Impact and mechanism of NOD-like receptor thermal protein domain-associated protein 3 on pathological features and inflammatory response in a rat model of hemorrhoids
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摘要:目的
探讨NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)对痔疮模型大鼠创面病理特征、炎症反应及环磷酸腺苷(cAMP)/瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)信号通路的影响。
方法将40只6周龄健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、NLRP3激动剂组和NLRP3抑制剂组，每组10只。对照组不进行干预，其余3组均构建急性痔疮模型。NLRP3激动剂组、NLRP3抑制剂组在造模成功后分别给予创面局部皮下注射NLRP3激动剂、NLRP3抑制剂，模型组、对照组则给予等量生理盐水皮下注射。观察各组大鼠创面病理特征并评估创面积分，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平，采用蛋白质印迹法(Western blot)检测创面组织中NLRP3、cAMP和TRPV1蛋白表达量，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测创面组织中NLRP3、cAMP、TRPV1基因mRNA表达量。
结果与对照组相比，模型组创面组织炎性细胞浸润增多，水肿明显，组织结构紊乱，结缔组织增生; 与模型组相比, LRP3激动剂组炎性细胞浸润增多，而NLRP3抑制剂组炎性细胞浸润减少。干预后，与对照组相比，模型组创面积分和血清TNF-α、IL-6水平升高，创面组织中NLRP3、cAMP、TRPV1蛋白相对表达量和NLRP3、cAMP、TRPV1基因mRNA表达量升高，差异有统计学意义(P < 0.05); 干预后，与模型组相比, NLRP3激动剂组上述指标均升高, NLRP3抑制剂组上述指标均降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论NLRP3炎症小体可能通过激活cAMP/TRPV1信号通路，参与调控大鼠急性痔疮的发生与发展。
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关键词:
- 痔疮 /
- NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 /
- 环磷酸腺苷 /
- 瞬时受体电位香草酸亚型1 /
- 炎症因子
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of NOD-like receptor thermal protein domain-associated protein 3 (NLRP3) on wound pathological characteristics, inflammatory responses, and cyclic adenosine monophosphate (cAMP)/transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1) signaling pathways in a rat model of hemorrhoids.
MethodsForty healthy male SD rats aged 6 weeks were randomly divided into control group, model group, NLRP3 agonist group, and NLRP3 inhibitor group, with 10 rats in each group. The control group received no intervention, while acute hemorrhoid models were established in the other three groups. After successful modeling, the NLRP3 agonist group and the NLRP3 inhibitor group were administered local subcutaneous injections of NLRP3 agonist and NLRP3 inhibitor at the wound site, respectively. The model group and the control group received subcutaneous injections of equal volume of saline. The pathological characteristics of the wounds in each group were observed and wound scores were assessed. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect serum levels of tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6. Western blot analysis was employed to detect protein expression levels of NLRP3, cAMP, and TRPV1 in the wound tissue. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect mRNA expression levels of NLRP3, cAMP, and TRPV1 in the wound tissue.
ResultsCompared with the control group, the model group exhibited increased inflammatory cell infiltration, pronounced edema, disrupted tissue structure, and connective tissue hyperplasia in the wound tissue. When compared to the model group, the NLRP3 agonist group showed an increase in inflammatory cell infiltration, whereas the NLRP3 inhibitor group demonstrated a reduction in inflammatory cell infiltration. After intervention, compared with the control group, the model group had elevated wound scores and serum levels of TNF-α and IL-6. Additionally, the relative protein expression levels of NLRP3, cAMP, and TRPV1, as well as the mRNA expression levels of NLRP3, cAMP, and TRPV1 in the wound tissue, were increased in the model group (P < 0.05). Following intervention, when compared to the model group, the NLRP3 agonist group showed an increase in all aforementioned indicators, whereas the NLRP3 inhibitor group exhibited a decrease in these indicators (P < 0.05).
ConclusionThe NLRP3 inflammasome may participate in the development and progression of acute hemorrhoids in rats by activating the cAMP/TRPV1 signaling pathway.
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宫颈上皮内瘤变(CIN)是与子宫颈浸润癌密切相关的一组子宫颈鳞状上皮内非典型增生病变，好发于年轻性活跃期妇女。近年来，宫颈癌的发病出现年轻化的趋势[1]。人乳头状瘤病毒(HPV)是一种常见的致宫颈癌病毒，致癌性HPV也会导致宫颈发生癌前病变，即CI。有关文献[2-3]指出，高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染与CIN的发病有关。电灼、冷冻、激光、宫颈环形电切除术与宫颈锥切术是治疗CIN的主要方法，但是复发率及宫颈组织缺失是避免不了的缺陷，术后患者常会出现早产、晚期流产以及其他围生期并发症风险。基于CIN自发性逆转率高及其治疗中存在的上述不良风险，美国最近的管理指导方针建议对高级别CIN的年轻患者采取保守治疗方式，以尽量降低治疗对未来妊娠带来的风险。5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)是一种具有高度选择性的药械结合微创治疗技术，通过激光结合光敏剂的非侵入性疗法，能够用于治疗尖锐湿疣以及癌前病变等疾病。相关研究[4]指出, ALA-PDT在治疗HPV感染所致宫颈疾病中有较高的价值。本院就ALA-PDT对宫颈HPV感染合并CIN疗效及预后的影响进行研究，探讨ALA治疗的最佳浓度，报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选择2016年9月—2018年8月在本院就诊的100例经阴道镜和病理组织检查确诊为宫颈上皮内瘤样病变患者作为研究对象，其中23例为CINⅠ期, 77例为CINⅡ期。将患者分为安慰剂组、5% ALA治疗组、10% ALA治疗组和20% ALA治疗组，每组25例。安慰剂组CINⅠ有6例, CINⅡ19例; 5% ALA治疗组CINⅠ4例, CINⅡ21例; 10% ALA治疗组CINⅠ6例, CINⅡ19例; 20% ALA治疗组CINⅠ7例, CINⅡ18例。分别给予安慰剂, 5%、10%与20%的新鲜的ALA温敏凝胶治疗。纳入标准: ①年龄18~60岁; ②病程为1~2年; ③ HR-HPV持续阳性患者; ④自愿签署知情同意书的患者。排除标准: ①病变已经延伸至阴道穹隆的患者; ②有CIN治疗史的患者; ③阴道感染患者; ④妊娠或哺乳期的患者; ⑤卟啉病患者; ⑥长期服激素患者。4组患者的年龄、体质量指数及病程等一般资料均具有可比性(P>0.05)。
1.2 方法
HR-HPV DNA检测: 采用HPV DNA杂交捕获试验检测所有患者治疗前与治疗后3个月、治疗6个月后宫颈脱落细胞中HPV DNA16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59。检测试剂及仪器均购自美国西门子公司，严格按照说明书操作进行。
ALA-PDT治疗: 选择温敏凝胶剂配制一定量5%、10%与20%的新鲜的ALA温敏凝胶。选择光动力治疗仪(LED IB型)、半导体激光治疗仪(LD600-C)进行治疗。局部应用20% 5-氨基酮戊酸(ALA)浸湿制备的薄棉片，按118 mg/cm2标准覆盖至病变外缘1 cm, 用外套避孕套的无菌纱卷塞入阴道封包，持续敷药时间不少于3 h, 进行ALA治疗。先在患者宫颈外口处使用点光照射30 min, 剂量为100 J/cm2, 再将柱状光纤插入宫颈口进行10 min的照射，剂量为80 J/cm2。每周治疗1次，连续6次。
安慰剂组患者先给予对照药膏进行帖敷，再给予ALA进行治疗。
1.3 观察指标及效果评价标准
疗效评估: 治疗后3个月与6个月时，通过组织学和细胞学显示的结果对患者宫颈情况进行检查，若结果显示正常或轻度异常，脱落细胞的HR-HPV DNA结果转阴则为有效。
1.4 统计学分析
选择SPSS 15.00软件对数据进行统计分析，计量资料采用(x±s)表示，行t检验; 选计数资料行χ2检验，用[n(%)]表示，等级资料用秩和检验; 当P < 0.05时差异有统计学意义。
2. 结果
治疗3~6个月后，安慰剂组、5%ALA治疗组、10%ALA治疗组和20%ALA治疗组治疗CINⅡ患者的治疗有效率分别为57.89%、61.90%、68.42%和94.44%, 安慰剂组与其余3组有效率比较无显著差异(P>0.05)。治疗3、6个月后，安慰剂组CINⅡ期患者的有效率显著低于20%ALA治疗组治疗CINⅡ患者，数据差异有统计学意义(χ2=10.48, P < 0.05)。20% ALA组CINⅡ期患者在治疗6个月后HPV16/18阴转率显著高于安慰剂组、5% ALA治疗组、10% ALA治疗组，差异有统计学意义(χ2=14.27, P < 0.05)。见表 1。
表 1 各组CINⅡ期患者的疗效比较[(n)%]组别 n 治疗3个月后 治疗6个月后 有效 HPV清除 不良反应 局部出血 局部不适 有效 HPV清除 不良反应 局部出血 局部不适 安慰组 19 11(57.89) 0 3(15.79) 1(5.26) 2(10.53) 12(63.16) 6(31.58) 4(21.05) 3(15.79) 4(21.05) 5% ALA 21 13(61.90) 6(28.57) 6(28.57) 2(9.52) 2(9.52) 16(76.19) 8(38.10) 6(28.57) 3(14.29) 4(19.05) 10% ALA 19 13(68.42) 8(42.11) 6(31.58) 2(10.53) 2(10.53) 16(84.21) 8(42.11) 5(26.32) 3(15.79) 4(21.05) 20% ALA 18 17(94.44) 15(83.33) 10(55.55) 1(5.55) 2(11.11) 17(94.44) 13(72.22) 6(33.33) 4(22.22) 4(22.22) 3. 讨论
CIN有较大的发展为宫颈浸润癌的可能[5]。感染HR-HPV会加快宫颈鳞状上皮的细胞非典型增生，故HR-HPV感染属于CIN转变为宫颈瘤的一个较为重要的因素，因此CIN的早期检测与诊断能够便于及时有效治疗，在预防宫预癌具有重大意义[7-9]。本研究就ALA-PDT法对CNIⅠ/Ⅱ伴HPV感染患者治疗效果进行研究。ALA治疗CINⅠ/Ⅱ与HIV持续感染的患者的主要机制[10-12]: 进入机体的外源性ALA在增生活跃的宫颈上皮细胞处被吸收，然后在细胞内经过一系列的生化反应后转化为原叶啉Ⅸ。原叶啉Ⅸ属于光敏物质，在特定波长的光的照射后能够产生大量的活性氧，进而消灭周围较为活跃的增生上皮细胞达到治疗效果。
ALA-PDT的治疗效果与药物的浓度存在一定相关性，因为在宫颈上皮细胞内所进入的ALA浓度直接影响PDT的效果[13]。相关研究[14-15]指出, 3~6 h内宫颈上皮细胞吸收ALA的量会达到饱和状态，而且20%浓度的ALA是持续治疗HR-HPV感染最有效的浓度。而本次分别对5%、10%以及20%浓度的ALA进行封闭后再进行光疗，在进行3、6个月的治疗后，浓度为20%ALA的CINⅡ患者HR-HPV阴转率最高; 同时浓度为20%的ALA治疗CINⅡ患者的有效率也最高，这与之前的相关研究结果一致。而与ALA-PDT治疗次数及间隔时间有关的标准仍未得到统一。由于本次的研究样本较小，故尚未对治疗的间隔时间、治疗次数与治疗效果的相关性进行研究。
本次研究选择CINⅠ/Ⅱ, 但没有选择CINⅢ的原因是CINⅢ病变已经属于癌前病变，此种病变有较高的侵袭性，故对于CINⅢ的患者本院主要选择手术方法进行治疗，而非保守治疗的方法。有研究报道指出，选择ALA-PDT进行3个月的治疗后CINⅡ患者有高达90%的清除率，同时也有73%的HPV转阴率。也有研究发现，用浓度与3%ALA在对CINⅠ/Ⅱ进行治疗时，与对照组相比疗效无明显差异。在上述研究中，虽然ALA均作为局部的宫颈用药，但所得到的结果与本次本院的研究结果依然存在一定的差异，这可能与CIN等级以及研究对象的样本数有关外，还可能与治疗时间、ALA的浓度、PDT光波长与光剂量的不同等因素有关。本次研究结果显示，不同浓度ALA与安慰剂对CINⅠ患者的治疗有效率无显著差异; 这可能是由于CINⅠ患者的病变程度较低，有着较高的自然愈合率。
由上述结果可知，在临床ALA-PDT的治疗过程中，应该遵循个体差异的原则，依据患者的具体情况给予患者不同剂量进行治疗; 另外，在不同浓度ALA-PDT治疗后的随访期内，有部分患者出现了可耐受的局部不良反应，但经过相关处理后不良反应均得到控制且未影响治疗的效果。
综上所述，浓度为20%ALA在治疗CINⅡ的患者时能够得到较高的有效率，同时HR-HPV也有较高的转阴率。尽管对CINⅠ患者的治疗效果并不显著，但是ALA-PDT对合并HR-HPV感染的CIN患者的治疗方面应用前景良好。
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图 2 各组大鼠创面组织中NLRP3、cAMP和TRPV1蛋白表达量比较
与对照组比较, #P < y0.05; 与模型组比较, *P < 0.05; 与NLRP3激动剂组比较, △P < 0.05。
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图 4 各组大鼠创面组织中NLRP3、cAMP、TRPV1基因的mRNA表达量比较
与对照组比较, #P < 0.05; 与模型组比较, *P < 0.05; 与NLRP3激动剂组比较, △P < 0.05。
表 1 各组大鼠创面积分比较($\bar{x} \pm s$)
分 组别 n 干预前 干预7 d后 对照组 10 0.3±0.1 0.3±0.1 模型组 10 7.8±0.5* 7.9±0.5* NLRP3激动剂组 10 7.7±0.4* 8.5±0.3*#▲ NLRP3抑制剂组 10 7.6±0.4* 5.4±0.3*#△▲ 与对照组比较, *P < 0.05; 与模型组比较, #P < 0.05;
与NLRP3激动剂组比较, △P < 0.05;
与干预前比较, ▲P < 0.05。
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表 2 各组大鼠血清TNF-α和IL-6水平比较($\bar{x} \pm s$)
mg/L 组别 n TNF-α IL-6 干预前 干预7 d后 干预前 干预7 d后 对照组 10 0.5±0.1 0.6±0.1 0.9±0.2 0.9±0.3 模型组 10 8.6±2.3* 8.7±2.4* 12.5±3.4* 12.7±3.5* NLRP3激动剂组 10 8.4±2.2* 12.3±3.6*#▲ 12.2±3.1* 15.5±4.5*#▲ NLRP3抑制剂组 10 8.5±2.3* 4.8±0.9*#△▲ 12.6±3.4* 9.9±2.5*#△▲ TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; IL-6: 白细胞介素-6。与对照组比较, *P < 0.05; 与模型组比较, #P < 0.05;
与NLRP3激动剂组比较, △P < 0.05; 与干预前比较, ▲P < 0.05。
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[1] PATA F, SGRÓ A, FERRARA F, et al. Anatomy, physiology and pathophysiology of haemorrhoids[J]. Rev Recent Clin Trials, 2021, 16(1): 75-80.
[2] PORWAL A, KUNDU G C, BHAGWAT G, et al. Herbal medicine AnoSpray suppresses proinflammatory cytokines COX-2 and RANTES in the management of hemorrhoids, acute anal fissures and perineal wounds[J]. Exp Ther Med, 2022, 23(1): 86.
[3] 徐珊, 窦燕, 李小军, 等. 内镜下负压套扎术对Ⅱ、Ⅲ度痔疮患者肛肠动力学、炎症反应及免疫功能的影响[J]. 现代生物医学进展, 2024, 24(6): 1187-1190, 1170. [4] 李萌. PKA介导骨癌诱导的大鼠特异性背根神经节神经元兴奋性的机制研究[J]. 全科口腔医学杂志: 电子版, 2019, 6(21): 158-159. [5] 何裕智, 李俊. 自动痔疮套扎术对直肠内脱垂合并便秘患者肠黏膜屏障功能及黏膜TRPV1、5-HT表达的影响[J]. 现代消化及介入诊疗, 2021, 26(5): 607-610. doi: 10.3969/j.issn.1672-2159.2021.05.013 [6] 中华中医药学会中药实验药理专业委员会. 中药痔疮动物模型制备规范(草案)[J]. 中药药理与临床, 2017, 33(5): 211-212. [7] ZHANG Y L, SUN S W, HAN Z G. Establishment and validation of clinical prediction model for hemorrhoid recurrence after procedure for prolapse and hemorrhoids[J]. Medicine, 2023, 102(26): e34062. doi: 10.1097/MD.0000000000034062
[8] 徐珊, 窦燕, 李小军, 等. 苦参凝胶对痔疮模型大鼠的治疗效果及机制研究[J]. 中医药学报, 2024, 52(3): 34-39. [9] 袁一鸣, 王艳, 裴飞, 等. NLRP3炎性小体与周围神经损伤关系的研究进展[J]. 华中科技大学学报: 医学版, 2023, 52(5): 735-741. [10] 张艺嘉, 余清华, 王宇, 等. 菝葜通过NLRP3通路对巴豆油诱发痔疮大鼠模型的改善作用[J]. 湖北中医药大学学报, 2024, 26(2): 10-14. [11] FU J N, WU H. Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation[J]. Annu Rev Immunol, 2023, 41: 301-316.
[12] SEOANE P I, LEE B L, HOYLE C, et al. The NLRP3-inflammasome as a sensor of organelle dysfunction[J]. J Cell Biol, 2020, 219(12): e202006194.
[13] 李惠雯, 严建, 宾东华, 等. 参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及cAMP/PKA信号通路和TRPV1蛋白表达的影响[J]. 现代中西医结合杂志, 2024, 33(8): 1065-1071. [14] MA Y Q, CHEN J, YU D Q, et al. cAMP-PKA signaling is involved in regulation of spinal HCN channels function in diabetic neuropathic pain[J]. Neurosci Lett, 2021, 750: 135763. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304394021001415
[15] 梁冉冉, 刁志君, 杨晓航, 等. 穴位敏化现象与TRPV1通道的关系研究[J]. 针灸临床杂志, 2023, 39(7): 1-5. [16] YU Q, ZHAO Y, ZHANG X Y, et al. The beneficial effect of Sanhuang ointment and its active constituents on experimental hemorrhoids in rats[J]. J Ethnopharmacol, 2024, 319(Pt 2): 117173.
[17] ZHAO C Y, ZHAO W. NLRP3 inflammasome-a key player in antiviral responses[J]. Front Immunol, 2020, 11: 211.
[18] XIA C Y, GUO Y X, LIAN W W, et al. The NLRP3 inflammasome in depression: potential mechanisms and therapies[J]. Pharmacol Res, 2023, 187: 106625.
[19] 刘宁远, 刘殿龙, 郑丽华. 痔的治疗现状与展望[J]. 中国临床医生杂志, 2024, 52(1): 1-3. [20] 李彦娜, 杨阳, 刘晓娜, 等. 冷冻疗法联合马应龙麝香痔疮膏对混合痔术后水肿及疼痛程度的影响[J]. 检验医学与临床, 2023, 20(16): 2452-2455. [21] 顾菁华, 杜培欣, 吴伟, 等. 黄连解毒汤对急性痔疮模型大鼠肛周病理组织形态、免疫功能以及炎症因子的影响[J]. 中国中医急症, 2020, 29(1): 25-28. -
期刊类型引用(9)
1. 魏艳飞，徐春燕，魏玲，刘勃，于倩，董闯. HPV感染相关CIN患者血清HLA-E和HLA-G表达与疾病进展及治疗后复发的相关性. 安徽医学. 2024(01): 34-38 . 
百度学术
2. 唐容迪，倪泞，沈菲. 5-氨基酮戊酸光动力学疗法联合干扰素栓对持续高危型人乳头瘤病毒感染患者病毒清除率及阴道微环境的影响. 中国当代医药. 2024(12): 108-111+116 . 百度学术
3. 蒋红梅. 阴道镜联合利普刀治疗宫颈上皮内瘤变患者的临床效果. 妇儿健康导刊. 2023(07): 42-44 . 百度学术
4. 谭锦辉，劳慧琴，蓝莉芳，李贤周，曾玉玲. 光动力疗法治疗宫颈高危HPV感染的临床效果. 中国城乡企业卫生. 2022(03): 148-150 . 百度学术
5. 成乐楠，葛利葱，卢晓莉，李宁，杨秋云. 5-氨基酮戊酸光动力疗法治疗子宫颈低级别鳞状上皮内病变合并高危型人乳头瘤病毒感染的疗效观察. 实用临床医药杂志. 2021(06): 20-24 . 本站查看
6. 马梦柯. 光动力疗法在女性生殖系统疾病中的应用及并发症的护理. 现代泌尿生殖肿瘤杂志. 2021(02): 126-128 . 百度学术
7. 李宏. 光动力学疗法在妇科肿瘤中应用的研究. 医学信息. 2021(21): 49-51 . 百度学术
8. 高娟，王霞，夏亚芳，华彩凤. 光动力治疗宫颈低级别上皮内瘤变的疗效观察. 实用临床医药杂志. 2021(23): 106-109 . 本站查看
9. 黄舒婷，左帆，刘雯雯，杨欣影，吴良芝. 5-氨基酮戊酸光动力治疗16型或（和）18型人乳头状瘤病毒宫颈持续感染合并宫颈低级别上皮内瘤样病变疗效观察. 妇产与遗传(电子版). 2020(03): 17-21 . 百度学术
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