Long non-coding RNA MIR22HG regulates CTLA4 through microRNA-9-3p to inhibit prostate cancer
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摘要:目的
探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIR22HG通过微小RNA-9-3p(miR-9-3p)调节细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)抑制前列腺癌的机制。
方法收集26例前列腺癌组织样本和26例前列腺增生组织样本，培养VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测前列腺癌组织、前列腺增生组织及4种前列腺癌细胞的MIR22HG和miR-9-3p mRNA水平。筛选MIR22HG和miR-9-3p mRNA表达较高的细胞。将筛选出的细胞按不同干预方法分为OE-CTLA4(CTLA4过表达组)、OE-MIR22HG(MIR22HG过表达组)、miR-9-3p mimic(miR-9-3p过表达组)、OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic(MIR22HG及miR-9-3p联合过表达组)、OE-NC+NC mimic(转染对照组)、NC mimic(miR-9-3p过表达对照组)。采用TargetScan数据库及荧光素酶报告基因实验验证MIR22HG与miR-9-3p及miR-9-3p与CTLA4是否存在靶向抑制关系。采用qRT-PCR及Western blot检测各组细胞MIR22HG和miR-9-3p mRNA及CTLA4蛋白表达。取裸鼠96只，按干预方法不同分为OE-NC+NC mimic组(转染对照)、OE-MIR22HG组(MIR22HG过表达)及OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组(MIR22HG及miR-9-3p联合过表达)，每组32只。接种后4周期间，每周检测小鼠原位移植瘤并统计瘤体的质量和体积变化。
结果前列腺癌细胞VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞中, PC3细胞MIR22HG mRNA相对较低, miR-9-3p mRNA相对较高，因此选择PC3细胞进行研究。在PC3细胞中成功过表达MIR22HG, 荧光素酶报告基因实验验证了MIR22HG和miR-9-3p的靶向抑制关系，过表达MIR22HG, miR-9-3p表达下调，差异有统计学意义(P < 0.05)。TargetScan数据库预测免疫基因CTLA4和miR-9-3p的靶向关系，荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p和CTLA4的靶向抑制关系，过表达miR-9-3p, CTLA4表达上调，差异有统计学意义(P < 0.05)。过表达MIR22HG的裸鼠皮下肿瘤的质量降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组裸鼠皮下肿瘤的质量、体积与OE-NC+NC mimic组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
结论MIR22HG与miR-9-3p存在靶向负调节关系, miR-9-3p与CTLA-4存在靶向调节关系, MIR22HG/miR-9-3p可能通过抑制CTLA4达到免疫治疗前列腺癌的目的。
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关键词:
- 长链非编码RNA MIR22HG /
- 微小RNA-9-3p /
- 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 /
- 前列腺癌
Abstract:ObjectiveTo explore the mechanism of long-chain non-coding RNA (LncRNA) MIR22HG to regulate cytotoxic T-lymphocyte protein 4 (CTLA4) through microRNA-9-3p (miR-9-3p) to inhibit prostate cancer.
MethodsVCAP, PC3, LNCap and DU145 cells were cultured from Samples of 26 patients with prostate cancer and 26 patients with prostatic hyperplasia. MIR22HG and miR-9-3p mRNA levels in prostate cancer tissue, prostate hyperplasia tissue and 4 types of prostate cancer cells were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The cells with higher expression of MIR22HG and miR-9-3p mRNA were screened. The selected cells were divided into OE-CTLA4 (CTLA4 overexpression group), OE-MIR22HG (MIR22HG overexpression group), miR-9-3p mimic (miR-9-3p overexpression group), OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic (MIR22HG and miR-9-3p co-overexpression group), OE-NC+NC mimic (transfection control group) and NC mimic (miR-9-3p overexpression control group). TargetScan database and luciferase reporter gene experiments were used to verify whether MIR22HG and miR-9-3p and miR-9-3p and CTLA4 had targeted inhibition relationships. The mRNA expression of MIR22HG and miR-9-3p and the protein expression of CTLA4 were detected by qRT-PCR and Western blot. A total of 96 nude mice were taken, and they were divided into OE-NC+NC mimic group (transfection control), OE-MIR22HG group (MIR22HG overexpression) and OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic group (MIR22HG and miR-9-3p co-overexpression) according to the intervention methods, with 32 mice in each group. The tumors were transplanted in situ and the changes in body mass and volume of the tumors were measured each week for 4 weeks after inoculation.
ResultsAmong adenocarcinoma cells VCAP, PC3, LNCap and DU145 cells, PC3 cells showed a relatively low MIR22HG mRNA and a relatively high miR-9-3p mRNA, so PC3 cells were selected for the study. The MIR22HG in PC3 cells was successful overexpressed, luciferase reporter gene assay verified the targeted inhibition relationship between MIR22HG and miR-9-3p, and the expression of miR-9-3p in the overexpression of MIR22HG was significantly down-regulated (P < 0.05). TargetScan database predicted the targeting relationship between immune gene CTLA4 and miR-9-3p, luciferase reporter gene assay verified the targeted inhibition relationship between miR-9-3p and CTLA4, and the expression of CTLA4 overexpressing miR-9-3p was significantly up-regulated (P < 0.05). The weight of subcutaneous tumor in nude mice overexpressed MIR22HG was significantly decreased (P < 0.05). The weight and volume of subcutaneous tumors after OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic group showed no significant differen compared with those of the OE-NC+NC mimic group (P>0.05).
ConclusionThere is a negative regulatory relationship between MIR22HG and miR-9-3p, and there is a negative regulatory relationship between miR-9-3p and CTLA4. MIR22HG/miR-9-3p may achieve the purpose of immunotherapy for prostate cancer by inhibiting CTLA4.
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前列腺癌是男性发病率较高的恶性肿瘤之一，目前临床降低其病死率最有效的方法是早期诊断，并在前列腺癌发生扩散之前即进行介入治疗[1-2]。长链非编码RNA(LncRNA)可以通过表观遗传、转录和转录后机制参与肿瘤发生、生长和转移等多种生物学过程。其中, LncRNA MIR22HG(简称MIR22HG)位于染色体17p13.3, 该染色体区域在肝癌等恶性肿瘤中表现为缺失、高甲基化或表现为杂合性缺失[3], 提示MIR22HG的异常表达可能参与了恶性肿瘤的发生发展。研究[4]显示, MIR22HG通过调节微小RNA-9-3p (miR-9-3p)影响骨关节炎进展，此外MIR22HG作为竞争性内源性RNA发挥作用，与蛋白质、miRNA相互作用参与肿瘤的发生和进展。MIR22HG可提高免疫治疗、靶向治疗对癌症的疗效[5]。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)是目前癌症免疫治疗研究领域较为热门的基因。本研究拟分析MIR22HG/miR-9-3p是否能通过调节CTLA-4影响前列腺癌，以期为前列腺癌的免疫治疗提供参考，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织、细胞及动物
收集本院26例前列腺癌组织样本和26例前列腺增生组织样本。本研究经院伦理委员会批准，所有受试者或家属了解本研究的内容和目的，并签署知情同意书。人胚肾细胞HEK293和人前列腺癌细胞VCAP、PC3、LNCap、DU145均购自中国科学院上海生命科学研究所细胞库。BALB/c裸鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
1.1.2 主要细胞、分子和化学试剂
MEM培养基和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司; 胎牛血清购自四季青; RNA提取试剂盒购自美国Omega公司; 脂质体Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司; Opti-MEM培养基购自美国Gibco公司; 海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司; 无RNase水和逆转录相关试剂购自美国Thermo Fisher公司; SYBR Green荧光定量试剂盒购自美国Bio-rad公司; Western blot相关试剂购自碧云天; CTLA4兔抗购自美国Abcam公司公司(ab237712); 羊抗兔二抗购自美国Abclonal公司(AS014); ECL显色液购自美国Millipore公司; 异丙醇等化学试剂购自国药集团; 戊巴比妥钠购自美国Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和转染
① 细胞培养。VCAP细胞以含10%胎牛血清的MEM培养基进行培养, PC3细胞、LNCap细胞和DU145细胞均以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养。所有细胞均置于37 ℃、5% CO2的恒温箱中培养。②细胞筛选及转染。将处于生长指数期的VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞以5×104个细胞/孔接种到12孔板中，采用“1.2.2”项下的方法筛选出MIR22HG及miR-9-3p mRNA表达较高的细胞以进行下一步研究。按照5×104个细胞/孔将上述筛选出的细胞接种到12孔板中，待细胞完全贴壁后，按照每孔1 mL Opti-MEM培养基、1 μg质粒和2 μL Lipofectamine 3000的比例进行细胞转染，分别转染miR-9-3p及CTLA4, 转染4 h后，吸去12孔板中的转染试剂，并加入新的细胞培养使用的培养基。将细胞分为OE-CTLA4(CTLA4过表达组)、OE-MIR22HG(MIR22HG过表达组)、miR-9-3p mimic (miR-9-3p过表达组)、OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic (MIR22HG及miR-9-3p联合过表达组)、OE-NC+NC mimic(转染对照组)、NC mimic (miR-9-3p过表达对照组)。
1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
组织及细胞总RNA提取步骤参考Omega试剂盒的产品说明书。抽提所得的RNA使用Thermo Fisher的Nanodrop 2000仪器进行质检，并检测RNA浓度。根据浓度计算逆转录时使用RNA的体积。使用Thermo Fisher的逆转录试剂盒，将1 μg的RNA逆转录为cDNA。逆转录反应体系和逆转录反应程序参考Thermo Fisher的产品说明。使用无Rnase水稀释cDNA 10倍，进行qRT-PCR, qRT-PCR扩增条件为50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。MIR22HG引物为: 上游5′-AAGTTGGAGAGCCTTTGCCC-3′; 下游5′-CGCACTATGGTGCCACATCT-3′。miR-9-3p引物：上游5′-GCGGCGGATAAAGCTAGATAAC-3′, 下游5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。CTLA4引物：上游5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′, 下游5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′。内参分别为GAPDH(引物：上游5′-CAGCCTCAAGATCAT CAGCA-3′, 下游5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′) 和U6(引物：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATAC TAAAAT-3′, 下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTG TCAT-3′)。计算并比较前列腺癌组织和正常前列腺增生组织的VCAP细胞、PC3细胞、LNCap细胞与DU145细胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA相对表达，所有样本均重复3次，取均值。选择3种前列腺癌细胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA表达相对较高者进行下一步研究。
1.2.3 荧光素酶报告基因实验
将PC3细胞接种于24孔板内，培养24 h。人工构建miR-9-3p野生型启动子双荧光素酶报告基因载体pGL4.10-hRluc，将miR-9-3p预测结合位点突变的突变体Mut-miR-9-3p和MIR22HG双荧光素酶报告基因载体共同转染PC3细胞。转染48 h后，吸出培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，收集并裂解细胞，将生长培养基吸尽, PBS漂洗，加入1×PLB裂解液室温摇床充分裂解，以荧光素酶底物发光检测仪测定荧光信号，重复3次。
1.2.4 蛋白质印迹法(Western blot)
以RIPA裂解液4 ℃孵育30 min裂解细胞，将裂解的细胞移至1.5 mL的EP管, 12 000 g 4 ℃离心15 min, 收集上清液。向上清液加入蛋白上样缓冲液(loading buffer), 加热煮沸5 min, 取20 mg的蛋白样品，以10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 电泳参数0.3 A、20 V, 转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉封闭60 min, 加入CTLA4兔抗[洗膜缓冲液(TBST)稀释，工作浓度1∶ 3 000], 4 ℃孵育过夜, TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗, 25 ℃孵育60 min, TBST洗膜6次, ECL显色，重复3次。
1.2.5 前列腺癌异种移植模型的建立
取裸鼠96只，将经不同处理的PC3细胞制成50 μL含有1×106个/mL细胞的悬液，即过表达MIR22HG和miR-9-3p, 合并50 μL Matrigel溶液注射在裸鼠的右腹股沟部，构建前列腺癌细胞的异种移植小鼠模型。将构建的小鼠模型分为OE-NC+NC mimic组(对照组)、OE-MIR22HG组(MIR22HG过表达组)及OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组(MIR22HG及miR-9-3p过表达组)，每组32只。以接种细胞当日记为第0天, 自接种第7天开始，每周对8只小鼠进行手术移除原位移植瘤，并统计瘤体的体质量和体积变化，共检测4周。肿瘤体积的计算公式为: V=0.8×2/3×D1×D2 (D1、D2分别为相互垂直的最长直径与短直径)。小鼠采用静脉注释3倍浓度的3%戊巴比妥钠实行安乐死。本实验已得到本院动物伦理会的批准。
1.3 统计学分析
使用SPSS 25.0软件进行统计学分析。MIR22HG和miR-9-3p mRNA等计量资料均通过正态性检验，采用(x±s)表示, 2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 前列腺癌组织及细胞MIR22HG和miR-9-3p mRNA相对表达
与前列腺增生组织相比，前列腺癌组织中MIR22HG mRNA降低, miR-9-3p mRNA增高，差异有统计学意义(P < 0.05)。前列腺癌细胞VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞中, PC3细胞MIR22HG mRNA相对较低, miR-9-3p mRNA相对较高(P < 0.05), 因此选择PC3细胞进行下一步研究。见图 1。
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图 1 前列腺癌组织及细胞的MIR22HG和miR-9-3p mRNA相对表达A: qRT-PCR检测前列腺癌组织中MIR22HG的表达(与前列腺增生组织比较, *P < 0.05); B: qRT-PCR检测前列腺癌组织中miR-9-3p的表达(与前列腺增生组织比较, *P < 0.05); C: qRT-PCR检测前列腺癌细胞中MIR22HG和miR-9-3p的表达(与VCAP相比, *P < 0.05); D: qRT-PCR检测前列腺癌组织、前列腺癌细胞中MIR22HG和miR-9-3p的表达(1: 前列腺癌组织; 2: 正常前列腺增生组织; 3: VCAP; 4: PC3; 5: LNCap; 6: DU145)。2.2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表达
通过TargetScan网站(http://www.TargetScan.org) 预测MIR22HG和miR-9-3p的靶向关系。在PC3细胞中成功过表达MIR22HG, 通过荧光素酶报告基因实验验证了MIR22HG和miR-9-3p的靶向抑制关系。过表达MIR22HG, miR-9-3p表达显著下调(P < 0.05), 结果表明MIR22HG可以靶向结合miR-9-3p, 并抑制其表达。见图 2。
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图 2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表达A: MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用位点; B: qRT-PCR检测MIR22HG的过表达效率(与OE-NC比较, *P < 0.05); C: 荧光素酶报告实验检测MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用(与OE-NC比较, *P < 0.05); D: qRT-PCR检测过表达MIR22HG后, miR-9-3p的表达(与OE-NC比较, *P < 0.05)。2.3 MIR22HG通过抑制miR-9-3p调控免疫基因CTLA4
TargetScan数据库(http://www.TargetScan.org/) 预测免疫基因 CTLA4 与miR-9-3p的靶向关系。在PC3细胞中成功过表达 CTLA4 , 通过荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p与 CTLA4 的靶向抑制关系。过表达miR-9-3p, CTLA4 表达显著上调(P < 0.05), 结果表明miR-9-3p可能靶向激活 CLTA4 的表达。见图 3。
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图 3 MIR22HG通过抑制miR-9-3p调控免疫基因CTLA4A: miR-9-3p和CTLA4的靶向作用位点; B: qRT-PCR检测过表达CTLA4后, CTLA4 mRNA表达(与OE-NC比较, *P < 0.05); C: Western blot检测过表达CTLA4后, CTLA4蛋白表达(与OE-NC比较, *P < 0.05); D: qRT-PCR检测过表达miR-9-3p后, CTLA4 mRNA表达(与NC mimic比较, *P < 0.05); E: Western blot检测过表达miR-9-3p后, CTLA4蛋白表达(与NC mimic比较, *P < 0.05); F: 荧光素酶报告实验检测miR-9-3p和CTLA4的靶向作用(与NC mimic比较, *P < 0.05); G: qRT-PCR检测过表达MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表达情况(与OE-NC+NC mimic比较, *P<0.05); H: Western blot检测过表达MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表达情况(与OE-NC+NC mimic比较, *P<0.05)。2.4 MIR22HG负调控CTLA4抑制前列腺癌细胞
与OE-NC+NC mimic组比较, OE-MIR22HG组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积均减小，差异有统计学意义(P < 0.05)。OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积与OE-NC+NC mimic组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图 4。
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图 4 MIR22HG负调控CTLA4抑制前列腺癌细胞A: 皮下肿瘤质量(与OE-NC+NC mimic组比较, * P < 0.05; 与OE-MIR22HG组比较, #P < 0.05); B: 皮下肿瘤体积(与OE-NC+NC mimic组比较, * P < 0.05; 与OE-MIR22HG组比较, #P < 0.05)。3. 讨论
在过去10年中，各种实体瘤的免疫治疗实验数量大幅增加，癌症免疫治疗取得了突飞猛进的发展，越来越多的癌症预后预测因子被鉴定并验证[6-7]。手术后化疗和/或放疗仍然是许多实体瘤的主要治疗方法，但免疫治疗正在迅速与其他疗法结合，可改善患者生存率。免疫治疗在前列腺癌中的治疗效果有较高提升空间[8]。研究[9]表明，炎症在前列腺癌的生长和转移不同阶段起着重要作用。从前列腺炎症发作开始，各种信号通路在耐药性和免疫抑制的发展中发挥关键作用[10-11]。
本研究结果显示，前列腺癌的MIR22HG呈低表达, miR-9-3p呈高表达。研究[12]显示, MIR22HG在结直肠癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌和甲状腺癌等恶性肿瘤组织呈低表达，其作为竞争性内源性RNA (ceRNA)参与信号通路，与蛋白质相互作用参与肿瘤进展, MIR22HG低表达的癌症患者预后较差。miR-9-3p在甲状腺乳头状癌等恶性肿瘤组织呈高表达，下调miR-9-3p可逆转甲状腺乳头状癌细胞的上皮间质转化，从而降低甲状腺乳头状癌的侵袭和迁移活性，提示miR-9-3p具有促癌作用[13]。本研究通过TargetScan网站及荧光素酶报告基因实验，验证了MIR22HG与miR-9-3p的靶向抑制关系，与相关研究[14]中MIR22HG通过靶向调节miR-9-3p表达影响喉癌进展的结果相一致。
TargetScan数据库及荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p与 CTLA4 存在靶向抑制关系，过表达miR-9-3p的 CTLA4 的表达也显著上调，表明miR-9-3p可以靶向激活 CLTA4 的表达。CLTA4是活化T细胞表面表达的膜蛋白，对T细胞增生起负性调节作用，在自身免疫性疾病的发病中具有重要作用。CLTA4已被广泛应用于免疫治疗恶性肿瘤，如伊匹单抗通过作用于CTLA-4达到免疫治疗前列腺癌的目的。本研究进一步通过裸鼠研究证实了上述论点，即分别构建过表达MIR22HG及过表达MIR22HG和miR-9-3p的前列腺癌细胞的异种移植小鼠，动态检测接种后1~4周瘤体的质量、体积变化，结果显示, OE-MIR22HG组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积均显著减小, MIR22HG及miR-9-3p联合过表达组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积与OE-NC+NC mimic差异无统计学意义，提示MIR22HG的抑癌作用可被过度表达的miR-9-3p抑制。但本研究存在不足，尽管本研究TargetScan数据库及荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p与 CTLA4 存在靶向抑制关系，但miR-9-3p与CTLA4的关系鲜有文献报道支持，本研究也未进行CTLA4细胞转染裸鼠的在体研究验证，因此未来还需进一步确认。
综上所述, MIR22HG与miR-9-3p存在靶向负调节关系, miR-9-3p与CTLA4存在靶向调节关系, MIR22HG/miR-9-3p可能通过抑制CTLA4达到免疫治疗前列腺癌的目的。
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图 1 前列腺癌组织及细胞的MIR22HG和miR-9-3p mRNA相对表达
A: qRT-PCR检测前列腺癌组织中MIR22HG的表达(与前列腺增生组织比较, *P < 0.05); B: qRT-PCR检测前列腺癌组织中miR-9-3p的表达(与前列腺增生组织比较, *P < 0.05); C: qRT-PCR检测前列腺癌细胞中MIR22HG和miR-9-3p的表达(与VCAP相比, *P < 0.05); D: qRT-PCR检测前列腺癌组织、前列腺癌细胞中MIR22HG和miR-9-3p的表达(1: 前列腺癌组织; 2: 正常前列腺增生组织; 3: VCAP; 4: PC3; 5: LNCap; 6: DU145)。
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图 2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表达
A: MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用位点; B: qRT-PCR检测MIR22HG的过表达效率(与OE-NC比较, *P < 0.05); C: 荧光素酶报告实验检测MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用(与OE-NC比较, *P < 0.05); D: qRT-PCR检测过表达MIR22HG后, miR-9-3p的表达(与OE-NC比较, *P < 0.05)。
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图 3 MIR22HG通过抑制miR-9-3p调控免疫基因CTLA4
A: miR-9-3p和CTLA4的靶向作用位点; B: qRT-PCR检测过表达CTLA4后, CTLA4 mRNA表达(与OE-NC比较, *P < 0.05); C: Western blot检测过表达CTLA4后, CTLA4蛋白表达(与OE-NC比较, *P < 0.05); D: qRT-PCR检测过表达miR-9-3p后, CTLA4 mRNA表达(与NC mimic比较, *P < 0.05); E: Western blot检测过表达miR-9-3p后, CTLA4蛋白表达(与NC mimic比较, *P < 0.05); F: 荧光素酶报告实验检测miR-9-3p和CTLA4的靶向作用(与NC mimic比较, *P < 0.05); G: qRT-PCR检测过表达MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表达情况(与OE-NC+NC mimic比较, *P<0.05); H: Western blot检测过表达MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表达情况(与OE-NC+NC mimic比较, *P<0.05)。
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