Effect of silencing E26 transformation-specific sequence 4 on proliferation and migration of colon cancer cells by inhibiting nuclear factor-κB signaling pathway
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摘要:目的
探讨E26转录因子变异体4(ETV4)通过核因子-κB(NF-κB)信号通路对结肠癌细胞增殖和迁移的影响机制。
方法通过用户友好的交互式癌症转录组数据分析资源(UALCAN)数据库分析ETV4在结肠正常组织和癌组织中的表达; 采用逆转录定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot检测ETV4在正常肠上皮细胞和结肠癌细胞系中的表达; 沉默SW480细胞的ETV4后, 采用qRT-PCR和Western blot检测ETV4的表达以评估转染效率; 采用菌落形成实验和Transwell实验检测沉默ETV4后对结肠癌细胞增殖和迁移的影响; 采用Western blot检测沉默ETV4后对NF-κB通路中的蛋白65(p65)和磷酸化蛋白65(p-p65)的蛋白表达的影响。
结果UALCAN数据库分析结果显示ETV4在结肠癌组织中高表达。qRT-PCR和Western blot检测显示ETV4在结肠癌细胞系SW480、Lovo、Caco-2和SW620中的表达高于正常肠上皮细胞HIEC-6, 其中SW480细胞中ETV4的表达最高,差异有统计学意义(P < 0.001)。菌落形成实验和Transwell实验结果显示,沉默ETV4后显著抑制了结肠癌细胞SW480的增殖和迁移能力(P < 0.001)。Western blot检测结果显示,沉默ETV4显著抑制细胞中p-p65蛋白的表达(P < 0.001)。
结论沉默ETV4可能抑制NF-κB信号通路的激活,进而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。
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关键词:
- E26转录因子变异体4 /
- 核因子-κB /
- 结肠癌 /
- 细胞增殖 /
- 细胞迁移
Abstract:ObjectiveTo investigate the mechanism of E26 transformation-specific sequence 4 (ETV4) affecting the proliferation and migration of colon cancer cells through the nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway.
MethodsThe expression level of ETV4 in normal colon tissues and cancer tissues was analyzed by the user-friendly interactive cancer transcriptome data analysis resource (UALCAN) database. Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot were used to detect the expression level of ETV4 in normal intestinal epithelial cells and colon cancer cell lines. After silencing ETV4 in SW480 cells, qRT-PCR and Western blot were performed to detect the expression of ETV4 to assess transfection efficiency; colony formation and Transwell assays were conducted to explore the effects of ETV4 silencing on the proliferation and migration of colon cancer cells; the Western blot was used to detect the effects of ETV4 silencing on the protein expression of protein 65 (p65) and phosphorylated protein 65 (p-p65) in the NF-κB pathway.
ResultsThe UALCAN database analysis revealed high expression of ETV4 in colon cancer tissues. The qRT-PCR and Western blot showed that ETV4 expression was significantly higher in the colon cancer cell lines SW480, Lovo, Caco-2, and SW620 than in normal intestinal epithelial cells HIEC-6, with the highest expression in SW480 cells (P < 0.001). Colony formation and Transwell assay results indicated that silencing ETV4 significantly inhibited the proliferation and migration of colon cancer SW480 cells (P < 0.001). Western blot results showed that silencing ETV4 significantly inhibited the expression of p-p65 protein in the cells (P < 0.001).
ConclusionSilencing ETV4 may inhibit the activation of the NF-κB signaling pathway, thereby inhibiting the proliferation and migration of colon cancer cells.
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乳腺癌已成为导致女性死亡的第2位原因,但其确切的致病机制仍不清楚[1]。目前,临床上主要采用手术、放化疗等手段治疗乳腺癌,能在一定程度上控制病情。部分患者因早期症状不明显,确诊时已是中晚期癌,从而错过最佳治疗时机。因此,寻找一种有效的检测手段对控制乳腺癌的病情有很大帮助[2-3]。在正常生理状态下,人体内辅助性T细胞17(Th17)与调节性T细胞(Treg)之间维持着动态平衡,而某些疾病状态如肿瘤可引发病理性免疫应答,导致免疫失调[4]。铁蛋白(SF)是一种在乳腺癌细胞中呈高表达的蛋白,对乳腺癌细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用[5]。也有研究[6]发现,微小核糖核酸(miR)和基质金属蛋白酶均在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用,但目前微小核糖核酸-145(miR-145)、微小核糖核酸-132(miR-132)在乳腺癌中的表达及其与临床病理的相关性尚不完全明确。本研究选取92例乳腺癌患者进行回顾性研究,为临床诊治乳腺癌提供参考依据,现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2022年1月—2023年12月92例乳腺癌患者作为研究组,临床分期为Ⅰ~Ⅱ期35例,Ⅲ~Ⅳ期57例; 肿瘤直径>2 cm、≤2 cm分别为43、49例; 年龄31~62岁,平均(44.19±2.57)岁; 存在淋巴结转移51例,无淋巴结转移41例; 体质量指数(BMI)18~25 kg/m2,平均(22.03±0.25) kg/m2; 肿瘤分化程度为中低分化61例,高分化31例。另选取同期乳腺良性疾病(如乳腺炎)患者105例为对照组,年龄31~63岁,平均(44.23±2.61)岁; BMI为18~25 kg/m2, 平均(21.96±0.27) kg/m2。纳入标准: ①依据《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2015版)》[7]诊断为乳腺癌者; ②行影像学及临床病理检查确诊为乳腺癌者; ③能够积极配合完成实验室检查者; ④年龄超过30周岁者。排除标准: ①存在严重肝肾等脏器损伤、免疫系统异常、全身性感染及凝血功能异常者; ②患有库欣综合征和甲状腺机能亢进等内分泌系统疾病者; ③伴有其他严重恶性肿瘤者; ④伴有精神异常者。本研究已获得医院伦理委员会批准。
1.2 方法
资料收集: 在医院电子病历系统中收集所选患者临床资料,包括临床分期、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤直径、BMI及是否存在淋巴结转移等。检测研究组与对照组患者Th17与Treg的比值(Th17/Treg)以及SF水平、miR-145和miR-132表达水平,收集所选患者空腹静脉血6 mL, 取其中2 mL, 采用济南中科瑞正生物科技有限公司生产的流式细胞仪(型号: CasCyte-S7型)检测Th17、Treg水平,并计算Th17/Treg; 取剩余4 mL, 3 500 r/min离心10 min收集血清,取其中2 mL血清采用Trizol法提取总核糖核酸(RNA), 采用北京宝日医生物技术有限公司提供的Takara试剂盒反转录得到互补脱氧核糖核酸(cDNA)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(ABI Prizm7300序列检测系统)进行扩增,引物由广州锐博生物科技有限公司完成, miR-145上游、下游引物分别为5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′、5′-CC ATGACCTCAAGAACAGTATTTCC-3′; miR-132上游、下游引物分别为5′-GCCGATAACAGTCTACAG C-3′、5′-CAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。反应体系: 共20 μL, 包括cDNA模板2.0 μL、上下游引物各1.0 μL、12.5 μL GreenPremixExTaqTM Ⅱ、双蒸馏水8.5 μL; 反应条件: 循环40次, 95 ℃预变性、变性,分别反应30、5 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸15 s。miR-145、miR-132相对表达量用2-ΔΔCt法计算; 取剩余2 mL血清,应用全自动化学发光免疫分析仪(武汉友芝友医疗科技股份有限公司,型号: YZY-CIP-C100)检测血清SF水平。
1.3 观察指标
分析并比较2组患者Th17/Treg以及SF、miR-145和miR-132水平变化。比较研究组不同病理参数患者Th17/Treg以及SF、miR-145和miR-132水平。以对照组作为阴性病例,以研究组作为阳性病例,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析Th17/Treg、SF、miR-145、miR-132对乳腺癌的诊断价值。
1.4 统计学方法
所有数据均采用SPSS 26.0软件进行分析,计量资料(经S-W法检验,均符合正态分布)以(x±s)表示,比较行t检验,计数资料以[n(%)]表示,行χ2检验,使用MedCalc软件11.4版绘制ROC曲线。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组Th17/Treg以及SF、miR-145和miR-132水平变化
与对照组比较,研究组外周血Th17/Treg、血清SF水平均更高,血清miR-145、miR-132表达水平更低,差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 2组Th17/Treg、SF水平以及miR-145和miR-132表达水平比较(x±s)组别 n Th17/Treg SF/(ng/mL) miR-145 miR-132 对照组 105 0.41±0.05 43.88±8.15 1.03±0.09 1.02±0.08 研究组 92 0.49±0.06* 96.72±6.59* 0.47±0.06* 0.39±0.04* Th17/Treg: 辅助性T细胞17与调节性T细胞的比值; SF: 铁蛋白; miR-145: 微小核糖核酸-145; miR-132: 微小核糖核酸-132。与对照组比较, * P < 0.05。 2.2 研究组不同病理参数患者Th17/Treg以及SF、miR-145、miR-132水平变化
与肿瘤直径≤2 cm、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤高分化、不存在淋巴结转移的患者比较,肿瘤直径>2 cm、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、肿瘤中低分化、存在淋巴结转移患者的血清miR-145、miR-132表达水平均更低,差异有统计学意义(P < 0.05); 与临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤高分化、不存在淋巴结转移的患者比较,临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、肿瘤中低分化、存在淋巴结转移患者的血清SF水平均更高,差异有统计学意义(P < 0.05); 与不存在淋巴结转移的患者比较,存在淋巴结转移的患者的Th17/Treg更高,差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 研究组不同病理参数患者Th17/Treg以及SF、miR-145、miR-132水平变化(x±s)临床病理参数 n Th17/Treg高表达 t P SF/(ng/mL) t P miR-145 t P miR-132 t P 肿瘤直径 — — 1.795 0.076 — 0.955 0.342 — 2.051 0.043 — 10.058 < 0.001 >2 cm 43 0.45±0.08 — — 109.68±21.05 — — 0.49±0.07 — — 0.38±0.06 — — ≤2 cm 49 0.42±0.08 — — 106.03±15.49 — — 0.52±0.07 — — 0.53±0.08 — — 临床分期 — — 0.950 0.345 — 27.472 < 0.001 — 25.531 < 0.001 — 10.372 < 0.001 Ⅰ~Ⅱ期 35 0.45±0.11 — — 61.33±9.52 — — 0.70±0.07 — — 0.48±0.07 — — Ⅲ~Ⅳ期 57 0.47±0.09 — — 128.73±12.44 — — 0.38±0.05 — — 0.35±0.05 — — 肿瘤分化程度 — — 0.927 0.356 — 15.396 < 0.001 — 11.441 < 0.001 — 12.794 < 0.001 中低分化 61 0.51±0.15 — — 133.46±22.05 — — 0.33±0.04 — — 0.32±0.06 — — 高分化 31 0.48±0.14 — — 70.07±8.54 — — 0.44±0.05 — — 0.51±0.08 — — 是否存在淋巴结转移 — — 6.676 < 0.001 — 14.790 < 0.001 — 17.201 < 0.001 — 28.738 < 0.001 是 51 0.55±0.09 — — 131.06±24.15 — — 0.41±0.06 — — 0.35±0.05 — — 否 41 0.43±0.08 — — 71.49±10.03 — — 0.68±0.09 — — 0.71±0.07 — — 2.3 Th17/Treg以及SF、miR-145、miR-132水平对乳腺癌的诊断价值
Th17/Treg以及SF、miR-145、miR-132水平联合检测诊断乳腺癌的曲线下面积(AUC)为0.889, 大于以上指标单独检测的AUC(0.764、0.753、0.682、0.724, P < 0.05), 且联合检测的敏感度、特异度均更高,见表 3和图 1。
表 3 Th17/Treg以及SF、miR-145、miR-132水平对乳腺癌的诊断价值指标 AUC 95%CI P 敏感度/% 特异度/% 约登指数 Th17/Treg 0.764 0.698~0.821 < 0.001 66.30 77.14 0.435 SF 0.753 0.687~0.812 < 0.001 70.65 73.33 0.440 miR-145 0.682 0.612~0.747 < 0.001 67.39 64.76 0.322 miR-132 0.724 0.656~0.786 < 0.001 69.57 61.90 0.315 联合检测 0.889 0.836~0.929 < 0.001 85.87 80.95 0.668 3. 讨论
乳腺癌早期临床表现不具典型性,易被患者忽视,多数患者确诊时已处于中晚期[8-12]。因此,早期诊断对于改善乳腺癌患者预后至关重要。目前,乳腺病变的诊断方法以乳房X线摄影为主,临床诊断价值较高[13-16]。然而,由于特定检查需求或成像清晰度不足,该方法可能需重复拍摄以获取多视角图像信息,延长了患者射线暴露时间,增大潜在健康风险。相比之下,血液中某些标志物的检测具有便捷性、可重复性、成本效益高及无创性等优点,在各类癌症诊断中占据重要地位[17-20]。
Th17、Treg是2种CD4+T细胞,参与机体的免疫应答和免疫耐受[21-23]。研究[24]指出,乳腺癌患者外周血中Th17升高,其具有抑制肿瘤免疫和促进其增殖、分化的作用。miR-132具有非编码功能,研究[25]发现其可通过调控多种蛋白激酶的表达来抑制肿瘤细胞的形成、聚集和增殖,从而抑制肿瘤的发展。
miR-145是抑癌基因,既往研究[26-28]指出, miR-145在乳腺癌患者中表达显著降低,且与肿瘤的恶性程度呈负相关。SF是一种在人体内广泛分布的蛋白质,不仅参与铁的代谢,还参与许多组织的代谢活动。研究[29]发现, SF可在许多实体恶性肿瘤中合成和分泌; 乳腺癌的发展过程中,铁的有效利用减少,使血清中的SF含量增加。因此, SF不仅可以反映体内铁含量,而且可以作为一种肿瘤标记物。本研究发现,与对照组比较,研究组外周血Th17/Treg、血清SF水平均更高,血清miR-145、miR-132表达水平则更低,提示Th17/Treg、SF水平以及miR-145和miR-132表达水平在乳腺癌患者血液中均呈异常表达。
本研究结果显示,与肿瘤直径≤2 cm、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤高分化、不存在淋巴结转移的患者比较,肿瘤直径>2 cm、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、肿瘤中低分化、存在淋巴结转移患者的血清miR-145、miR-132表达水平均更低; 与临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤高分化、不存在淋巴结转移的患者比较,临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、肿瘤中低分化、存在淋巴结转移患者的血清SF水平均更高; 与不存在淋巴结转移的患者比较,存在淋巴结转移的患者的Th17/Treg水平更高。以上结果提示Th17/Treg、SF水平以及miR-145和miR-132表达水平与乳腺癌患者的病理参数均存在一定关系。分析原因发现:乳腺癌患者Treg通过与效应性T淋巴细胞密切接触抑制效应性细胞的功能,产生抗肿瘤免疫效应,从而缓解机体对肿瘤的抑制效应。Th17在乳腺癌中具有促炎、抗肿瘤功能,但随着疾病的进展,其会促血管新生功能增强,从而促进肿瘤侵袭转移。此外, Th17、Treg也参与炎性反应及自身免疫疾病的发生,促使血管增生,上皮-间质转化,最终导致乳腺癌的发生、发展。miR-132是一种在乳腺癌组织中呈低表达的miR,通过调控转录因子的转录,负性调控相关信号通路,从而影响乳腺癌的发展和转移; miR-145在乳腺癌血液中的表达,则随着肿瘤直径、分期和恶性程度的升高而显著下降。
SF是一种重要的调控因子,广泛分布于人体各组织,且在乳腺癌患者血清中的表达显著增高,推测乳腺癌细胞可能通过调控SF异构体的合成和分泌,导致SF的增加。本研究发现, SF水平以及miR-145和miR-132表达水平联合检测的AUC大于以上指标单独检测,提示Th17/Treg、SF水平以及miR-145和miR-132表达水平在乳腺癌的临床诊断中具有更高的价值,原因可能在于上述各个指标联合检测能够互相弥补各自缺点,从而提高对乳腺癌的诊断价值。
综上所述, Th17/Treg、SF水平以及miR-145和miR-132表达水平在乳腺癌患者血液中均呈异常表达,与患者病理参数均存在一定关系,且联合检测在乳腺癌的临床诊断中具有较高的价值。但本研究仅涉及检验相关指标诊断乳腺癌,缺少与病理学、影像学诊断标准的比较,后期需借助信息技术进一步开展多中心研究进行深入研究。
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表 1 各细胞中 ETV4 mRNA和ETV4蛋白相对表达(x±s)
细胞 ETV4 mRNA相对表达 ETV4蛋白相对表达 HIEC-6 1.00±0.15 0.26±0.03 SW480 3.22±0.36*** 0.95±0.08*** Lovo 2.64±0.19*** 0.59±0.07*** Caco-2 1.67±0.15* 0.42±0.04* SW620 2.44±0.14*** 0.51±0.06** ETV4: E26转录因子变异体4。
与HIEC-6比较, * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001表 2 sh-NC组与sh-ETV4组 ETV4 mRNA和ETV4蛋白表达比较(x±s)
组别 ETV4 mRNA相对表达 ETV4蛋白相对表达 sh-NC组 1.00±0.11 0.84±0.07 sh-ETV4组 0.38±0.04*** 0.28±0.04*** 与sh-NC组比较, * * * P < 0.001。 -
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