、先证者母亲及先证者外婆的W指数均 < 1.95, 视力和智力正常，无其他系统异常。见图 1、2。
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图 2 色素异常表型A: Ⅰ-2面部斑点; B: Ⅱ-2面部斑点; C: Ⅲ-1面部斑点; D: Ⅱ-2右手斑点; E: Ⅰ-2双手斑点; F: Ⅰ-2双腿斑点; G: Ⅱ-2早白发; H: Ⅰ-2早白发; I: Ⅰ-2虹膜异色。2.2 突变分析
3大常见耳聋基因GJB2、SLC26A4、MT-RNR1全序列筛查未见致病突变。WS相关候选基因PAX3、MITF、SNAI2、EDN3、EDNRB、SOX10全序列筛查发现MITF基因第8个外显子发生杂合突变c.C763T(p.R255X), 见图 3。该突变第763编码碱基C变为T, 导致第255个编码精氨酸的密码子变成终止密码子, MITF蛋白于255位点终止编码。家系内成员样本验证发现，该突变在家系内呈基因型-表型共分离，即患病的先证者(Ⅲ-1)、先证者母亲(Ⅱ-2)及先证者外婆(Ⅰ-2)均携带该突变，而未患病的家系成员则未携带。
3. 讨论
本研究筛查所发现MITF基因截短突变p.R255X为既往研究[16]已报道的突变。该研究[16]报道，患病家系成员Ⅱ-7表现为双侧完全虹膜异色、左耳中度感音神经性聋、右耳重度感音神经性聋以及面部、躯干、四肢大量雀斑, Ⅲ-21表现为双眼部分虹膜异色、左耳重度感音神经性聋以及面部、躯干、四肢大量棕色雀斑, Ⅳ-15表现为双眼蓝色虹膜、双耳重度感音神经性聋，而面部、躯干和四肢未见雀斑。尽管该家系内患病成员基因型一致，但表型却不尽相同。CHEN H等[17]报道的p.R255X突变相关WS Ⅱ型家系中, Ⅳ-16仅表现为单眼部分虹膜异色; Ⅳ-15表现为先天性极重度感音神经性聋及单眼部分虹膜异色; Ⅲ-20除了左耳中度感音神经性耳聋和面部、肢体棕褐色雀斑以外，还在10岁后逐渐出现单侧部分虹膜异色; Ⅱ-12、Ⅱ-3、Ⅱ-7及Ⅲ-10均在30岁前出现白发和面部、肢体雀斑; Ⅰ-2表现为早白发、面部雀斑。该家系同样体现出该突变表型的异质性极大。本研究家系内患者的表型各异，更加证实了既往研究提出的MITF基因突变表型异质性大的研究结论。
人类MITF基因定位于3p12~p14区间[18-19], 编码螺旋-环-螺旋碱性亮氨酸拉链结构的转录因子[20], 通过bHLH-Zi结构域从而形成同源或异源二聚体，与DNA结合进而参与多种生长发育过程的调控，尤其是黑色素细胞的存活、增殖和分化。MITF基因在神经嵴来源的黑素细胞和视网膜色素上皮细胞的发育中起关键作用[21-23], 其构建了调节黑素细胞发育的转录因子和信号通路之间的联系，包括PAX3和SOX10[24-25]。因此，黑色素细胞缺乏将会影响皮肤、头发、眼睛的色素形成以及耳蜗的听觉功能。本研究发现，该家系MITF基因第8个外显子杂合突变c.C763T(p.R255X), 使编码精氨酸密码子变成终止密码子，蛋白编码提前终止。MITF蛋白单倍体剂量不足使其与DNA结合数量减少，从而转录激活色素基因能力下降，导致耳聋、早白发、色素斑点等色素异常临床表型[26-28], 因此，该突变致病机制很可能与单倍体剂量不足相关。
本研究利用Sanger测序对6个WS候选基因(PAX3、MITF、SNAI2、EDN3、EDNRB和SOX10)进行全序列筛查，需要扩增的片段只有39个, 2~3 d便可以出具结果，相对于二代测序来说，其准确、省时、经济。因此，对于具有典型WS表型的家系来说，对候选基因进行一代测序筛查是性价比最高的首选策略。
WS为常染色体显性遗传，患者后代有50%概率患病，因此明确患者家系的遗传学病因将为该家系的产前诊断提供理论依据。本研究筛查发现, MITF基因p.R255X在家系中呈基因型-表型共分离，结合既往研究中对该位点致病性的报道分析，该突变很可能为本研究该家系遗传性致病因素。给予遗传咨询及婚育指导，应用羊水穿刺、无创产前诊断及胚胎植入前诊断等技术，可以避免该家系后代因为该位点致聋，从而实现耳聋的一级预防。
综上所述, MITF基因p.R255X截短突变很可能为本研究WS家系的遗传性致病因素。遗传咨询、婚育指导和羊水穿刺、无创产前诊断及胚胎植入前诊断等技术的应用，可以实现该位点所致耳聋的一级预防。
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图 2 色素异常表型
A: Ⅰ-2面部斑点; B: Ⅱ-2面部斑点; C: Ⅲ-1面部斑点; D: Ⅱ-2右手斑点; E: Ⅰ-2双手斑点; F: Ⅰ-2双腿斑点; G: Ⅱ-2早白发; H: Ⅰ-2早白发; I: Ⅰ-2虹膜异色。
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