Mechanism of aprepitant in reversing chemoresistance in colorectal cancer mice through endoplasmic reticulum stress
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摘要:目的
探讨阿瑞匹坦(Apr)通过内质网应激(ERS)逆转结直肠癌(CRC)小鼠模型5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的分子机制。
方法选取30只小鼠作为实验动物，随机分配其中5只为对照组(Control组)，剩余25只采用背部皮下注射法构建HCT-116/5-FU CRC小鼠模型，并设为CRC组、5-FU组、Apr组、Apr+5-FU组和Apr+ERS抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)组，每组5只。记录小鼠体质量变化及肿瘤发生情况，并计算其脏器指数。采用蛋白印迹法(WB)检测各组蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子2亚基α(eIF2α)、激活转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)的蛋白表达水平。
结果用药后5、10、15、20 d时, CRC组、5-FU组、Apr组、Apr+5-FU组、Apr+TUDCA组小鼠体质量的组间比较、时点比较及交互作用比较，差异无统计学意义(P>0.05)。末次给药2 d后，各组小鼠胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏等脏器指数组间两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与CRC组比较, Apr组、Apr+5-FU组小鼠PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平升高，肿瘤数量减少，肿瘤质量降低，肿瘤体积减小，差异有统计学意义(P < 0.05), 且Apr+5-FU组改善情况优于其他组，差异有统计学意义(P < 0.05)。增加ERS抑制剂TUDCA干预后，抗肿瘤效应及ERS途径激活均受到抑制。
结论Apr可增强CRC小鼠化疗敏感性并逆转其化疗耐药性，其可能通过介导ERS途径的下游分子发挥这一作用。
Abstract:ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of aprepitant (Apr) reversing 5-Fluorouracil (5-FU) resistance in colorectal cancer (CRC) mouse model through endoplasmic reticulum stress (ERS).
MethodsThirty mice were selected as experimental animals. Five mice were randomly assigned to control group, and the remaining 25 mice underwent subcutaneous injection in the back to establish the HCT-116/5-FU CRC mouse model. These mice were then divided into the CRC group, 5-FU group, Apr group, Apr+5-FU group and Apr+ERS inhibitor Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) group, with five mice in each group. Changes in body weight and tumorigenesis in mice were recorded, and their organ indicators were calculated. Western blotting (WB) was used to detect the protein expression levels of protein kinase R-like ER kinase (PERK), eukaryotic initiation factor 2 subunit α (eIF2α), activating transcription factor 4 (ATF4) and C/EBP homologous protein (CHOP) in each group.
ResultsAt 5, 10, 15 and 20 d after medication, there were no statistically significant differences in body weight among CRC, 5-FU, Apr, Apr+5-FU and Apr+TUDCA groups, neither in time points nor in interactions (P>0.05). Two days after the last administration, there was no significant difference in the indexes of thymus, lung, liver, spleen, heart, kidney and other organs among all groups (P>0.05). Compared with CRC group, the protein expression levels of PERK, P-EIF2α/eIF2α, ATF4 and CHOP in Apr group and Apr+5-FU group were significantly increased, the number of tumors was significantly decreased, the tumor mass was significantly decreased, and the tumor volume was significantly decreased (P < 0.05), and the improvement of Apr+5-FU group was better than that of other groups (P < 0.05).
ConclusionApr can enhance chemotherapy sensitivity and reverse chemotherapy resistance in CRC mice, which may be mediated by downstream molecules of ERS pathway.
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流行病学调查[1]显示，中国2022年新发癌症病例482.47万例，其中结直肠癌(CRC)发病、死亡人数分别达51.71、24.00万例。近年来, CRC患者总体病死率有所下降，但局部和转移性CRC患者的5年生存率仅略高于12%, 这主要归因于受肿瘤代谢、增殖和微环境等因素影响，晚期患者极易出现化疗耐药[2-3]。在化疗过程中，外源性因素易引起内质网应激(ERS)并激活非折叠蛋白反应(UPR), 启动肿瘤细胞的保护性自噬，即细胞存活能力及细胞内药物外排能力增强，促使化疗敏感性降低，进而产生耐药性[4-5]。阿瑞匹坦(Apr)是神经激肽1受体(NK-1R)拮抗剂之一，既往主要用于抗抑郁、抗焦虑和止吐，近年来发现其具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等抗肿瘤效应[6]。此外, NK-1R的激活可引起内质网钙库向外释放大量Ca2+[7], 有学者[8]指出, Ca2+平衡紊乱状态与肿瘤增殖、化疗敏感性和化疗耐药密切相关。由此推测，Apr可能对CRC化疗耐药能够起到一定改善作用，但其作用是否与ERS途径之间存在关联尚不明确。基于此，本研究通过复制CRC小鼠移植瘤模型进一步揭示Apr的抗肿瘤机制和临床应用潜力，以期验证Apr在逆转化疗耐药中的有效性。
1. 材料与方法
1.1 材料
Apr, 纯度≥98%, 由湖北魏氏化学试剂股份有限公司生产，货号HBW-A120; 环磷酰胺，由上海源叶生物科技有限公司生产，货号S30563-1g; ERS抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA), 由上海泽叶生物科技有限公司生产，货号35807-85-3; 5-氟尿嘧啶(5-FU), 由北京索莱宝科技有限公司生产，货号IF0170。
1.2 试剂与仪器
RIPA细胞裂解液、BCA蛋白质分析试剂盒、蛋白上样缓冲液，均由碧云天生物技术有限公司生产，货号P0013C、042820220809、YT8095; GAPDH抗体购自Cell-Signalling公司; 蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、磷酸化真核翻译起始因子2亚基α(p-eIF2α)、激活转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)抗体，均由艾博抗(上海)贸易有限公司生产，货号分别为ab229912、ab168528、ab18490、ab11419; DAB显色试剂盒、辣根过氧化物酶结合二抗，均由北京中杉金桥生物技术有限公司生产，货号分别为2022A1012、2022D1001; 大小鼠专用软性肠道内窥镜，由上海亭芬生物科技有限公司生产，型号为MiniScope 2V。
1.3 实验动物及细胞
选取无特定病原体(SPF)级雄性BALB/CA-nu裸鼠30只[购置于成都达硕实验动物有限公司，许可证号: SCXK(川)2020-030]。所有小鼠为5周龄，体质量为18~22 g, 所处环境相对湿度为(60±10)%, 温度为24~26 ℃, 明/暗周期为12 h, 笼养活动不受限制，饲料自由食用，均连续饲养1周使其适应环境。本试验经过医院伦理委员会审核同意[批准号为2022年审(15)号]。5-FU耐药的HCT-116细胞(HCT-116/5-FU), 购于湖南丰晖生物科技有限公司。
1.4 方法
1.4.1 动物模型建立及分组处理
从30只小鼠中随机选取5只小鼠作为正常对照(Control)组，予以标准饮食，其余均进行造模，并分别设为CRC组(n=5)、5-FU组(n=5)、Apr组(n=5)、Apr+5-FU组(n=5)、Apr+TUDCA组(n=5)。参照相关建模文献[9], 5组小鼠均腹腔注射200 μL环磷酰胺(10 mg/mL), 连续注射2 d后，将人结肠癌细胞HCT-116/5-FU接种于小鼠背部右上方皮下(每只接种量约5×106个细胞)，接种体积为200 μL, 建模成功的标准为瘤体长到100~150 mm3, 肿瘤体积(mm3)=1/2×a×b2, 其中a为肿瘤长径, b为肿瘤短径。5-FU组、Apr组、Apr+5-FU组、Apr+TUDCA组分别予以5-FU、Apr、Apr+5-FU, 肿瘤周围皮下注射给药，每只5-FU、Apr剂量为10 mg/kg, TUDCA剂量为0.2 mg/kg, 每2 d用药1次，连续用药18 d。Control组、CRC组给予等容量安慰剂治疗，连续用药18 d。
1.4.2 一般情况观察
治疗期间，每隔5 d观察各组小鼠的状态并测量体质量，同时使用肠道内窥镜记录其病灶肿瘤体积。
1.4.3 样本采集
末次给药2 d后，颈椎脱臼处死所有小鼠，迅速取出胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏及CRC组织，记录CRC组织数量及质量，并将其用于蛋白印迹法(WB)的检测。其他脏器计算出脏器指数，公式为脏器指数(mg/g)=脏器质量/小鼠总体质量。
1.5 ERS途径相关蛋白
将小鼠CRC组织用剪刀剪碎，液氮中研磨并取总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取30 μg进行蛋白质变性、上样、电泳、分离、转膜, PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP单抗和鼠抗GAPDH(1∶ 5 000)抗体置于混合器上, 4 ℃摇床孵育过夜。洗涤后，加入HRP标记的二抗(1∶ 20 000)1 h。洗涤后滴加显影液，采用Image J软件进行蛋白表达定量分析。
1.6 统计学分析
采用SPSS 22.0和GraphPad Prism5软件进行数据分析。采用Shapiro-Wilk检验，呈正态分布的计量资料以(x±s)表示，重复测量数据进行重复测量方差分析, 2组比较使用LSD-t检验; 非正态分布的计量资料以[M(P25, P75)]表示，采用非参数检验进行组间比较，采用Mann Whitney U检验进行2组间的差异分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组小鼠不同时点体质量变化
开始用药时，各组小鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。用药后5、10、15、20 d时, CRC组、5-FU组、Apr组、Apr+5-FU组、Apr+TUDCA组小鼠体质量组间比较、时点比较及交互作用比较，差异无统计学意义(P>0.05)。用药后10、15、20 d时, Control组体质量高于CRC组、5-FU组、Apr组、Apr+5-FU组、Apr+TUDCA组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 1。
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图 1 各组小鼠不同时点体质量变化与CRC组比较, *P < 0.05; 与5-FU组比较, #P < 0.05;
与Apr组比较, △P < 0.05; 与Apr+5-FU组比较, ▲P < 0.05;
与Apr+TUDCA组比较, ▽P < 0.05。2.2 不同CRC模型小鼠肿瘤发生情况比较
与CRC组比较, 5-FU组肿瘤数量略微减少，质量、体积略微降低或减小，但差异无统计学意义(P>0.05), 进一步证实所构建的HCT-116/5-FU CRC小鼠模型化疗药物敏感性显著降低。与CRC组比较, Apr组、Apr+5-FU组小鼠肿瘤数量减少，肿瘤质量降低，肿瘤体积减小，差异有统计学意义(P < 0.05), 且Apr+5-FU组的改善情况优于其他组，差异有统计学意义(P < 0.05)。Apr处理能够起到抗肿瘤作用; 增加ERS抑制剂TUDCA干预后，抗肿瘤效应受到抑制，提示Apr抗肿瘤效应可能是通过激活ERS实现的。见图 2。
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图 2 不同CRC模型小鼠肿瘤发生情况比较A: 肿瘤数量; B: 肿瘤质量; C: 肿瘤体积。与CRC组比较, *P < 0.05; 与5-FU组比较, #P < 0.05;
与Apr组比较, △P < 0.05; 与Apr+TUDCA组比较, ▲P < 0.05。2.3 各组小鼠脏器指数比较
各组小鼠胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏等脏器指数组间两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图 3。
2.4 各组小鼠ERS途径相关蛋白表达水平比较
与Control组比较, CRC组小鼠PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。与CRC组比较, 5-FU组PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平略微升高，但差异无统计学意义(P>0.05), 进一步证实所构建的HCT-116/5-FU CRC小鼠模型化疗药物敏感性显著降低。与CRC组比较, Apr组、Apr+5-FU组PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P < 0.05), 且Apr+5-FU组改善情况优于其他组，差异有统计学意义(P < 0.05)。Apr处理能够促进ERS途径相关蛋白的表达; 增加ERS抑制剂TUDCA干预后, ERS途径的激活受到抑制，提示Apr逆转化疗耐药性是通过诱导PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号轴激活而实现的。见图 4、图 5。
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图 4 各组小鼠ERS途径相关蛋白表达水平比较A: PERK蛋白; B: p-eIF2α/eIF2α蛋白; C: ATF4蛋白; D: CHOP蛋白。与Control组比较, *P < 0.05;
与CRC组比较, #P < 0.05; 与5-FU组比较, △P < 0.05; 与Apr组比较, ▲P < 0.05;
与Apr+TUDCA组比较, ▽P < 0.05。3. 讨论
本研究采用背部皮下注射法构建HCT-116/5-FU CRC小鼠模型，结果显示，与CRC组相比较, 5-FU组肿瘤数量略微减少，质量、体积略微降低或减小，但差异无统计学意义(P>0.05), 这与TANG D X等[10]所构建模型相一致，提示HCT-116/5-FU模型构建成功。作为速激肽家族经典成员P物质(SP)的作用靶点, NK-1R对SP的亲和力极高，两者结合后的SP/NK-1R复合物可促进多种癌症的发生与发展。研究[11-12]表明, SP和NK-1R参与结肠上皮细胞增殖和肿瘤发生。既往研究[13]结果证实, NK-1R在SW-403细胞系及人原发性结肠癌中表达，并指出无论外源SP是否存在, NK-1R拮抗剂以剂量依赖的方式抑制上述肿瘤细胞生长。Apr作为被批准用于临床的NK-1R拮抗剂，最初适应证为治疗术后恶心和呕吐[14]。近年来, Apr被证实对胰腺癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌和结肠癌等多种肿瘤均有良好效果[15]。本研究发现, Apr处理能够起到抗肿瘤作用，且对小鼠脏器不产生显著毒副作用，与目前国内外实验结果基本一致，均显示出良好的生物学效应。然而，本研究与上述体内外实验存在不同之处, Apr+5-FU组改善效果显著优于Apr组，提示Apr可能逆转化疗药物耐药性，进一步抑制肿瘤增殖，延缓疾病发展。根据已公开发表的文献[16-17], Apr作为抗肿瘤药物研究偏多，但其在逆转化疗药物耐药性中的具体作用，尤其是对5-FU耐药CRC所发挥的机制仍有待深入研究。
当细胞受到外界刺激或内部代谢紊乱，如氧化应激、钙离子稳态失衡或突变蛋白质表达过多等，可使未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔内积聚，这一状态即为ERS[18]。ERS发生时，细胞会通过激活UPR过程来应对这一应激状态。UPR作为主要的适应性细胞应激反应之一，是肿瘤细胞适应高增殖率、代谢异常和缺氧恶劣环境的关键机制之一。同时，在进行化学药物治疗时，肿瘤细胞可够通过UPR途径进行调整并适应ERS，从而增强对某些细胞毒性药物的抵抗性，导致肿瘤耐药[19]。国外有学者[20]指出，持续性的ERS会激活ER跨膜蛋白IRE1、PERK、ATF6，通过三者所介导信号通路的独立感受器，使肿瘤细胞具有更强化疗耐药性。研究[21]发现, LIM激酶1能够促进elF2a的磷酸化，从而诱导ERS和促进应激小体形成，最终导致5-FU耐药。由此推测, ERS参与肿瘤细胞的化疗耐药性，同时也提示调节ERS信号途径可能为逆转化疗耐药性的新靶点。
本研究发现, CRC组小鼠PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平低于Control组，提示肿瘤作为危险信号刺激可抑制ER跨膜蛋白PERK及其下游靶向基因合成。此外, Apr干预可显著上调HCT-116/5-FU小鼠模型肿瘤组织中PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平，且联用5-FU的小鼠上调程度更高，提示Apr抗肿瘤以及逆转化疗耐药性的机制可能与激活ER跨膜蛋白PERK及其下游靶向基因密切相关。相关研究[22]提出, SP自分泌信号有助于持续激活HER2, 从而驱动乳腺癌的恶性进展和化疗耐药性。作为SP高亲和力受体, NK-1R在该调控过程中扮演着重要角色。为进一步验证本研究的推测，本研究采用ERS抑制剂TUDCA进行干预，结果发现, Apr对HCT-116/5-FU小鼠模型小鼠肿瘤发生情况、ERS信号途径等的改善作用均被显著抑制。上述结果进一步证实, Apr逆转CRC动物模型5-FU耐药性的作用机制与ERS信号途径介导的UPR过程密切相关, Apr+5-FU具有强效的协同抗肿瘤作用，并能逆转化疗耐药。
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图 1 各组小鼠不同时点体质量变化
与CRC组比较, *P < 0.05; 与5-FU组比较, #P < 0.05;
与Apr组比较, △P < 0.05; 与Apr+5-FU组比较, ▲P < 0.05;
与Apr+TUDCA组比较, ▽P < 0.05。![]()
图 2 不同CRC模型小鼠肿瘤发生情况比较
A: 肿瘤数量; B: 肿瘤质量; C: 肿瘤体积。与CRC组比较, *P < 0.05; 与5-FU组比较, #P < 0.05;
与Apr组比较, △P < 0.05; 与Apr+TUDCA组比较, ▲P < 0.05。![]()
图 4 各组小鼠ERS途径相关蛋白表达水平比较
A: PERK蛋白; B: p-eIF2α/eIF2α蛋白; C: ATF4蛋白; D: CHOP蛋白。与Control组比较, *P < 0.05;
与CRC组比较, #P < 0.05; 与5-FU组比较, △P < 0.05; 与Apr组比较, ▲P < 0.05;
与Apr+TUDCA组比较, ▽P < 0.05。 -
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