Mechanism of Dengzhan Shengmai capsule in treating coronary heart disease based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:目的
基于网络药理学结合分子对接技术探讨灯盏生脉胶囊(DZSM)治疗冠心病(CHD)的潜在作用靶点及机制。
方法采用TCMSP和ETCM数据库检索DZSM的化学成分; 采用Swiss ADME数据库进行活性成分筛选, Swiss Target Prediction数据库获取活性成分的潜在靶点。检索GeneCards和DisGeNET数据库获取CHD靶点, 构建"DZSM-活性成分-CHD靶点"网络。对关键活性成分和核心靶点进行分子对接, 验证结合特性。于DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。采用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的小鼠巨噬细胞系(RAW264.7细胞)模型体外验证野黄芩苷对CHD的治疗作用。采用Griess反应测定细胞上清液中一氧化氮(NO)生成量。采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)表达水平; 采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测AKT蛋白表达和磷酸化水平。
结果共获得DZSM的56个活性化合物, 通过作用于136个靶点调控CHD进展。其中山奈酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、野黄芩素、6-羟基山奈酚、野黄芩苷、对壬基酚、麦冬皂苷D和人参皂苷Rb1能够调控共113个CHD靶点。AKT1、SRC、PPARG、EGFR、ESR1、PTGS2、SIRT1、MAPK1、MMP9和PPARA基因为DZSM治疗CHD的核心靶点。分子对接结果显示, 关键活性成分与核心靶点具有良好的结合特性。体外实验结果表明, 野黄芩苷可减少巨噬细胞一氧化氮生成, 增加AKT mRNA、AKT蛋白表达和磷酸化水平(P < 0.05)。KEGG富集分析显示, DZSM主要通过调控癌症通路、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、松弛素信号通路等途径治疗CHD。
结论DZSM通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗CHD的作用。
Abstract:ObjectiveTo explore the potential target and mechanism of Dengzhan Shengmai capsule (DZSM) in the treatment of coronary heart disease (CHD) based on network pharmacology and molecular docking technology.
MethodsTCMSP and ETCM databases were employed to search the chemical components of DZSM. Swiss ADME database was used to screen active ingredients, and Swiss Target Prediction database was used to obtain potential targets of active ingredients. The CHD target was obtained by searching GeneCards and DisGeNET databases, and the DZSM-active ingredient-CHD target network was constructed. Molecular docking of key active ingredients and core targets was performed to verify binding properties. Gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) enrichment analysis were performed in the DAVID database. A mouse macrophage cell line (RAW264.7 cells) model induced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) was used to test the therapeutic effect of scutellarin on CHD in vitro. The production of nitric oxide (NO) in cell supernatant was measured by Griess reaction. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression level of serine/threonine kinase (AKT); The expression and phosphorylation of AKT protein were detected by Western Blot.
ResultsA total of 56 active compounds of DZSM were obtained to regulate CHD progression by acting on 136 targets. Among them, kaempferol, quercetin, luteolin, apigenin, scutellarein, 6-hydroxykaempferol, scutellarin, nonylphenol, Ophiopogonin D, and Ginsenoside Rb1 could regulate 113 CHD targets. AKT1, SRC, PPARG, EGFR, ESR1, PTGS2, SIRT1, MAPK1, MMP9 and PPARA genes were the core targets of DZSM therapy for CHD. Molecular docking showed that the key active ingredients and core targets had good binding properties. The results of in vitro experiments showed that scutellarin could reduce the production of nitric oxide and increase the level of AKT, protein expression and phosphorylation in macrophages (P < 0.05). KEGG enrichment analysis showed that DZSM treated CHD mainly by regulating cancer pathways, endocrine resistance, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, fluid shear stress and atherosclerosis, lipid and atherosclerosis, and relaxin signaling pathway.
ConclusionDZSM plays a role in the treatment of CHD through multi-component, multi-target and multi-pathway.
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冠心病(CHD)是最常见的心脏病之一[1]。灯盏生脉胶囊(DZSM)是临床上常用的心血管疾病药物，由灯盏细辛、麦冬、人参和五味子组成。中医理论[2]认为, DZSM具有补气养阴、活血通络的功效, DZSM联合常规西药治疗可减轻CHD患者炎症反应，改善血脂、血压、心率及心功能。现代药理学研究[3-6]表明，灯盏细辛中的酚酸及黄酮类化合物、麦冬的甾体皂苷和多糖、人参皂苷、五味子中木脂素类成分具有抗缺血、抗心律失常、抗血小板、抗炎、抗氧化以及改善微循环的作用。但DZSM治疗CHD的具体活性成分和作用机制尚未完全阐明。网络药理学基于多种权威数据库的整合，能够对中药的复杂作用机制进行多成分、多靶点、多途径的多维网络分析，具有整体性和系统性。本研究采用网络药理学方法寻找DZSM的活性成分，探索其作用于CHD的潜在靶点，以期为DZSM的临床应用提供分子生物学基础及理论依据。
1. 方法
1.1 DZSM中活性化合物获取与筛选
于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和中医药百科全书(ETCM)数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/), 在线检索灯盏细辛、麦冬、人参和五味子共4味中药所含的全部化学成分。利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取所有化学成分的SMILES信息，将其导入Swiss ADME数据库(http://www.swissadme.ch/), 进行药代动力学属性预测; 筛选肠胃吸收(GI absortion)为“High”, 且类药性(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)结果中有2项及以上为“Yes”的化合物，作为DZSM的活性化合物。
1.2 DZSM活性化合物的靶点预测
Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)能够基于化合物的2D和3D结构来预测化合物的作用靶标。在Swiss Target Prediction数据库中输入活性化合物的SMILES信息，选择种属Homo sapiens, 进行靶点预测。设置Probability≥0.4, 获取DZSM活性化合物的潜在靶点。此外经PubMed和中国知网数据库进行文献检索，补充已报道的DZSM活性化合物及其靶点。
1.3 CHD靶点获取
DisGeNET(https://www.disgenet.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)收集了大量人类疾病相关的基因与突变位点信息，以“coronary heart disease”(CHD)作为关键词，在DisGeNET和GeneCards中检索CHD的靶基因，整合并去重，获得CHD相关靶点。
1.4 构建“DZSM-活性成分-CHD靶点”的网络图
通过对比DZSM活性化合物的潜在靶点与CHD的靶点，筛选二者的重合靶点，即为DZSM治疗CHD的作用靶点。运用Cytoscape 3.7.2软件构建“DZSM-活性成分-CHD靶点”的网络图。选取靶点数最多的前10个化合物，进一步使用Cytoscape3.7.2软件进行可视化。
1.5 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络构建
String数据库(https://cn.string-db.org/)是一个搜寻蛋白之间相互作用的数据库。将DZSM活性化合物和CHD的共同靶点导入String数据库，设定Confidence Score>0.7, 生成PPI网络。将此PPI网络导入Cytoscape 3.7.2软件中进行可视化，并进行网络拓扑分析，得到网络的“中介中心性(BC)”“接近中心性(CC)”“节点度值(Degree)”和“邻域连通性(NC)”等参数值。其中，Degree代表节点在网络中的连接度, Degree越大，代表该节点在网络中的地位越重要。根据Degree设置节点颜色及大小，选取Degree前10位的靶点作为DZSM调节CHD的核心靶点。
1.6 分子对接
从RCSB PDB蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)中查找蛋白结构，使用Discovery Studio软件对蛋白去水、补充氨基酸残基、加氢，得到可用于对接的蛋白三维立体结构。在PubChem数据库中下载化合物结构，使用Discovery Studio进行加氢、产生三维结构、生成异构体处理，得到可用于对接的配体分子。获取PDB报道的位点作为蛋白的表面活性口袋，使用LibDock模块进行分子对接。以对接得分(Libdock Score)作为评判标准，评价受体-配体间的相互作用，选择Libdock Score>110的对接结果进行可视化。
1.7 基因本体(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析
DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)是一个多功能的生物信息数据库，整合了生物学数据和分析工具，能够对大规模的基因或蛋白列表进行聚类分析和生物功能注释。应用DAVID数据库对DZSM治疗CHD的靶点进行GO和KEGG富集分析，选取P值前5位的分子功能(BP)、细胞组分(CC)和生物过程(MF)解读核心功能，选取P值前10位的信号通路作为核心通路，经SangerBox[7]平台进行可视化。
1.8 细胞培养及处理
小鼠巨噬细胞系(RAW264.7细胞)购自中国医学科学院细胞库，以DMEM完全培养基置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，以每孔2×106个细胞接种到6孔培养板。细胞分为5组: 空白组(等体积DMSO)、模型组(等体积DMSO)、野黄芩苷(源叶生物, B21478)低剂量组(20 μmol/L)、野黄芩苷中剂量组(40 μmol/L)、野黄芩苷高剂量组(80 μmol/L)。各组分别加入相应药物后，孵育细胞2 h; 模型组和野黄芩苷组加入氧化型低密度脂蛋白(源叶生物, S24879) (ox-LDL, 80 μg/mL)诱导24 h。
1.9 一氧化氮(NO)水平测定及基因表达水平检测
收集细胞培养上清液，使用Griess试剂盒(碧云天，S0021S)检测NO水平。收集细胞沉淀，采用TransZol Up Plus RNA提取试剂盒(全式金, ER501)提取细胞的总核糖核酸(RNA), 使用反转录试剂盒(全式金, AT341-02)获得互补脱氧核糖核酸(cDNA)。使用Top Green qPCR SuperMix试剂盒(全式金, AQ131-02)进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析。以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct法计算AKT的信使RNA(mRNA)相对表达。引物序列见表 1。
表 1 qRT-PCR引物序列基因 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) AKT GGACTACTTGCACTCCGAGAAG CATAGTGGCACCGTCCTTGATC GAPDH GTGGGAATGGGTCAGAAGGA CTTCTCCATGTCGTCCCAGT AKT: 丝氨酸/苏氨酸激酶。 1.10 采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot) 检测蛋白表达水平
提取RAW264.7巨噬细胞总蛋白。配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，加入三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸电泳缓冲液，进行电泳后，转移至聚偏氟乙烯膜(Millipore, IPVH00010)。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后, 4 ℃过夜孵育AKT (CST, 4691T)、p-AKT (CST, 4060T)和GAPDH(CST, 5174S)一抗; 室温孵育生物素化抗兔IgG(H+L)抗体(Seracare, 5260-0043)2 h及过氧化物酶标记的链霉亲和素抗体(Seracare, 5200-0029) 1 h。使用增强化学发光液(翊圣, 36208ES60)和化学发光成像仪(上海天能生命科学有限公司, 5200)显影成像，应用ImageJ软件对目的蛋白和内参蛋白条带进行灰度分析。
1.11 统计学分析
使用GraphPad Prim 9.0软件分析数据，数据表示为(x±s)。2组间数据比较采用Student′s t-test法进行分析，多组间数据比较采用单因素方差分析。
2. 结果
2.1 DZSM活性化合物及其潜在靶点
通过TCMSP和ETCM数据库检索获取DZSM所含的全部化合物，共得到灯盏细辛60个化合物，麦冬51个化合物，人参316个化合物，五味子210个化合物。根据Swiss ADME数据库预测的口服生物利用度和类药性结果，并根据Swiss Target Prediction数据库预测所得的化合物靶点信息，共筛选得到44个活性化合物具有146个高置信度潜在靶点。野黄芩苷具有抗动脉粥样硬化作用[8]; 麦冬中齐墩果酸减轻血管平滑肌细胞氧化损伤[9], 麦冬皂苷D缓解心肌损伤[10]; 人参皂苷Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rg3、Rg5和Rk1在心血管疾病中发挥抗炎、抗氧化作用[11-16]; 五味子醇甲减轻心肌细胞炎性反应和凋亡损伤[17-18], 而五味子乙素能够减小心肌梗死范围[19]。虽然这些化合物小于筛选条件，但鉴于其明确的药理作用，故将野黄芩苷、齐墩果酸、麦冬皂苷D、人参皂苷Rb1、Rb2、Re、Rg1、Rg3、Rg5、Rk1、五味子醇甲、五味子乙素共12个活性成分纳入，见表 2。
表 2 DZSM活性化合物英文名 中文名 CAS号 植物 2, 6-Dimethoxybenzoic acid 2, 6-二甲氧基苯甲酸 1466-76-8 灯盏细辛 6-Hydroxykaempferol 6-羟基山奈酚 4324-55-4 灯盏细辛 Apigenin 芹菜素 520-36-5 灯盏细辛 Baicalein 黄芩素 491-67-8 灯盏细辛 Caffeic acid 咖啡酸 331-39-5 灯盏细辛 Catechol 邻苯二酚 120-80-9 灯盏细辛 Cedar acid 丁香酸 530-57-4 灯盏细辛 Cinnamic Acid 肉桂酸(反式) 621-82-9 灯盏细辛 Esculetin 秦皮乙素 305-01-1 灯盏细辛 Ferulic acid 阿魏酸 1135-24-6 灯盏细辛 Formononetin 芒柄花黄素 485-72-3 灯盏细辛 Gallic acid 没食子酸 149-91-7 灯盏细辛 Isoliquiritigenin 异甘草素 961-29-5 灯盏细辛 Isoscopoletin 异东莨菪内酯 776-86-3 灯盏细辛 Kaempferol 山奈酚 520-18-3 灯盏细辛、人参 Luteolin 木犀草素 491-70-3 灯盏细辛 Naringenin 柚皮素 480-41-1 灯盏细辛 p-Coumaric acid 对香豆酸 501-98-4 灯盏细辛 p-Hydroxybenzoic acid 对羟基苯甲酸 99-96-7 灯盏细辛 Protocatechuic acid 原儿茶酸 99-50-3 灯盏细辛、五味子 Quercetin 槲皮素 117-39-5 灯盏细辛 Scopoletol 东莨菪内酯 92-61-5 灯盏细辛 Scutellarin 野黄芩苷 27740-01-8 灯盏细辛 Scutellarein 野黄芩素 529-53-3 灯盏细辛 N-p-Coumaroyltyramine N-对反式香豆酰酪胺 36417-86-4 麦冬 Oleanolic Acid 齐墩果酸 508-02-1 麦冬 Ophiopogonin D 麦冬皂苷D 945619-74-9 麦冬 9-Hexadecenoic acid 9-十六烯酸 10030-73-6 人参 Cedrol 雪松醇 77-53-2 人参 Ginsenoside Rb1 人参皂苷Rb1 41753-43-9 人参 Ginsenoside Rb2 人参皂苷Rb2 11021-13-9 人参 Ginsenoside Re 人参皂苷Re 51542-56-4 人参 Ginsenoside Rg1 人参皂苷Rg1 22427-39-0 人参 Ginsenoside Rg3 人参皂苷Rg3 38243-03-7 人参 Ginsenoside Rg5 人参皂苷Rg5 186763-78-0 人参 Ginsenoside Rk1 人参皂苷Rk1 494753-69-4 人参 Malvic acid — 503-05-9 人参 Nepetin 泽兰黄酮 520-11-6 人参 Niacin 烟酸 59-67-6 人参 Palmitic acid 棕榈酸 57-10-3 人参 Pentadecylic acid 十五烷酸 1002-84-2 人参 Sallcylic acid 水杨酸 69-72-7 人参 Succinic Acid 琥珀酸 110-15-6 人参 Vitamin H 吡哆素 22879-79-4 人参 Tridecanoic acid 十三烷酸 638-53-9 人参 Deoxygomisin A 戈米辛N 69176-52-9 五味子 Gomisin L1 R(+)-戈米辛M1 82467-50-3 五味子 Gomisin L2 — 82425-44-3 五味子 Longispinogenin — 465-94-1 五味子 Nonylphenol 对壬基酚 104-40-5 五味子 Nordihydroguaiaretic Acid 马索罗酚 27686-84-6 五味子 Psilostachyin A — 3533-47-9 五味子 Schisandrin 五味子醇甲 7432-28-2 五味子 Schisandrin B 五味子乙素 61281-37-6 五味子 Schisanhenol B 五味子酚乙 102681-52-7 五味子 Schizandrin C 五味子丙素 61301-33-5 五味子 2.2 “DZSM-活性成分-CHD靶点”网络
应用GeneCards和DisGeNET平台检索CHD靶点，整合后共得到疾病靶点8 923个。获取DZSM活性化合物的潜在靶点与CHD靶点交集，并补充文献检索获得的12个化合物及对应的靶点。运用Cytoscape 3.7.2软件构建“DZSM-活性成分-CHD靶点”网络图(图 1)，可见共56个活性化合物通过调控136个靶点发挥治疗CHD的作用。从化合物的角度分析(图 2), 作用靶点数最多的前10个活性化合物分别是山奈酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、野黄芩素、6-羟基山奈酚、野黄芩苷、对壬基酚、麦冬皂苷D和人参皂苷Rb1，能够调控共113个CHD靶点。
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图 1 “DZSM-活性成分-CHD靶点”网络图深蓝色节点为中药，紫色节点为灯盏细辛活性化合物，黄色节点为人参活性化合物，粉色节点为五味子活性化合物，浅蓝色节点为麦冬活性化合物，绿色节点为靶点，红色字体为多味中药共有成分。2.3 PPI网络
经String数据库构建DZSM治疗CHD靶点的PPI网络，经Cytoscape软件可视化(图 3), 具有135个节点, 1 067种作用关联，平均Degree值为15.8, P值< 1.0e-16。提取PPI网络中Degree排前10位的核心靶点，如表 3所示, DZSM治疗CHD的机制与AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)、原癌基因SRC(SRC)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、表皮生长因子受体(EGFR)、雌激素受体1(ESR1)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)、沉默信息调节因子1(SIRT1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARA)等基因相关。
表 3 DZSM治疗CHD的核心靶点基因名 节点度值 中介中心性 接近中心性 邻域连通性 AKT1 78 0.157 674 9 0.683 673 5 21.54 SRC 56 0.054 896 3 0.598 214 3 25.89 PPARG 55 0.071 025 9 0.595 555 6 23.16 EGFR 54 0.046 872 0 0.590 308 4 25.48 ESR1 52 0.083 235 2 0.585 152 8 23.73 PTGS2 52 0.053 084 9 0.590 308 4 25.54 SIRT1 50 0.043 275 1 0.580 086 6 25.84 MAPK1 44 0.034 526 5 0.558 333 3 26.55 MMP9 43 0.038 211 2 0.565 400 8 28.19 PPARA 40 0.036 245 2 0.556 016 6 24.53 AKT1: AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1; SRC: 原癌基因SRC; PPARG: 过氧化物酶体增殖物激活受体γ; EGFR: 表皮生长因子受体; ESR1: 雌激素受体1; PTGS2: 前列腺素内过氧化物合成酶2; SIRT1: 沉默信息调节因子1; MAPK1: 丝裂原活化蛋白激酶1; MMP9: 基质金属蛋白酶9; PPARA: 过氧化物酶体增殖物激活受体α。 2.4 分子对接验证DZSM治疗CHD的靶点
将图 2网络中的10个活性成分与PPI网络中度值最大的5个核心靶蛋白AKT、SRC、PPARG、EGFR和ESR1进行分子对接验证，并进行对接评分，验证结合特性。如图 4所示, 8个活性成分与5个关键靶蛋白对接良好，其中野黄芩苷与5个关键靶蛋白对接的Libdock Score均大于130; 野黄芩苷与AKT对接得分最高(164.409), 其主要通过范德华力、氢键、Pi-Pi堆叠等相互作用结合到目标蛋白上。分子对接结果提示，预测所得的DZSM活性成分，尤其是野黄芩苷与CHD靶点具有良好的结合特性。
2.5 体外实验验证野黄芩苷治疗CHD的靶点
根据《中国药典》，野黄芩苷是DZSM的主要质控成分，故依据分子对接结果，选择其对接得分最高的靶点AKT进行体外实验验证。与空白组相比, ox-LDL诱导的模型组RAW264.7细胞炎症介质NO水平升高(P < 0.01), 而野黄芩苷中、高剂量给药后降低了NO水平，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。qRT-PCR和Western Blot结果显示，与空白组相比，模型组AKT mRNA及其蛋白表达和磷酸化水平降低，差异有统计学意义(P < 0.01); 与模型组比较，野黄芩苷增加了AKT mRNA及其蛋白表达和磷酸化表达，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01), 见图 5。结果表明，野黄芩苷通过激活AKT信号发挥抗巨噬细胞炎症作用。
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图 5 野黄芩苷体外缓解CHD的靶点验证A: NO含量; B: AKT mRNA表达; C: AKT蛋白表达; D: p-AKT蛋白表达。与模型组比较, *P < 0.05, **P < 0.01; 与空白组比较, ## P < 0.01。2.6 DZSM治疗CHD靶点的GO富集分析
使用DAVID数据库对DZSM治疗CHD的靶点进行GO富集分析，结果如图 6所示, DZSM治疗CHD的生物学过程涉及对外源性刺激的反应、凋亡过程的负调控、肽基丝氨酸磷酸化、蛋白质磷酸化、细胞对过氧化氢的反应; 在细胞组分层面调控质膜、胞质溶胶、细胞质、大分子复合物、核; 在分子功能方面，参与蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、酶结合、ATP结合、相同的蛋白质结合。
2.7 DZSM治疗CHD靶点的KEGG通路富集分析
经DAVID数据库对DZSM治疗CHD的靶点进行KEGG通路富集分析，按P值由小到大排序，选取前10项结果进行可视化，如图 7所示，靶点显著富集在癌症途径、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、化学致癌作用-活性氧、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、松弛素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、HIF-1信号通路、前列腺癌症。
3. 讨论
DZSM在CHD的防治中取得了良好的临床效果，但其活性化学成分和潜在分子机制尚不明确。本研究采用网络药理学方法，筛选DZSM的活性成分并预测其作用靶点，构建“DZSM-活性成分-CHD靶点”网络，采用分子对接确定了DZSM关键活性成分与CHD核心靶点的结合特性，揭示DZSM治疗CHD的物质基础及潜在靶点; 对靶点进行GO和KEGG富集分析，挖掘DZSM防治CHD所调控的生物学过程及关键信号通路，进一步阐释了DZSM治疗CHD的分子机制。
本研究共获得263个DZSM化学成分，其中56个活性化合物能够作用于136个CHD的潜在靶点，而山奈酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素、野黄芩素、6-羟基山奈酚、野黄芩苷、对壬基酚、麦冬皂苷D和人参皂苷Rb1可以调控共113个CHD靶点。山奈酚[20]、木犀草素[20]、芹菜素[20]、野黄芩苷[21]、麦冬皂苷D[22]和人参皂苷Rb1[22]是DZSM的物质基础，槲皮素、野黄芩素、6-羟基山奈酚、对壬基酚在DZSM中的含量尚不明确, 6-羟基山奈酚和对壬基酚对于CHD的直接调控作用的报道较少，进一步探究其含量、药效学作用及机制或可为CHD治疗药物的研发提供新方向。
通过String数据库获得所有靶点的互作关系，其中AKT1、SRC、PPARG、EGFR、ESR1、PTGS2、SIRT1、MAPK1、MMP9和PPARA与多靶点存在联系，被视为DZSM治疗CHD的核心靶点。针对DZSM的关键活性成分和其潜在核心靶点进行分子对接，发现野黄芩苷与这些靶点的结合优于其他化合物，且野黄芩苷与AKT对接得分高达164.409分，故进一步验证野黄芩苷对AKT的体外调控作用。巨噬细胞是动脉粥样硬化病变的重要组成部分，在动脉粥样硬化早期阶段，当ox-LDL摄入量超过巨噬细胞代谢能力时，巨噬细胞泡沫化，触发炎症反应，引起斑块不稳定，促进动脉粥样硬化发展[23]。RAW264.7巨噬细胞模型被广泛用于评价化合物治疗CHD的体外药效[24-25], 故本研究建立了ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞模型[26], 用于验证野黄芩苷的作用机制。研究结果显示，野黄芩苷可以在体外激活AKT信号，抑制ox-LDL诱导的炎症介质NO产生，触发巨噬细胞抗炎反应来抑制CHD进展。
GO富集分析的结果显示，这些靶点调控的生物学过程与文献报道[10, 27-28]一致，涉及DZSM治疗CHD的生物学过程涉及对外源性刺激的反应、凋亡过程的负调控、肽基丝氨酸磷酸化、蛋白质磷酸化、细胞对过氧化氢的反应。KEGG通路富集结果显示，癌症通路会影响CHD的进展，成年癌症存活者发生心血管疾病的风险显著高于非癌症患者[29]。内分泌(胰岛素)抵抗和糖尿病已被证实是CHD的风险因素[30], 晚期糖基化终产物(AGEs)与其跨膜细胞受体RAGE相互作用，易导致内皮损伤、血管平滑肌细胞功能和血小板活性改变[31]。作用于内皮的血流产生的流体剪切应力是血管稳态的重要贡献者，对血管形态发生、血压和动脉粥样硬化起关键调节作用[32]; 而动脉粥样硬化则是CHD的主要病理机制之一，控制动脉粥样硬化也已成为目前临床上CHD的标准治疗。脂质稳态也是CHD发生发展的重要因素，低密度脂蛋白沉积于血管壁，触发炎症反应和内皮细胞破坏，导致动脉粥样硬化及斑块不稳定，最终导致心肌梗死[33]。松弛素信号可减轻局部炎症反应，减弱心脏缺血再灌注后的微血管阻塞和内皮细胞渗漏[34]。虽然EGFR是公认的肿瘤靶标，但其在CHD中参与细胞增殖、凋亡和缺血/再灌注损伤[35-36]。此外, HIF-1信号通路参与调解氧气稳态，影响侧支血管形成，调控缺血性心血管疾病如CHD和外周动脉疾病[37]。因此, DZSM可能通过调控上述信号通路发挥对CHD的治疗作用。
本研究运用网络药理学及分子对接技术，对DZSM治疗CHD的物质基础和作用机制进行了探讨。DZSM通过山奈酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素和野黄芩素、6-羟基山奈酚、野黄芩苷、对壬基酚、麦冬皂苷D和人参皂苷Rb1等多种活性成分调控内分泌、脂质稳态、炎症、流体剪切应力与动脉粥样硬化，对心血管产生保护作用。本研究为DZSM的进一步基础研究提供了导向，为临床应用提供了理论依据。
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图 1 “DZSM-活性成分-CHD靶点”网络图
深蓝色节点为中药，紫色节点为灯盏细辛活性化合物，黄色节点为人参活性化合物，粉色节点为五味子活性化合物，浅蓝色节点为麦冬活性化合物，绿色节点为靶点，红色字体为多味中药共有成分。
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图 5 野黄芩苷体外缓解CHD的靶点验证
A: NO含量; B: AKT mRNA表达; C: AKT蛋白表达; D: p-AKT蛋白表达。与模型组比较, *P < 0.05, **P < 0.01; 与空白组比较, ## P < 0.01。
表 1 qRT-PCR引物序列
基因 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) AKT GGACTACTTGCACTCCGAGAAG CATAGTGGCACCGTCCTTGATC GAPDH GTGGGAATGGGTCAGAAGGA CTTCTCCATGTCGTCCCAGT AKT: 丝氨酸/苏氨酸激酶。 
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表 2 DZSM活性化合物
英文名 中文名 CAS号 植物 2, 6-Dimethoxybenzoic acid 2, 6-二甲氧基苯甲酸 1466-76-8 灯盏细辛 6-Hydroxykaempferol 6-羟基山奈酚 4324-55-4 灯盏细辛 Apigenin 芹菜素 520-36-5 灯盏细辛 Baicalein 黄芩素 491-67-8 灯盏细辛 Caffeic acid 咖啡酸 331-39-5 灯盏细辛 Catechol 邻苯二酚 120-80-9 灯盏细辛 Cedar acid 丁香酸 530-57-4 灯盏细辛 Cinnamic Acid 肉桂酸(反式) 621-82-9 灯盏细辛 Esculetin 秦皮乙素 305-01-1 灯盏细辛 Ferulic acid 阿魏酸 1135-24-6 灯盏细辛 Formononetin 芒柄花黄素 485-72-3 灯盏细辛 Gallic acid 没食子酸 149-91-7 灯盏细辛 Isoliquiritigenin 异甘草素 961-29-5 灯盏细辛 Isoscopoletin 异东莨菪内酯 776-86-3 灯盏细辛 Kaempferol 山奈酚 520-18-3 灯盏细辛、人参 Luteolin 木犀草素 491-70-3 灯盏细辛 Naringenin 柚皮素 480-41-1 灯盏细辛 p-Coumaric acid 对香豆酸 501-98-4 灯盏细辛 p-Hydroxybenzoic acid 对羟基苯甲酸 99-96-7 灯盏细辛 Protocatechuic acid 原儿茶酸 99-50-3 灯盏细辛、五味子 Quercetin 槲皮素 117-39-5 灯盏细辛 Scopoletol 东莨菪内酯 92-61-5 灯盏细辛 Scutellarin 野黄芩苷 27740-01-8 灯盏细辛 Scutellarein 野黄芩素 529-53-3 灯盏细辛 N-p-Coumaroyltyramine N-对反式香豆酰酪胺 36417-86-4 麦冬 Oleanolic Acid 齐墩果酸 508-02-1 麦冬 Ophiopogonin D 麦冬皂苷D 945619-74-9 麦冬 9-Hexadecenoic acid 9-十六烯酸 10030-73-6 人参 Cedrol 雪松醇 77-53-2 人参 Ginsenoside Rb1 人参皂苷Rb1 41753-43-9 人参 Ginsenoside Rb2 人参皂苷Rb2 11021-13-9 人参 Ginsenoside Re 人参皂苷Re 51542-56-4 人参 Ginsenoside Rg1 人参皂苷Rg1 22427-39-0 人参 Ginsenoside Rg3 人参皂苷Rg3 38243-03-7 人参 Ginsenoside Rg5 人参皂苷Rg5 186763-78-0 人参 Ginsenoside Rk1 人参皂苷Rk1 494753-69-4 人参 Malvic acid — 503-05-9 人参 Nepetin 泽兰黄酮 520-11-6 人参 Niacin 烟酸 59-67-6 人参 Palmitic acid 棕榈酸 57-10-3 人参 Pentadecylic acid 十五烷酸 1002-84-2 人参 Sallcylic acid 水杨酸 69-72-7 人参 Succinic Acid 琥珀酸 110-15-6 人参 Vitamin H 吡哆素 22879-79-4 人参 Tridecanoic acid 十三烷酸 638-53-9 人参 Deoxygomisin A 戈米辛N 69176-52-9 五味子 Gomisin L1 R(+)-戈米辛M1 82467-50-3 五味子 Gomisin L2 — 82425-44-3 五味子 Longispinogenin — 465-94-1 五味子 Nonylphenol 对壬基酚 104-40-5 五味子 Nordihydroguaiaretic Acid 马索罗酚 27686-84-6 五味子 Psilostachyin A — 3533-47-9 五味子 Schisandrin 五味子醇甲 7432-28-2 五味子 Schisandrin B 五味子乙素 61281-37-6 五味子 Schisanhenol B 五味子酚乙 102681-52-7 五味子 Schizandrin C 五味子丙素 61301-33-5 五味子
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表 3 DZSM治疗CHD的核心靶点
基因名 节点度值 中介中心性 接近中心性 邻域连通性 AKT1 78 0.157 674 9 0.683 673 5 21.54 SRC 56 0.054 896 3 0.598 214 3 25.89 PPARG 55 0.071 025 9 0.595 555 6 23.16 EGFR 54 0.046 872 0 0.590 308 4 25.48 ESR1 52 0.083 235 2 0.585 152 8 23.73 PTGS2 52 0.053 084 9 0.590 308 4 25.54 SIRT1 50 0.043 275 1 0.580 086 6 25.84 MAPK1 44 0.034 526 5 0.558 333 3 26.55 MMP9 43 0.038 211 2 0.565 400 8 28.19 PPARA 40 0.036 245 2 0.556 016 6 24.53 AKT1: AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1; SRC: 原癌基因SRC; PPARG: 过氧化物酶体增殖物激活受体γ; EGFR: 表皮生长因子受体; ESR1: 雌激素受体1; PTGS2: 前列腺素内过氧化物合成酶2; SIRT1: 沉默信息调节因子1; MAPK1: 丝裂原活化蛋白激酶1; MMP9: 基质金属蛋白酶9; PPARA: 过氧化物酶体增殖物激活受体α。
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[1] TOMANIAK M, KATAGIRI Y, MODOLO R, et al. Vulnerable plaques and patients: state-of-the-art[J]. Eur Heart J, 2020, 41(31): 2997-3004. doi: 10.1093/eurheartj/ehaa227
[2] 陈王峰, 金萍. 灯盏生脉胶囊联合常规西药治疗冠心病稳定性心绞痛临床研究[J]. 新中医, 2023, 55(4): 40-45. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-REND202304009.htm [3] ZHAO J, LV C, WU Q L, et al. Computational systems pharmacology reveals an antiplatelet and neuroprotective mechanism of Deng-Zhan-Xi-Xin injection in the treatment of ischemic stroke[J]. Pharmacol Res, 2019, 147: 104365. doi: 10.1016/j.phrs.2019.104365
[4] CHEN M H, CHEN X J, WANG M, et al. Ophiopogon japonicus: a phytochemical, ethnomedicinal and pharmacological review[J]. J Ethnopharmacol, 2016, 181: 193-213. doi: 10.1016/j.jep.2016.01.037
[5] WANG R Y, WANG M, ZHOU J H, et al. Saponins in Chinese herbal medicine exerts protection in myocardial ischemia-reperfusion injury: possible mechanism and target analysis[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 570867.
[6] HOU R, JIN X S, GAO Y H, et al. Evaluation of the effects of Schisandra chinensis on the myocardium of rats with hyperthyroid heart disease by using velocity vector imaging combined with the estimation of p53 expression and calmodulin activity[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2020, 2020: 5263834.
[7] SHEN W T, SONG Z G, ZHONG X, et al. Sangerbox: a comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform[J]. iMeta, 2022, 1(3): e36. doi: 10.1002/imt2.36
[8] 樊华. 灯盏花中野黄芩苷对气滞血瘀型动脉粥样硬化的干预作用及机制研究[D]. 沈阳: 辽宁中医药大学, 2018. [9] 冯健. 齐墩果酸对大鼠血管平滑肌细胞中血红素氧合酶1表达的影响及其作用机制的研究[D]. 重庆: 第三军医大学, 2011. [10] HUANG X Y, WANG Y G, WANG Y, et al. Ophiopogonin D reduces myocardial ischemia-reperfusion injury via upregulating CYP2J3/EETs in rats[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 49(4): 1646-1658. doi: 10.1159/000493500
[11] YANG F, YANG M Y, LE J Q, et al. Protective effects and therapeutics of ginsenosides for improving endothelial dysfunction: from therapeutic potentials, pharmaceutical developments to clinical trials[J]. Am J Chin Med, 2022, 50(3): 749-772. doi: 10.1142/S0192415X22500318
[12] GUAN S B, XIN Y F, DING Y G, et al. Ginsenoside Rg1 protects against cardiac remodeling in heart failure via SIRT1/PINK1/parkin-mediated mitophagy[J]. Chem Biodivers, 2023, 20(2): e202200730. doi: 10.1002/cbdv.202200730
[13] LI Y N, ZHANG W H. Effect of ginsenoside Rb2 on a myocardial cell model of coronary heart disease through Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. Biol Pharm Bull, 2022, 45(1): 71-76. doi: 10.1248/bpb.b21-00525
[14] 王茹. 人参皂苷Re对缺血缺氧损伤心肌线粒体质量控制的优化及机制研究[D]. 北京: 中国中医科学院, 2022. [15] 张艺红, 刘智. 人参皂苷Rg1对冠心病大鼠的影响研究[J]. 中国临床药理学杂志, 2020, 36(2): 133-136. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-GLYZ202002010.htm [16] 郭施勉, 楚英杰. 人参皂苷Rg1对冠心病大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制研究[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2021, 19(23): 4054-4059. doi: 10.12102/j.issn.1672-1349.2021.23.008 [17] LAI Q, YUAN G Y, WANG H, et al. Exploring the protective effects of schizandrol A in acute myocardial ischemia mice by comprehensive metabolomics profiling integrated with molecular mechanism studies[J]. Acta Pharmacol Sin, 2020, 41(8): 1058-1072. doi: 10.1038/s41401-020-0377-7
[18] 杨敏, 姜兴粲, 冯海鹏, 等. 五味子醇甲对去甲肾上腺素诱导心肌肥大损伤的cT-I、cT-T、ET-1调控作用的影响[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(8): 1553-1559. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZSYX202008020.htm [19] ZHAO X Y, XIANG Y J, CAI C H, et al. Schisandrin B protects against myocardial ischemia/reperfusion injury via the PI3K/Akt pathway in rats[J]. Mol Med Rep, 2018, 17(1): 556-561.
[20] 李卓伦, 杨彦涛, 孙志, 等. 基于UHPLC-Q-Orbitrap和网络药理学的灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的机制研究[J]. 中草药, 2021, 52(12): 3501-3513. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2021.12.005 [21] 孙银芳. HPLC法测定灯盏生脉胶囊中灯盏花乙素含量的研究[J]. 新中医, 2015, 47(11): 206-208. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-REND201511098.htm [22] 李元元. 灯盏生脉药效成分体内外解析分析研究[D]. 北京: 北京协和医学院, 2022. [23] CAO H, JIA Q L, YAN L, et al. Quercetin suppresses the progression of atherosclerosis by regulating MST1-mediated autophagy in ox-LDL-induced RAW264.7 macrophage foam cells[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(23): 6093. doi: 10.3390/ijms20236093
[24] DING J, WU J, WEI H R, et al. Exploring the mechanism of hawthorn leaves against coronary heart disease using network pharmacology and molecular docking[J]. Front Cardiovasc Med, 2022, 9: 804801. doi: 10.3389/fcvm.2022.804801
[25] LI Z, CHENG Q, YU L, et al. Dan-Lou tablets reduces inflammatory response via suppression of the MyD88/p38 MAPK/NF-κB signaling pathway in RAW 264. 7 macrophages induced by ox-LDL[J]. J Ethnopharmacol, 2022, 298: 115600. doi: 10.1016/j.jep.2022.115600
[26] ZHANG Y F, DING J, WANG Y R, et al. Guanxinkang decoction attenuates the inflammation in atherosclerosis by regulating efferocytosis and MAPKs signaling pathway in LDLR-/- mice and RAW264.7 cells[J]. Front Pharmacol, 2021, 12: 731769. doi: 10.3389/fphar.2021.731769
[27] ZHU J Q, YE Q F, XU S X, et al. Shengmai injection alleviates H2O2-induced oxidative stress through activation of AKT and inhibition of ERK pathways in neonatal rat cardiomyocytes[J]. J Ethnopharmacol, 2019, 239: 111677. doi: 10.1016/j.jep.2019.01.001
[28] ZHENG Y R, TIAN C Y, FAN C L, et al. Sheng-Mai Yin exerts anti-inflammatory effects on RAW 264. 7 cells and zebrafish[J]. J Ethnopharmacol, 2021, 267: 113497. doi: 10.1016/j.jep.2020.113497
[29] FLORIDO R, DAYA N R, NDUMELE C E, et al. Cardiovascular disease risk among cancer survivors: the atherosclerosis risk in communities (ARIC) study[J]. J Am Coll Cardiol, 2022, 80(1): 22-32. doi: 10.1016/j.jacc.2022.04.042
[30] DUGANI S B, MOORTHY M V, LI C Y, et al. Association of lipid, inflammatory, and metabolic biomarkers with age at onset for incident coronary heart disease in women[J]. JAMA Cardiol, 2021, 6(4): 437-447. doi: 10.1001/jamacardio.2020.7073
[31] KOSMOPOULOS M, DREKOLIAS D, ZAVRAS P D, et al. Impact of advanced glycation end products (AGEs) signaling in coronary artery disease[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865(3): 611-619. doi: 10.1016/j.bbadis.2019.01.006
[32] JACKSON M L, BOND A R, GEORGE S J. Mechanobiology of the endothelium in vascular health and disease: in vitro shear stress models[J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2023, 37(5): 997-1010.
[33] MALEKMOHAMMAD K, BEZSONOV E E, RAFIEIAN-KOPAEI M. Role of lipid accumulation and inflammation in atherosclerosis: focus on molecular and cellular mechanisms[J]. Front Cardiovasc Med, 2021, 8: 707529.
[34] GAO X M, SU Y D, MOORE S, et al. Relaxin mitigates microvascular damage and inflammation following cardiac ischemia-reperfusion[J]. Basic Res Cardiol, 2019, 114(4): 30.
[35] LI Z, AGRAWAL V, RAMRATNAM M, et al. Cardiac sodium-dependent glucose cotransporter 1 is a novel mediator of ischaemia/reperfusion injury[J]. Cardiovasc Res, 2019, 115(11): 1646-1658.
[36] XU H, LI H Q, ZHU P X, et al. Tanshinone IIA ameliorates progression of CAD through regulating cardiac H9c2 cells proliferation and apoptosis by miR-133a-3p/EGFR axis[J]. Drug Des Devel Ther, 2020, 14: 2853-2863.
[37] SEMENZA G L. Hypoxia-inducible factors: roles in cardiovascular disease progression, prevention, and treatment[J]. Cardiovasc Res, 2023, 119(2): 371-380.
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