Effect and mechanism of N-acetylcysteine on methylnitrosourea-induced precancerous lesions of gastric cancer
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摘要:目的
探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对甲基硝基亚硝基胍(MNNG)诱导的胃癌癌前病变(PLGC)的影响并分析其作用机制。
方法体外培养胃上皮细胞系GES-1, 并使用不同浓度的MNNG进行处理。使用MNNG诱导建立大鼠PLGC模型。通过显微镜观察细胞形态学变化，并采用划痕实验和Transwell实验分别评估细胞迁移和侵袭能力。采用免疫印迹法(Western blot)分析上皮间质转化[上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达]及活性氧(ROS)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝裂原活化蛋白激酶(AKT)/核因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白[磷酸化(p-)PI3K、p-AKT及核内p65蛋白]表达。采用DCFH-DA染色检测ROS水平。采用苏木精-伊红(HE)染色观察胃组织病理变化。
结果体外实验结果表明, NAC处理可减轻MNNG诱导的GES-1细胞形态及生长特性改变，抑制细胞迁移、侵袭。体内实验结果表明, NAC处理可减少MNNG诱导的体内病变、增生。NAC可抑制体内外MNNG诱导的上皮间质转化进程(E-cadherin表达增加, N-cadherin表达下降)并抑制ROS/PI3K/AKT/NF-κB通路(p-PI3K、p-AKT及核内p65蛋白表达下降)。激活ROS/PI3K/AKT/NF-κB通路可部分逆转NAC对MNNG诱导的GES-1细胞迁移、侵袭、上皮间质转化以及对ROS/PI3K/AKT/NF-κB通路相关蛋白的作用。
结论NAC对MNNG诱导的胃癌癌前病变的保护作用可能与ROS/PI3K/AKT/NF-κB通路的失活相关。
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关键词:
- 乙酰半胱氨酸 /
- 甲基硝基亚硝基胍 /
- 胃癌癌前病变 /
- 活性氧/磷脂酰肌醇3-激酶/丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB通路
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of N-acetylcysteine (NAC) on methylnitrosourea (MNNG)-induced precancerous lesions of gastric cancer (PLGC) and analyze its underlying mechanisms.
MethodsGastric epithelial cell line GES-1 was cultured in vitro and treated with different concentrations of MNNG. The rat PLGC model was established by MNNG induction. The morphological changes of the cells were observed by microscope, and the migration and invasion ability of the cells were evaluated by wound healing and transwell tests, respectively. Western blot analysis was conducted to evaluate epithelial-mesenchymal transition (E-cadherin and N-cadherin proteins expression) and related proteins expression of reactive oxygen species (ROS)/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT)/nuclear factor-κB (NF-κB) pathway [phosphorylated PI3K (p-PI3K), p-AKT and nuclear p65 protein]. ROS levels were detected using DCFH-DA staining. Histopathological changes in gastric tissues were observed using hematoxylin and eosin (HE) staining.
ResultsIn vitro experiments demonstrated that NAC treatment alleviated MNNG-induced alterations in the morphology and growth characteristics of GES-1 cells, inhibiting cell migration and invasion. In vitro experiments showed that NAC treatment reduced MNNG-induced lesions and hyperplasia. NAC inhibited the EMT process (increased E-cadherin expression and decreased N-cadherin expression) and suppressed the ROS/PI3K/AKT/NF-κB pathway (decreased expression of p-PI3K, p-AKT and nuclear p65 protein) both in vitro and in vivo. Activation of the ROS/PI3K/AKT/NF-κB pathway partially reversed the effects of NAC on MNNG-induced cell migration, invasion, epithelial-mesenchymal transition and related proteins in the ROS/PI3K/AKT/NF-κB pathway in GES-1 cells.
ConclusionThe protective effect of NAC on MNNG-induced PLGC may be associated with the inactivation of the ROS/PI3K/AKT/NF-κB pathway.
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直肠癌作为常见的消化道恶性肿瘤，其主要治疗手段为手术结合术后放化疗的综合疗法。目前，固定野静态调强放疗(IMRT)已成为直肠癌术后放疗的主要方式，相较于传统的三维适形放疗(3D-CRT), IMRT不仅提供了更高的适形性指数(CI)与更好的剂量分布，还能对危及器官进行更好的保护，以减少因放疗产生的各种并发症。在临床的调强放疗计划设计中，需要对多种参数条件进行确定，包括患者治疗体位、射线能量、放射野个数、剂量算法、多叶光栅(MLC)调强方式以及计算网格尺寸等。对于直肠癌术后患者的体位选择，俯卧位和仰卧位都能符合临床治疗需求，但体位不同对放疗计划会产生一定的影响; 对于射线能量的选择，6、15 MV的X线能量均可以用于直肠癌术后的放射治疗，能量也会对剂量计算结果产生影响; 对于MLC调强方式的选择，无论是让MLC动态运动亦或是保持静态固定，均会影响剂量计算的结果。
鉴于各向异性解析算法(AAA算法)与笔形束卷积算法(PBC算法)的不同，其剂量计算结果也不同。对于计算网格的尺寸，不同尺寸的网格也会对剂量计算结果产生影响。通常来说，直肠癌术后的调强放疗计划设计采用7野或9野，野数设置越多，则靶区剂量分布以及均匀性越好，但其危及器官的低剂量区较高，而高剂量区较低; 野数设置越少，则靶区剂量分布和均匀性越差，但其危及器官的低剂量区较低，而高剂量区较高。本研究探讨在维持最佳的靶区剂量分布的同时又能最大限度地保护好危及器官的变量组合，现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
抽样选取2022年1—10月行调强放疗的24例直肠癌术后患者, Dukes(2003年版)分期为Ⅰ~Ⅳ期，术后病理为中、低分化腺癌，患者年龄40~75岁，中位年龄58岁。
1.2 仪器设备
16排大孔径螺旋定位CT(通用电气公司, General Electric Company), 仰卧位体位固定真空垫、俯卧位体位的体部固定架(广州科莱瑞迪公司)，配套使用ACUITY模拟定位机和Eclipse version 13.5三维治疗计划系统(TPS)和Clinac Ⅸ医用电子直线加速器(瓦里安公司, Varian Company)。
1.3 影像获取
12例患者采取仰卧位，双手上举并使用真空垫固定; 其余12例患者采取俯卧位，双手抱头并使用体部固定架固定。所有患者均进行层厚5 mm的增强CT扫描，扫描范围包括全腹部并外放5 cm。
1.4 靶区及危及器官勾画和剂量限值
由临床放疗医师勾画临床靶区(CTV), 将CTV的前后、左右外放0.7 cm, 上下外放1.0 cm, 得到计划靶区(PTV)。危及器官(OARs)包括脊髓、膀胱、小肠和股骨头。处方剂量均为5 000 cGy, 分25次照射，每次200 cGy, 要求99%的PTV体积最低受到95%(4 750 cGy)的处方剂量[1], PTV的最高剂量不超过5 400 cGy。OARs的耐受剂量要求分别是膀胱接受4 000 cGy剂量的体积不超过膀胱总体积的50%(V40≤50%), 脊髓最大剂量(Dmax)≤4 500 cGy, 小肠Dmax≤5 000 cGy, 股骨头Dmax≤5 000 cGy。
1.5 计划评估
在1 cGy和1 cm3的分辨率下生成的剂量-体积直方图(DVH)是评估放疗计划的重要依据。在进行不同计划的对比时，将所有患者的靶区PTV均归一到其体积的99%至少能达到其处方剂量的95%。将平均剂量(Dmean, 越小越好，但至少>5 000 cGy)、最大剂量(Dmax)、最小剂量(Dmin)、适形性指数(CI)和均质性指数(HI)作为评价PTV的剂量学参数。对OARs的评价则选取脊髓(考虑摆位误差，将实际脊髓外放3 mm进行评估)的Dmax、小肠的Dmax、股骨头的Dmax、膀胱V40、机器跳数(MU)和出束时间。CI取值范围为0~1, 该值越大则表示适形度越高[2-3]。HI值越小则剂量均匀性越佳[4-5]。
1.6 统计学方法
采用IBM SPSS 21.0进行统计学处理，采用配对t检验，设置α=0.05, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 不同治疗体位的剂量参数比较
为了探寻不同体位下放疗效果的差异性，在设计放疗计划时需排除其他因素的影响，因此将24例患者的其他优化条件设为完全一致，即将准直器和机架以及治疗床角都固定为0 °, 选择剂量率为400 MU/min下的6 MV的X线且设定MLC调强方式均为动态调强(SW), 剂量算法均为AAA, 计算网格尺寸均为0.25 cm。不断优化直至每个计划都满足剂量学要求，将PTV归一到99%的体积至少满足处方剂量的95%(即4 750 cGy)的剂量，并采用SPSS 21.0将结果进行配对t检验。对12例仰卧位患者采用7野共面的等中心布野方式，根据腹部的结构分别设计机架角度为27、78、129、180、231、282、333°; 对另外12例俯卧位患者同样采用7野共面的等中心布野方式，且分别设计机架角度为0、51、102、153、204、255、306 °。与仰卧位相比，俯卧位PTV的Dmean和Dmax更低且HI也更低，小肠的Dmax及膀胱Ⅴ50也更低，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。
表 1 不同治疗体位的剂量参数比较(x±s)参数 俯卧位 仰卧位 PTV Dmean/cGy 5 029.87±18.37 5 084.92±20.18* Dmax/cGy 5 368.70±29.86 5 395.71±38.49* Dmin/cGy 3 726.51±33.25 3 878.15±16.23 CI 0.75±0.03 0.75±0.02 HI 0.08±0.01 0.09±0.01* OARs 小肠Dmax/cGy 4 930.55±53.23 4 981.48±33.46* 脊髓Dmax/cGy 3 425.65±183.55 3 620.25±203.68 膀胱V40/% 24.18±13.84 35.12±8.63* 股骨头Dmax/cGy 4 816.03±63.15 4 725.91±53.25 MU 1 180.20±20.49 1 191.40±24.98 出束时间/min 5.08±0.37 5.13±0.86 PTV: 计划靶区; OARs: 危及器官; MU: 机器跳数; Dmean: 平均剂量; Dmax: 最大剂量; Dmin: 最小剂量; CI: 适形性指数; HI: 均匀性指数; V40: 4 000 cm3体积对应的剂量。与俯卧位比较, *P < 0.05。 2.2 不同剂量算法的剂量参数比较
为了只研究剂量算法对放疗效果的影响，使用已定好的12例俯卧位患者的TPS计划，保持计划中其他条件不变，只将AAA算法改为PBC算法并重新进行优化计算，同样将PTV归一到99%的体积至少4 750 cGy的剂量。相较于PBC算法, AAA算法PTV的Dmean和Dmax更低且CI更高、HI更低，且小肠Dmax和膀胱V40也更小，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
表 2 不同剂量算法的剂量参数比较(x±s)参数 AAA算法 PBC算法 PTV Dmean/cGy 5 029.87±18.37 5 095.33±28.46* Dmax/cGy 5 368.70±29.86 5 398.05±26.55* Dmin/cGy 3 726.51±33.25 3 873.10±16.78 CI 0.75±0.03 0.74±0.02* HI 0.08±0.01 0.09±0.01* OARs 小肠Dmax/cGy 4 930.55±53.23 4 952.31±188.55* 脊髓Dmax/cGy 3 425.65±183.55 3 477.45±156.67 膀胱V40/% 24.18±13.84 29.60±7.56* 股骨头Dmax/cGy 4 816.03±63.15 4 737.23±82.13 MU 1 180.20±20.49 1 199.30±18.60 出束时间/min 5.08±0.37 5.15±0.25 AAA算法: 各向异性解析算法; PBC算法: 笔形束卷积算法。与AAA算法比较, *P < 0.05。 2.3 调强方式的剂量参数比较
选择上述12例体位选择为俯卧位且算法选择为AAA计划的患者，在其他参数条件不变的情况下，只在优化结束后将调强方式从SW改为静态调强(MSS)再进行剂量计算，同样将PTV归一到99%的体积至少4 750 cGy的剂量。相较于MMS，SW的PTV的Dmean和Dmax更低且CI更高、HI更小，且小肠Dmax以及膀胱V40也更小，MU和出束时间偏大，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。
表 3 SW与MSS的剂量参数比较(x±s)参数 SW MSS PTV Dmean/cGy 5 029.87±18.37 5 068.92±41.23* Dmax/cGy 5 368.70±29.86 5 389.73±13.66* Dmin/cGy 3 726.51±33.25 3 766.54±15.91 CI 0.75±0.03 0.74±0.02* HI 0.08±0.01 0.09±0.01* OARs 小肠Dmax/cGy 4 930.55±53.23 4 986.51±53.88* 脊髓Dmax/cGy 3 425.65±183.55 3 510.31±150.30 膀胱V40/% 24.18±13.84 25.37±11.32* 股骨头Dmax/cGy 4 816.03±63.15 4 830.54±86.13 MU 1 180.20±20.49 1 099.60±45.68* 出束时间/min 5.08±0.37 4.89±0.37* SW: 动态调强; MSS: 静态调强。与SW比较, *P < 0.05。 2.4 不同X线能量对剂量参数的影响
为了只研究不同X线能量对剂量计算结果的影响，将上述采用AAA算法和SW方式的12例俯卧位患者治疗计划中的X线能量改为15 MV并进行重新优化计算，同样将PTV归一到99%的体积至少满足4 750 cGy的剂量。相较于6 MV, 15 MV能量的PTV的Dmean、Dmax、Dmin均偏小，CI更高而HI更低，脊髓Dmax、膀胱V40、股骨头Dmax偏小, MU和出束时间偏小，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 4。
表 4 6 MV与15 MV的X线剂量参数比较(x±s)参数 6 MV能量 15 MV能量 PTV Dmean/cGy 5 029.87±18.37 5 018.26±15.44* Dmax/cGy 5 368.70±29.86 5 312.42±22.98* Dmin/cGy 3 726.51±33.25 3 706.48±23.56* CI 0.75±0.03 0.76±0.02* HI 0.09±0.01 0.08±0.01* OARs 小肠Dmax/cGy 4 930.55±53.23 4 953.88±55.59 脊髓Dmax/cGy 3 425.65±183.55 3 366.74±153.96* 膀胱V40/% 24.18±13.84 22.86±10.23* 股骨头Dmax/cGy 4 816.03±63.15 4 802.01±59.24* MU 1 180.20±20.49 1 092.30±43.15* 出束时间/min 5.08±0.37 4.86±0.23* 与6 MV能量比较, *P < 0.05。 2.5 不同计算网格尺寸对剂量计算结果的有影响
为了只研究不同计算网格尺寸对剂量计算结果的差异，将上述采用AAA算法和SW方式以及6MV X线能量的12例俯卧位患者计划中的计算网格尺寸由0.25 cm改为0.50 cm, 然后同样将PTV归一到99%的体积至少满足4 750 cGy的剂量。相较于0.50 cm的计算网格尺寸，采用0.25 cm计算网格尺寸的PTV的Dmean、Dmax更小，CI更高而HI更低，膀胱V40、股骨头Dmax偏小, MU和出束时间偏小，上述差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 5。
表 5 0.25 cm与0.50 cm的计算网格尺寸参数比较(x±s)参数 0.25 cm 0.50 cm PTV Dmean/cGy 5 029.87±18.37 5 041.66±15.68* Dmax/cGy 5 368.70±29.86 5 407.45±33.97* Dmin/cGy 3 726.51±33.25 3 846.46±51.84 CI 0.75±0.03 0.74±0.01* HI 0.08±0.01 0.09±0.01* OARs 小肠Dmax/cGy 4 930.55±53.23 4 956.81±62.12 脊髓Dmax/cGy 3 425.65±183.55 3 199.25±157.63 膀胱V40/% 24.18±13.84 25.43±12.26* 股骨头Dmax/cGy 4 816.03±63.15 4 857.34±72.15* MU 1 180.20±20.49 1 208.10±36.98* 出束时间/min 5.08±0.37 5.10±0.27* 与0.25 cm比较, *P < 0.05。 2.6 不同放射野个数的参数比较
为了只研究放射野个数对放疗计划的影响，选择上述采用AAA算法、SW方式以及6 MV X线能量且计算网格尺寸为0.25 cm的12例俯卧位患者的放疗计划，在保持其他参数设置不变的情况下，分别按7野(0、51、102、153、204、255、306 °)以及9野(0、40、80、120、160、200、240、280、320 °)进行计划设计，同样将PTV归一到99%的体积至少满足4 750 cGy的剂量。相较于7野调强, 9野调强PTV的CI更高而HI更低，膀胱V40更低，但股骨头Dmax则是7野更低，但是9野的Dmax、MU和出束时间略微偏大，上述差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 6。
表 6 7野与9野参数比较(x±s)参数 7野 9野 PTV Dmean/cGy 5 029.87±18.37 5 021.75±13.18 Dmax/cGy 5 368.70±29.86 5 399.42±33.65* Dmin/cGy 3 726.51±33.25 3 918.45±52.17 CI 0.75±0.03 0.77±0.04* HI 0.09±0.01 0.08±0.01* OARs 小肠Dmax/cGy 4 930.55±53.23 4 963.21±45.89 脊髓Dmax/cGy 3 425.65±183.55 3 261.50±127.56 膀胱V40/% 24.18±13.84 21.37±9.87* 股骨头Dmax/cGy 4 816.03±63.15 4 850.80±52.64* MU 1 180.20±20.49 1 396.30±41.26* 出束时间/min 5.08±0.37 6.04±0.26* 与7野比较, *P < 0.05。 2.7 多变量串联剂量学差异统计
为了比较采用不同条件组合的治疗模式的剂量学差异，在其他条件不变的情况下，将12例俯卧位患者设为A组，其余12例仰卧位患者设为B组，对2组中每例患者分别设计放疗计划，其中A组患者采用俯卧位、AAA算法、SW方式、15 MV、0.25 cm、9野的条件, B组患者采用仰卧位、PBC算法、MSS方式、6 MV、0.50 cm、7野的条件。图 1显示, A组的剂量分布以及均匀性优于B组。为了满足靶区剂量要求，将各例患者的剂量分布归一到99%的PTV体积至少满足4 750 cGy的剂量，令a为A组中的典型患者，b为B组中的典型患者，正常组织定义为皮肤所包围的体积除去PTV而剩下的体积。图 2显示, a患者与b患者的靶区和危及器官的剂量受量均满足临床要求; 与b患者相比, a患者PTV的DVH曲线明显更陡，剂量分布更好; 危及器官中，小肠、股骨头的最大剂量更低且膀胱V40也更低。图 3显示, b患者的正常组织受量均低于a患者的正常组织受量。采用配对t检验的统计方法分析各剂量学参数，与B组相比, A组PTV的Dmean、Dmax更小, CI较大而HI较小，小肠Dmax、膀胱V40、股骨头Dmax均较小, MU和出束时间更大，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 7。
表 7 A组与B组的剂量学参数比较(x±s)参数 A组 B组 PTV Dmean/cGy 5 021.64±15.21 5 078.90±34.82* Dmax/cGy 5 316.92±22.85 5 498.51±46.53* Dmin/cGy 3 774.31±31.54 3 612.48±48.12 CI 0.80±0.02 0.72±0.01* HI 0.08±0.01 0.10±0.01* OARs 小肠Dmax/cGy 4 851.32±88.63 4 998.57±146.15* 脊髓Dmax/cGy 3 256.36±182.45 3 069.87±224.55 膀胱V40/% 25.21±8.36 33.07±15.32* 股骨头Dmax/cGy 4 789.13±66.15 4 963.65±78.96* MU 1 350.65±45.12 1 123.36±43.15* 出束时间/min 6.53±0.31 5.43±0.28* 与A组比较, *P < 0.05。 3. 讨论
3.1 治疗体位的影响
本研究显示，相较于仰卧位，俯卧位可以在保证CI和HI的同时更好地保护膀胱和小肠，并且仰卧位患者是使用真空垫进行体位固定，而放疗技师的摆位依据是真空垫上的中心标记点以及源皮距(SSD), 因此其呼吸运动以及膀胱充盈度等差异都会影响实际SSD的大小。与之相比，使用俯卧位体部固定架的俯卧位患者则不存在上述差异，这是因为俯卧位患者的腹部可以位于俯卧位固定架上的腹部固定孔中，而患者的呼吸运动、膀胱充盈以及背部的提莫垂直标记点对SSD的影响微乎其微，大大降低了摆位误差，提高了放疗精准性，更好地保护了正常组织器官[5]。DRZYMALA M等[6]研究显示，在5~15 Gy的小肠受量时，仰卧位小肠受照体积显著大于俯卧位; 在小肠受量为20~45 Gy时的差异则无统计学意义。KIM T H等[7]对4种不同体位固定方法时小肠受照体积差异的研究得出，最佳的固定方法是在保持膀胱充盈的状态下采用俯卧位并加上腹部平板。
3.2 剂量算法的影响
目前Eclipse中常用的2种剂量算法为PBC算法和AAA算法，每种算法都有其局限性，这是因为电子在不同尺寸介质分界面的转移近似时存在的问题不同[8-10]。参考国内外对于PBC算法的研究[11-13]，PBC算法的优点在于其计算精度能满足大多数情况下的剂量计算要求[14], 其缺点为对射线穿过2种不同组织尺寸时存在的二次建成效应体现不够完全，因此会对靶区内尺寸较低组织的吸收剂量计算结果偏高。目前国际上认为AAA算法在理论上相较于PBC算法更加精准[15], 这是因为AAA算法同时将原射线、准直器散射线以及电子线污染均加入了模型建立，这就使得其可以更准确地修正不同尺寸介质中的剂量计算结果，从而使结果更加真实可靠，因此又被称为三维笔形束卷积叠加算法。国内外对于这2种剂量算法的研究多集中于肺癌放疗中的肺部受量的差异[16]，根据RØNDE H S等[17]研究结果，相较于PBC算法，AAA算法在不均匀组织尺寸中的剂量计算结果更为准确。AARUP L R等[18]研究显示，相较于PBC算法，AAA算法的剂量计算结果更加真实，但对于肺部放疗中肺的受量仍会存在一定程度的低估，然而由于腹部不像肺部一样存在大量空腔，因此在腹部放疗时选用AAA算法更为合适。本研究显示，在其他条件都一致的情况下，采用AAA算法时的靶区CI更高而HI更低，同时危及器官中小肠Dmax和膀胱V40均更低，因此对于直肠癌术后放疗应选择AAA算法。
3.3 调强方式的影响
静态和动态调强的本质区别在于每个固定野出束过程中MLC是否持续运动。二维强度图的空间分辨率以及子野优化算法[19]是影响MSS状态下MLC运动的主要原因，而KUBO H D等[20]研究发现其就是导致子野数目差异的原因，这也导致了治疗效率的差异。相较于MSS而言，SW的子野数目更多，因此其治疗时间就更长一些，但也是由于其更多的子野，对于靶区的扫描式照射也就更为精细，同时漏射线更少，所以其在提高了CI和HI的同时更好地保护了危及器官[21-22]。本研究显示，相较于MSS，选用SW的机器条数以及治疗时间更长，但是选用SW在CI和HI方面更优，并且具有更低的小肠Dmax和膀胱V40。因此，直肠癌术后放疗选择SW的方式更优。
3.4 X射线能量的影响
由于高能射线的穿透能力更强，因此其对正常组织的保护效果更好，尤其是对于存在腹部肿瘤、体型较胖、靶区较大、肿瘤位置较深等情况的肿瘤患者，使用高能射线时的CI以及HI会更好[23]。究其原因是15 MV的X线的建成区较6 MV的X线更深，因此高能射线更加适合深部肿瘤治疗[24]。AOYAMA H等[25]研究发现，相较于6 MV的X线，选用20 MV的X线可以降低11.2%的正常组织受量。WEISS E等[26]研究发现，对于存在肺不张或者肺部原发灶较大或转移淋巴结较多的患者，选用18 MV能量的X线要优于6 MV。本研究显示，选用15 MV的X线得到的PTV的CI更高且HI更低，同时对于脊髓、膀胱、股骨头的保护也更好。调强放疗中是否使用高能射线的主要争议在于更高的射线能量会增加透射线、漏射线以及中子污染，这些因素都会增加辐射诱导的二次原发癌的风险[27]。HUQ M S等[28]研究发现, 6 MV的X线多野叶准直器的平均漏射率为2.5%, 而20 MV的X线的平均漏射率为3.5%, 但是透射和漏射线的剂量还与机器跳数有关。本研究显示, 15 MV较6 MV的X线的平均总MU降低了7.5%, 15 MV的X线的总透射漏射剂量仍低于6 MV的X线。至于中子污染，有研究[29]表明，由中子污染导致的二次原发癌的风险非常低，因此不予考虑。由于15 MV的X线的MU较低，其T也更短，临床上需要综合考虑患者年龄、身体素质、预期寿命以及肿瘤局部控制率和危及器官的保护，进而决定是否选择高能射线进行放疗。一般而言，对于腹部或者较深部位的肿瘤建议选择高能射线(≥10 MV)，对于直肠癌术后的调强放疗，高能射线带来的临床收益要大于其潜在风险，因此选择高能X线更佳。
3.5 计算网格尺寸的选择
计算网格尺寸的不同会对剂量计算准确性、剂量分布和计算用时造成影响，国内外的多篇文献[30-31]均证实了这点。CHUNG H等[30]发现在实际剂量计算过程中，计划系统能够计算的计算点数目是存在一定限制的，多余的计算点的剂量则是通过插值的方式得出的。因此网格尺寸越小，即网格划分的越小，则相邻网格体之间的剂量梯度线性程度越高，从而插值计算结果准确性越高; 反之网格尺寸越大，则计算结果越差。本研究显示，网格尺寸越小靶区的CI以及HI越好，同时对于危及器官膀胱和股骨头的保护更好，虽然计算用时稍长，但是MU和T更低。综合比较后得出，直肠癌术后调强放疗的计算网格尺寸应选择0.25 cm。
3.6 放射野个数的选择
在放疗计划设计中，放射野个数以及角度的布置将会直接影响剂量分布以及最终的治疗效果。MA H等[32]比较5野与7野的胃癌术后调强放疗的剂量学结果显示，相较于5野调强，7野调强在靶区适形度以及均匀性方面更占优势，同时对大部分危及器官的保护更好，但是5野调强肝脏的平均剂量更低。本研究显示，相较于7野均分调强，9野调强的靶区平均剂量与处方剂量更相近，并且其靶区适形度以及剂量分布均匀性都优于7野。对于OARs的保护方面，9野的膀胱V40更低; 7野调强的股骨头Dmax要低于9野，这是因为9野相较于7野新增的2个射野正好穿过股骨头所在位置，导致了股骨头所受的剂量不可避免的增高。同时9野调强的MU和T均略大于7野，但是相较于选择9野调强带来的诸多收益，这点治疗时间的增加是可以接受的。本研究认为直肠癌术后的调强放疗应选用9野均分的方式。
3.7 多变量组合的剂量学比较
本研究显示，在满足剂量要求的前提下，相较于B组，尽管A组MU和T平均增加了16.8%，但PTV的Dmean平均降低了1.2%，CI平均增加了10.0%, HI平均降低了30.3%; 小肠Dmax平均降低了3.0%, 膀胱V40平均降低了31.2%, 股骨头Dmax平均降低了3.6%。上述结果表明A组的条件设计比B组更适用于直肠癌术后调强放疗，这与相关研究[33-35]结论类似。
综上所述，使用Eclipse version 13.5 TPS设计的直肠癌术后IMRT应选用俯卧体位、AAA算法、SW方式、15 MV、0.25 cm以及9野均分的治疗模式。尽管选用SW、0.25 cm、15 MV和9野均会在一定程度上增加剂量计算以及治疗时间，但其在CI、HI以及OARs保护方面的优势更大。
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图 1 MNNG诱导建立胃上皮细胞GES-1癌前转变模型
A: GES-1细胞形态学变化; B: 各组细胞迁移能力比较; C: 各组细胞侵袭能力比较;
D: 细胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表达比较。与MNNG 0 h比较, ***P < 0.001。![]()
图 2 MNNG诱导ROS/PI3K/AKT/NF-κB通路在胃上皮细胞中的表达
A: DCFH-DA探针检测ROS水平; B: 细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、核内p65蛋白表达比较。
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图 3 NAC通过抑制ROS/PI3K/AKT/NF-κB信号减轻MNNG诱导的GES-1细胞癌前转变
A: CCK-8检测细胞活力, 与NAC 0 mmol/L比较, ***P < 0.001; B: DCFH-DA探针检测ROS水平;
C: 细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、核内p65蛋白表达比较; D: GES-1细胞形态学变化; E: 各组细胞迁移能力比较;
F: 各组细胞侵袭能力比较; G: 细胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表达比较。与对照组相比, ***P < 0.001;
与MNNG组相比, ###P < 0.001; 与MNNG + NAC组比较, △△△P < 0.001。![]()
图 4 NAC抑制MNNG诱导的体内癌前病变进展
A: 不同周龄大鼠体质量; B: HE染色检测胃组织病理变化; C: 组织中E-cadherin、N-cadherin蛋白表达比较。
与对照组比较, ***P < 0.001; 与MNNG组比较, ###P < 0.001。表 1 MNNG诱导后细胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表达比较(x±s)(n=3)
时点 E-cadherin表达 N-cadherin表达 MNNG 0 h 1.00±0.04 1.00±0.06 MNNG 6 h 0.80±0.06*** 1.92±0.37*** MNNG 12 h 0.56±0.10*** 2.49±0.26*** MNNG 24 h 0.36±0.05*** 3.51±0.37*** 与MNNG 0 h比较, * * * P < 0.001。 
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表 2 MNNG诱导后细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、核内p65蛋白表达比较(x±s)(n=3)
时点 ROS水平 p-PI3K表达 PI3K表达 p-AKT表达 AKT表达 p65 (核) MNNG 0 h 1.00±0.12 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.03 1.00±0.03 MNNG 6 h 2.43±0.31 1.81±0.35 0.96±0.03 2.29±0.93 1.00±0.02 1.75±0.11*** MNNG 12 h 10.31±1.55*** 2.80±0.09** 0.93±0.02 2.99±1.11** 0.98±0.04 2.60±0.04*** MNNG 24 h 27.32±5.37*** 3.23±1.10*** 0.95±0.02 3.64±1.16*** 0.99±0.03 3.23±0.17*** 与MNNG 0 h比较, * * P < 0.01, * * * P < 0.001。
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表 3 NAC降低MNNG诱导的GES-1细胞ROS水平(x±s) (n=3)
组别 ROS水平 对照组 1.00±0.13 MNNG组 35.81±2.51*** MNNG+NAC 2.5 mmol/L组 13.79±1.66### MNNG+NAC 5.0 mmol/L组 3.43±0.38### MNNG+NAC 10.0 mmol/L组 2.27±0.20### 与对照组相比, * * * P < 0.001; 与MNNG组相比, ###P < 0.001。
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表 4 740Y-P可逆转NAC对MNNG诱导的GES-1细胞上皮间质转化x±s) (n=3)
组别 p-PI3K表达 PI3K表达 p-AKT表达 AKT表达 p65 (核) E-cadherin表达 N-cadherin表达 对照组 1.00±0.04 1.00±0.03 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.04 1.00±0.07 MNNG组 3.15±0.49*** 0.96±0.03 4.09±0.78*** 0.98±0.03 3.50±0.09*** 0.32±0.05*** 4.03±0.28*** MNNG+NAC组 1.77±0.17### 0.98±0.02 2.18±0.43### 0.97±0.06 2.12±0.10### 0.68±0.04### 2.14±0.22### MNNG+NAC+740Y-P组 2.47±0.37△△ 0.93±0.02 3.02±0.53△ 0.99±0.07 2.99±0.13△△△ 0.48±0.03△△△ 3.31±0.35△△△ 与对照组比较, * * * P < 0.001; 与MNNG组比较, ###P < 0.001; 与MNNG+NAC组比较, △P < 0.05, △△P < 0.01, △△△P < 0.001。
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表 5 NAC抑制MNNG诱导体内上皮间质转化(x±s) (n=6)
组别 E-cadherin表达 N-cadherin表达 对照组 1.00±0.04 1.00±0.02 MNNG组 0.38±0.07*** 2.52±0.23*** MNNG + NAC组 0.78±0.09### 1.61±0.09### 与对照组比较, * * * P < 0.001; 与MNNG组比较, ###P < 0.001。
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表 6 NAC抑制MNNG诱导的PI3K/AKT/NF-κB通路表达(x±s) (n=6)
组别 p-PI3K表达 PI3K表达 p-AKT表达 AKT表达 p65表达(核) 对照组 1.00±0.04 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.06 MNNG组 2.16±0.13*** 0.99±0.03 2.51±0.51*** 0.99±0.04 2.16±0.35*** MNNG+NAC组 1.72±0.08### 0.99±0.04 1.88±0.55## 1.00±0.05 1.63±0.17# 与对照组比较, * * * P < 0.001; 与MNNG组比较, #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001。
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