Mechanism of macrophage extracellular traps induced activation of fibroblast-like synoviocytes in the pathogenesis of rheumatoid arthritis
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摘要:目的
研究巨噬细胞胞外诱捕网(METs)对成纤维样滑膜细胞(FLSs)的作用和相关机制。
方法采用人源单核细胞白血病细胞(THP-1)系体外诱导成巨噬细胞, 分别使用脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)诱导METs形成。采用Sytox标记外泄的DNA水平; 采用Western blot和免疫荧光法检测METs主要蛋白成分NE和MPO。纯化METs蛋白组分，将人FLSs细胞系分为对照组、METs组、C29组、IAXO-102组和C29+IAXO-102联合干预组，除对照组外，其余组均将纯化的METs蛋白组分加入FLSs培养液中, C29组同时加入Toll样受体(TLR)2抑制剂C29, IAXO-102组加入TLR4抑制剂IAXO-102, C29+IAXO-102联合干预组同时加入C29和IAXO-102。24h后，检测FLSs细胞活力、迁移和侵袭能力。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清中白细胞介素6(IL-6)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)水平。
结果LPS诱导METs能力强于IFN-γ, 差异有统计学意义(P < 0.05);METs蛋白可以显著增强FLSs细胞活力、滑膜细胞迁移和侵袭能力(P < 0.05);与对照组相比, METs蛋白处理组上清中IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。C29和IAXO-102单用或联用干预能显著降低滑膜细胞的活力、迁移和侵袭能力(P < 0.05);与METs组相比，C29+IAXO-102联合干预组上清中IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平下降，差异具有统计学意义(P < 0.05), 且IAXO-102抑制能力强于C29(P < 0.05)。
结论METs蛋白作为损伤相关模式分子主要通过活化TLR4来进一步激活FLSs, 从而参与RA发病。
Abstract:ObjectiveTo investigate the role of macrophage extracellular traps (METs) on fibroblast-like synoviocytes (FLSs) and related mechanisms.
MethodsA human acute monocytic leukemia cell (THP-1) line was used to induce macrophages in vitro, and lipopolysaccharide (LPS) and interferon γ(IFN-γ) were used to induce METs; Sytox was used to mark the level of leaked DNA; Western blot and immunofluorescence were used to detect NE and MPO in METs. After purification of METs protein components, human FLSs cell lines were divided into control group, METs group, C29 group, IAXO-102 group and C29+IAXO-102 combined intervention group. Except for the control group, purified METs protein components were added to FLSs medium in the other groups. Toll-like receptor (TLR) 2 inhibitor C29 was added to the C29 group, TLR4 inhibitor IAXO-102 was added to the IAXO-102 group, and C29 and IAXO-102 were added to the C29+IAXO-102 combined intervention group. After 24 h, the viability, migration and invasion ability of FLSs cells were detected. The levels of interleukin-6 (IL-6), matrix metalloproteinase 1 (MMP-1), matrix metalloproteinase 3 (MMP-3) and matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) in the culture supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ResultsLPS induced METs ability was significantly stronger than IFN-γ (P < 0.05). METs protein significantly enhanced FLSs cell viability, synovial cell migration and invasion ability (P < 0.05); compared with the control group, IL-6, MMP-1, MMP-3 and MMP-13 in the supernatant of METs protein treatment group were significantly increased (P < 0.05). C29 or IAXO-102 alone or their combination could significantly reduce the viability, migration and invasion ability of synovial cells (P < 0.05); compared with METs group, the levels of IL-6, MMP-1, MMP-3 and MMP-13 in the combined intervention group were significantly decreased (P < 0.05), and the inhibitory effect of IAXO-102 was significantly stronger than that of C29 (P < 0.05).
ConclusionMETs proteins as damage-related model molecules are mainly involved in RA pathogenesis by activating TLR4 to further activate FLSs.
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阿片类药物为临床常用药物，但其在有效控制癌痛的同时，常伴有阿片类药物相关性便秘(OIC), 发生率90%~100%[1]。OIC如未得到有效控制，可引起腹胀、肠梗阻等并发症，因此应积极采取适当的护理干预措施治疗OIC。本课题组前期研究[2]成果表明，采用电子灸疗法可有效干预OIC。电子灸是通过热效应、药性作用和经络腧穴产生效果[3]，热效应直接关系到治疗效果，但目前关于电子灸热效应中温度设定尚存在颇多争议。本研究探讨了电子灸干预OIC的最佳温度，以期将此项操作同质化，取得更好的治疗效果，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年1月—2018年6月在本院肿瘤科治疗的90例癌症患者作为研究对象，纳入标准: ①年龄≥18岁，确诊为恶性肿瘤; ②使用阿片类药物止痛治疗后出现便秘; ③便秘符合美国多学科工作组制定的OIC诊断标准[4], 即阿片类药物治疗1周以上，肠蠕动减弱致每周自发排便少于3次，排便费力、不尽感及便硬; ④卡氏评分≥50分，预计生存期大于3个月; ⑤能充分理解本研究情况并自愿签署知情同意书。排除标准: ①腹部压痛明显，拒按; ②结直肠器质性病变或局部病变引起的便秘、急性肠梗阻、习惯性便秘; ③病情危重，不能耐受; ④因精神原因或严重认知障碍不能配合者; ⑤实施操作部位皮肤有破损者及过敏体质患者。脱落标准: ①拒绝使用电子灸3次及以上者; ②中途使用可能影响排便的药物。将纳入研究的90例患者按入院先后顺序采用随机数字表法分为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组，各30例，研究过程中脱落4例(对照组2例、试验Ⅰ组1例、试验Ⅱ组1例)。对照组28例患者中，男15例、13例，平均年龄(63.21±12.18)岁，肿瘤原发部分为肺11例、胃4例、食管4例、乳腺3例、胰腺4例、脑2例; 试验Ⅰ组29例患者中，男15例、女14例，平均年龄(62.05±11.28)岁，肿瘤原发部分为肺13例、胃4例、食管5例、乳腺4例、胰腺2例、脑1例; 试验Ⅱ组29例患者中，男16例、女13例，平均年龄(63.07±11.56)岁，肿瘤原发部分为肺14例、胃3例、食管3例、乳腺4例、胰腺3例、脑2例。3组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 研究方法
1.2.1 资料收集者条件
工作满10年的中医护士，并担任责任组长，经过统一培训、考核合格。
1.2.2 对照组
遵医嘱按照癌痛规范化管理要求进行干预。①每日评估患者的OIC症状和相关行为，结合患者自身情况给予合理的饮食指导，并嘱适当运动。②腹部按摩手法，两手重叠将右手或左手手掌贴敷在腹壁上，以肚脐为中心，顺肠管方向做腹部环形按摩，由中心向外逐步扩大按摩范围，然后逐步由外向内缩小按摩范围回到肚脐，周而复始按摩15~20 min。③给予乳果糖口服溶液，每次15 mL, 2次/d, 密切观察药物反应。
1.2.3 试验Ⅰ组
在对照组基础上采用电子灸治疗[鹊牌电子艾灸治疗仪，苏食药监械(准)字2012第2270411号]。①选穴原则: 参照《中华人民共和国国家标准·经穴部位》中的穴位定位法取穴。根据课题组前期研究结果取双侧天枢、中脘、足三里、下巨虚穴位。②操作方法: 由2位中医护士确定穴位后，将灸头底盖和灸片一起卡在灸头上，将灸头用松紧带固定在施灸穴位上，温度调节为45 ℃, 观察局部皮肤情况及病情变化，随时询问患者有无灼痛感及不适。每日1次，每次30 min。
1.2.4 试验Ⅱ组
在对照组的基础上采用电子灸，操作过程同试验Ⅰ组，温度调节为50 ℃。
1.3 观察指标
2周后，统计2组患者OIC严重程度及治疗效果。① OIC严重程度: 采用肠功能指数(BFI)量表评估，该量表共3个条目，包括排便难易程度、排便不净感和便秘的总体评价3方面，每个条目均为0~100的数字评估表, 0表示无感觉, 100表示感觉最强烈，量表总分为3个条目的平均分，分值越高，表示便秘程度越重[5]。②便秘治疗效果: 参照《中药新药临床研究指导原则》关于“中药新药治疗便秘的临床研究指导原则”的疗效判定标准，分为4个评判等级，分别为临床痊愈、显效、有效和无效。痊愈，为大便正常，或恢复至病前水平; 显效，为便秘有明显改善，接近正常或大便隔时间在72 h以内，其他症状大部分消失; 有效，为排便间隔时间缩短1 d, 或便质干结改善，其他症状无好转; 无效，为便秘及其他症状均无改善。
1.4 统计学分析
本研究数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理，计量资料以(x±s)表示，符合正态分布则采用t检验，计数资料[n(%)]的比较采用χ2检验，总体疗效采用非参数检验秩和检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
治疗2周后，对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的便秘严重程度评分差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1; 试验Ⅱ组和试验Ⅰ组的治疗有效率显著优于对照组(P < 0.05), 见表 2。
表 1 3组患者便秘BFI量表评分比较(x±s)分 组别 排便费劲 排便不净感 便秘总评分 对照组(n=28) 72.58±11.82 60.87±8.82 57.10±12.83 试验Ⅰ组(n=29) 53.23±12.32* 50.48±11.68* 49.23±13.02* 试验Ⅱ组(n=29) 41.65±12.54*# 40.90±10.24*# 38.65±11.72*# 与对照组比较, *P < 0.05; 与试验Ⅰ组比较, #P < 0.05。 表 2 3组患者疗效比较[n(%)]组别 便秘疗效 总有效 临床治愈 显效 有效 无效 对照组(n=28) 2(7.14) 6(21.42) 12(42.85) 8(28.57) 20(71.43) 试验Ⅰ组(n=29) 5(17.24) 9(31.03) 10(34.48) 5(17.24) 24(82.76)* 试验Ⅱ组(n=29) 7(24.13) 13(44.82) 5(17.24) 4(13.79) 25(86.21)* 与对照组比较, *P < 0.05。 3. 讨论
阿片类药物是治疗癌痛患者的首选药物，OIC是其最常见的不良反应，且不可逆。传统的OIC治疗方法是药物联合非药物治疗，包括使用泻药、增加膳食纤维和液体摄入量、适当增加运动量等，但并不能完全缓解OIC[6]。中医学认为，癌症患者久病气虚，服用阿片类药物后易气滞、寒凝、气血亏虚，使肠道传导功能失常，糟粕不行，凝结肠道。本研究比较了不同温度电子灸干预OIC的治疗效果及严重程度，结果显示电子灸采用50 ℃的效果显著优于45 ℃，而2组采用电子灸治疗的患者便秘治疗效果优于对照组、便秘严重程度低于对照组。由此表明，患者采用电子灸能辅助治疗OIC或缓解OIC严重程度，而最佳干预温度为50 ℃。
一项灸法治疗便秘的临床疗效系统评价研究[7]中显示，灸法或灸法+其他疗法与对照组比较，有效率有显著差异，且疗效优于单纯西药组。电子灸将中医艾灸原理和现代微电子技术结合，同时配合仪器的磁疗、远红外疗法，实现了无烟无火、控温控时、定向导入、透皮吸收等功能，将传统艾灸的疗效提高到一个新高度。灸片通过超临界萃取技术提取艾叶中的有效成分制成，灸片中的药物成份通过艾灸仪可更充分、更有效、更直接地到达病灶部位，其效果不亚于传统灸法。
热效应是电子灸产生治疗效果的重要因素之一，用红外光谱仪测定60 ℃时灸疗头的光谱和波峰与人体穴位光谱接近，此时在穴位上进行温热治疗以增强疗效[3], 因此，在人体能耐受的温度下，温度越高，其治疗效果越好。临床实践中，采用50 ℃隔着灸片灸，灸片到达体表温度为44~45 ℃, 理论的烫伤温度临界值为44 ℃, 并且持续6 h才会发生烫伤[8]。前期预实验中并无烫伤发生，安全效果较好。因此，采用50 ℃温度的试验Ⅱ组的效果优于采用45 ℃温度的试验Ⅰ组。
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图 1 THP-1细胞系诱导成巨噬细胞
A: THP-1单核细胞系被诱导成巨噬细胞的明场图像; B: THP-1单核细胞系被诱导成巨噬细胞的荧光鉴定，蓝色的DAPI为细胞核，绿色的F4/80为巨噬细胞标记物，标尺为100 μm。
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图 2 LPS、IFN-γ诱导METs的形成能力
A: LPS与IFN-γ诱导巨噬细胞产生METs蛋白组分NE与MPO的能力; B: LPS与IFN-γ诱导巨噬细胞产生METs蛋白组分外泄的DNA能力的代表性图像，外泄DNA采用绿色的Sytox标记，标尺为100 μm; C: LPS与IFN-γ诱导巨噬细胞产生METs蛋白组分弹性蛋白酶(NE)与髓过氧化物酶(MPO)能力的荧光代表性图像; 蓝色的DAPI为细胞核，绿色的为MPO, 红色为NE, 标尺为100 μm。与LPS诱导METs比较, *P < 0.05, **P<0.01。
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图 3 METs通过TLR2和TLR4促进FLSs活化
A: CCK-8检测各组FLSs细胞的活力; B: 不同处理条件下的FLSs迁移能力结晶紫染色代表性图像，标尺为100 μm; C: 不同处理条件下的FLSs侵袭能力结晶紫染色代表性图像，标尺为100 μm; D: ELISA检测各组FLSs培养上清细胞产生IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13的水平; 与METs单用比较, C29和IAXO-102单用或联用干预后FLSs的活力下降，细胞迁移和侵袭能力减弱，上清IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平增高; 与C29组比较, IAXO-102组抑制能力更强, *P < 0.05, **P<0.01, ***P<0.001。
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