微小RNA-338-3p调控信号转导和转录激活因子1对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1表达和细胞凋亡的影响

朱洪宇, 史志敏

朱洪宇, 史志敏. 微小RNA-338-3p调控信号转导和转录激活因子1对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1表达和细胞凋亡的影响[J]. 实用临床医药杂志, 2022, 26(4): 100-105. DOI: 10.7619/jcmp.20213701
引用本文: 朱洪宇, 史志敏. 微小RNA-338-3p调控信号转导和转录激活因子1对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1表达和细胞凋亡的影响[J]. 实用临床医药杂志, 2022, 26(4): 100-105. DOI: 10.7619/jcmp.20213701
ZHU Hongyu, SHI Zhimin. Effects of miR-338-3p regulating signal transducer and activator of transcription 1 on programmed death ligand 1 expression and apoptosis of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor-resistant lung cancer cell line PC-9/GR cells[J]. Journal of Clinical Medicine in Practice, 2022, 26(4): 100-105. DOI: 10.7619/jcmp.20213701
Citation: ZHU Hongyu, SHI Zhimin. Effects of miR-338-3p regulating signal transducer and activator of transcription 1 on programmed death ligand 1 expression and apoptosis of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor-resistant lung cancer cell line PC-9/GR cells[J]. Journal of Clinical Medicine in Practice, 2022, 26(4): 100-105. DOI: 10.7619/jcmp.20213701

微小RNA-338-3p调控信号转导和转录激活因子1对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1表达和细胞凋亡的影响

详细信息
    通讯作者:

    史志敏

  • 中图分类号: R734.2;Q81

Effects of miR-338-3p regulating signal transducer and activator of transcription 1 on programmed death ligand 1 expression and apoptosis of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor-resistant lung cancer cell line PC-9/GR cells

  • 摘要:
      目的  探讨微小RNA-338-3p(miR-338-3p)对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1(PD-L1)表达和细胞凋亡的影响及相关机制。
      方法  体外培养PC-9细胞、PC-9/GR细胞,采用0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μmol/L吉非替尼处理确定用药浓度; 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-338-3p表达。将PC-9/GR细胞分为对照组、miR-338-3p NC组(转染miR-338-3p NC)、miR-338-3p组(转染miR-338-3p模拟物)和信号转导和转录激活因子1(STAT1)抑制剂组(转染miR-338-3p模拟物+100 μmol/L氟达拉滨)。4组均添加1.00 μmol/L吉非替尼,转染后qRT-PCR检测细胞中miR-338-3p表达; MTT法检测细胞增殖; 流式细胞仪检测细胞凋亡; 蛋白印迹(WB)法STAT1、p-STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表达。
      结果  当吉非替尼浓度升高至1.00 μmol/L时, PC-9细胞与PC-9/GR细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。与PC-9细胞相比, PC-9/GR细胞中miR-338-3p表达水平降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。转染后, qRT-PCR结果显示, miR-338-3p组、STAT1抑制剂组的miR-338-3p表达水平均高于miR-338-3p NC组、对照组,差异有统计学意义(P > 0.05)。与miR-338-3p NC组相比, miR-338-3p组PC-9/GR细胞增殖率及细胞中PD-L1、Bcl-2蛋白表达水平降低,凋亡率及细胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P < 0.05); 与miR-338-3p组相比, STAT1抑制剂组PC-9/GR细胞增殖率及细胞中PD-L1、Bcl-2蛋白表达水平升高,凋亡率及细胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。
      结论  miR-338-3p可抑制EGFR-TKI耐药肺癌细胞株PC-9/GR细胞中PD-L1表达,并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与激活STAT1有关。
    Abstract:
      Objective  To investigate the effects and related mechanisms of miR-338-3p on the expression of programmed death ligand 1 (PD-L1) and apoptosis of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI)-resistant lung cancer cell line PC-9/GR cells.
      Methods  PC-9 cells and PC-9/GR cells were cultured in vitro, and treated with 0, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00 and 8.00 μmol/L gefitinib to determine the drug concentration; quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method was used to detect the expression of miR-338-3p in cells. PC-9/GR cells were divided into control group, miR-338-3p NC group (transfected with miR-338-3p NC), miR-338-3p group (transfected with miR-338-3p mimic) and signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) inhibitor group (transfected miR-338-3p mimic +100 μmol/L fludarabine). All four groups were added with 1.00 μmol/L gefitinib, and qRT-PCR method was used to detect the expression of miR-338-3p in the cells after transfection; MTT method was used to detect cell proliferation; flow cytometry was used to detect cell apoptosis; western blot (WB) method was used to detect the expression of STAT1, p-STAT1, PD-L1, Bcl-2 and Bax proteins.
      Results  When the concentration of gefitinib was increased to 1.00 μmol/L, the differences in the proliferation rates of PC-9 cells and PC-9/GR cells were statistically significant (P < 0.05). Compared with PC-9 cells, the expression level of miR-338-3p in PC-9/GR cells was significantly reduced (P < 0.05). The results of qRT-PCR after transfection showed that the expression levels of miR-338-3p in the miR-338-3p group and the STAT1 inhibitor group were significantly higher than those in the miR-338-3p NC group and the control group(P > 0.05). Compared with the miR-338-3p NC group, the PC-9/GR cell proliferation rate, the expression levels of PD-L1 and Bcl-2 proteins in the miR-338-3p group were significantly reduced, the apoptosis rate and expression levels of p-STAT1/STAT1 and Bax proteins in cells were significantly increased (P < 0.05); compared with the miR-338-3p group, the PC-9/GR cell proliferation rate and the expression levels of PD-L1 and Bcl-2 proteins in the STAT1 inhibitor group were significantly increased, the apoptosis rate and the expression levels of p-STAT1/STAT1 and Bax proteins in the cells were significantly reduced (P < 0.05).
      Conclusion  MiR-338-3p can inhibit the expression of PD-L1 in EGFR-TKI-resistant lung cancer cell line PC-9/GR cells and induce cell apoptosis. Its mechanism may be related to the activation of STAT1.
  • 腰椎管狭窄症是一种慢性病变,常由椎间盘退变、骨刺形成、椎体滑脱等因素引起腰椎管腔隙狭窄,进而压迫脊髓与神经根[1]。腰椎管狭窄症患者可出现腰痛、下肢放射痛、感觉异常、肌肉无力和行走困难等症状,严重者还可伴有排便功能障碍[2]。目前,中国面临严峻的人口老龄化问题,腰椎管狭窄症在一般人群中发病率约为11%,在60岁以上人群中则升至约19.4%,且发病率随年龄增长递增[3]。临床治疗腰椎管狭窄症以减轻症状、恢复功能和提高生活质量为目的,以缓解疼痛、减轻神经压迫、恢复神经功能、预防病情进展和减少并发症为原则[4]。目前,腰椎管狭窄症的治疗方法包括保守治疗(药物治疗、物理治疗、腰部支撑、针灸等)和手术治疗,但保守治疗效果欠佳,手术仍为主要治疗方法。本文对老年腰椎管狭窄症患者椎板修复手术的应用现状和研究进展进行综述,以期为该病的临床治疗提供参考依据。

    国外相关指南[5-6]推荐,患者出现3~6个月的严重症状即可考虑手术治疗。国内专家共识[3]提出的手术适应证包括: ①临床表现为慢性进行性腰痛,下肢放射痛(尤其是行走时加重),下肢感觉异常(麻木或刺痛),下肢无力或肌肉萎缩,行走困难甚至出现截瘫,排便功能障碍。②符合影像学诊断标准,磁共振成像(MRI)显示腰椎管狭窄明显,压迫脊髓和/或神经根; CT扫描显示椎管狭窄和椎间盘突出或退变明显; X线片显示椎间隙狭窄、椎体骨质增生等病变明显。③ 60岁及以上患者保守治疗3~6个月后效果不佳,且身体状况可耐受手术。

    腰椎管狭窄症手术治疗的目的是减轻脊髓和神经根受压情况,同时保障脊柱骨性结构稳定及生物力学性能[7]。腰椎管狭窄症患者尽早接受手术治疗获益更大,因为手术治疗在缓解腰腿疼痛方面的优势相较保守治疗更明显。LOUIS-SIDNEY F等[8]发现,腰椎管狭窄症患者采取减压手术治疗的远期优势大于保守治疗,建议此类患者尽早考虑手术治疗。常见椎板修复手术包括椎间减压术、椎间融合术、人工椎间盘置换术、椎弓根成形术、椎板成形术及脊柱内镜治疗技术。

    椎间减压术通过切除一部分椎板或整个椎板扩大脊柱管空间,从而减轻脊髓和神经根受压情况,包括全椎板切除术、半椎板切除术、椎板开窗术、显微镜下椎管减压术。

    该术式的优势在于能扩大椎管空间,有效减轻脊髓和神经根受压情况,从而缓解疼痛、麻木和无力等症状,适用于严重腰椎管狭窄症患者[9]。但长期随访结果显示,患者术后易复发腰腿痛,甚至新发腰腿痛症状。邵林等[10]研究显示,全椎板切除术会降低脊柱结构稳定性,增加椎间关节融合或其他稳定性重建手术的需求,并增加腰椎滑脱发生风险。胡宇童等[11]研究显示,全椎板切除术可使硬脊膜显露,从而与瘢痕组织粘连,且椎旁肌肉及软组织易落入椎管,引发医源性狭窄。

    该术式相较于全椎板切除术保留了部分椎板结构,有助于维持椎体稳定性,减少术后椎体融合或其他稳定性重建手术需求,且患者术后身体负担较小,恢复相对较快[12]。有一侧腰腿痛、马尾神经受压等症状患者的影像学特征为患侧侧隐窝和中央管狭窄、黄韧带变厚,常采用半椎板切除术治疗。赵晓峰等[13]研究显示,半椎板减压术和全椎板减压术均有较好疗效,但半椎板减压术后恢复更快,推荐在严格把握适应证的前提下优先选用半椎板减压术。但半椎板切除术由于仅切除部分椎板,无法充分扩大椎管空间,可能无法完全缓解严重腰椎管狭窄症患者的脊髓和神经根受压情况,其疗效可能劣于全椎板切除术。因此,对病情较重的患者宜进行全椎板切除术治疗,对病情较轻的患者宜进行半椎板切除术治疗,以获得最优疗效。值得注意的是,不管选用何种术式,患者术后均需接受腰背肌康复训练指导。

    相较于椎板切除术,椎板开窗术可尽量保持椎板的完整性[14],对周围肌肉和韧带的损伤较小,有助于术后康复和功能恢复[15]。该术式多用于一侧腰腿痛、单一脊神经受累患者的治疗,此类患者影像学特征为单侧侧隐窝狭窄,中央管及黄韧带无明显变化。王永宏等[16]研究表明,椎板扩大开窗减压治疗退行性腰椎管狭窄症的手术时间、术中出血量、手术疗效均优于全椎板减压。椎板开窗术虽然减少了对椎板的切除,但仍无法完全扩大椎管空间,在严重脊柱疾病患者中可能无法获得理想疗效。因此,对症状所致狭窄位置应进行选择性椎管减压,在完全解决压迫因素后保护结构,以维持脊柱稳定性。

    该术式基于显微镜技术进行,相较于传统裸眼手术或放大镜手术,其可提供更清晰、更放大的视野,使术者能够更准确地观察和处理病变部位,最大程度保留棘突、棘上韧带、棘间韧带、对侧椎板和关节突关节,减少对周围肌肉、韧带等正常组织的损伤,有助于术后康复和功能恢复。研究[17]指出,显微镜下椎管减压术能较好地保障腰椎稳定和保护椎旁肌。在保障有效性及符合适应证的基础上,腰椎滑脱、腰椎侧凸畸形、严重狭窄等复杂病情患者能否选用显微镜下椎管减压术仍存在争议。

    椎间融合术通过在椎体之间植入植骨或人工椎间盘,使相邻椎骨融合,从而减轻神经根受压情况。该术式能够稳定减轻术后腰椎受压情况,还能消除由椎间盘、关节面疾病引起的疼痛,在减压切除骨质过多、腰椎管狭窄伴峡部裂、退行性腰椎滑脱及伴后凸畸形等情况患者中应用较多[18]。刘庆涛等[19]指出,术后邻近节段椎间成角较大是椎间融合术后邻近节段退变的危险因素。目前,椎间融合术包括前路椎间融合术、后路椎间融合术、经椎间孔椎间融合术、微创经椎间孔椎间融合术等。

    该术式能使医师直接接触和处理椎间盘与椎体,可促进椎间融合的稳定性和愈合; 相较于后路椎间融合术,前路手术可减少对后方肌肉、韧带等结构的损伤,术后疼痛时间和康复期可能相对较短,还可达到较高的椎间融合率,有助于稳定脊柱和缓解症状[20-21]。许宇霞等[22]发现,前路椎间融合术能保障腰椎后柱完整性,不会破坏脊柱后部骨性结构,有效避免椎管内瘢痕发生,还能完全清除椎间盘组织,融合面积较大,椎间融合率较高,有利于恢复椎间高度、腰椎生理曲度。另有研究[23]指出,前路椎间融合术后并发症发生率较高,如腹部大血管损伤、逆行性射精,且此类患者不能行椎管减压治疗。腰椎后路手术可因创伤大引起后路翻修较难、椎管瘢痕组织增生、硬脊膜损伤等,而前路椎间融合术能有效规避以上风险,有利于翻修手术的顺利进行。

    后路椎间融合术在脊柱侧凸症、腰椎退行性疾病、腰椎滑脱等疾病中应用广泛。该术式创伤大,术中会牵拉硬膜囊和神经,神经根压迫、感染、出血等并发症发生率高。但该术式无需穿越腹腔或颈部,术中不会对腹腔器官或颈部结构造成直接损伤,有助于保护脏器和神经结构,并且椎间融合率较高[24]

    经椎间孔椎间融合术是通过一侧后外侧椎间孔进入椎间隙,能实现双侧前柱支撑。姜宇等[25]表示,经椎间孔椎间融合术可保留前纵韧带和大多数后纵韧带,有利于对植骨产生一定张力,避免植骨退出,且术中无需牵拉,可减少神经根硬脊膜受损及硬膜瘢痕形成、硬膜分离牵拉出血等。经椎间孔椎间融合术具有术后疼痛轻和康复快的优势,亦存在手术技术要求高、手术视野受限和适用范围小的劣势,故患者和医师需综合考虑这些因素后选用最适宜的手术方式。

    该术式是一种微创手术技术,通过小切口和导向器进行,可减少对周围组织的损伤并减少出血量,术后疼痛较轻,术后恢复较快,有助于患者更快回归正常生活。研究[26]指出,微创经椎间孔椎间融合术借助冷光源、显微镜,可为操作者提供广阔的手术视野、操作空间,经多裂肌、最长肌肌间隙入路,能扩张肌肉间隙,不破坏肌纤维,减少组织和多裂肌受损,维护脊柱结构,减少术后腰背疼痛的发生。

    人工椎间盘置换术通过移除受损椎间盘,并植入人工椎间盘来重建脊柱稳定性和恢复椎间盘功能,主要适用于椎间盘退行性变引起的腰椎间盘突出症、椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、颈椎间盘突出症、颈椎管狭窄症等疾病。祝静雨等[27]研究显示,单节段退行性颈椎病患者接受颈椎人工椎间盘置换术治疗后,远期疗效良好。相较于椎间融合术,人工椎间盘置换术可更好地保留椎间盘运动功能,减少术后运动不适和相邻椎骨应力增加,还可降低相邻椎骨退行性改变的风险[28]。研究[29]表明,人工椎间盘置换术后患者可更快地恢复正常活动能力。但该类患者需接受长期随访,以观察人工椎间盘的稳定性和功能,以及周围椎间盘和椎体的状况,临床中应严格把握适应证,选用合适的手术方式。

    近年来,脊柱内窥镜技术被广泛用于脊柱外科手术中,且手术适应证不断增加。单侧双通道脊柱内镜技术作为新型微创内镜技术逐渐兴起,被用于腰椎管狭窄症的治疗中[30-31]。单侧双通道脊柱内镜技术是以2个切口作为通道进行操作(1个切口为内镜通道,主要用于获取清晰术野图像; 另1个切口为工作通道,主要用于手术操作),不仅可实现单侧椎板开窗单减压,还可在不剥离对侧组织的情况下实现双侧减压,具有灵活便捷、微创、不影响脊柱稳定性等特征[32-33]。既往研究[34]采用单侧双通道脊柱内镜技术治疗退变性腰椎管狭窄症获得了满意效果,不仅微创、恢复快,疗效也不亚于开放手术。单侧双通道脊柱内镜技术是基于开放脊柱外科手术和显微脊柱外科手术的创新技术,避免了通道技术在空气介质条件下视野模糊、范围较小等弊端,还弥补了椎间孔镜技术视野较小、需昂贵专用手术器械的弊端,故很多医院使用原有器械、设备也能顺利开展手术。

    后路显微内窥镜下腰椎间盘突出髓核摘除术最初被用于治疗腰椎间盘突出症,相较于传统开放椎板开窗髓核摘除术,其对椎旁肌肉损伤更小、切口更小、出血更少、恢复更快。随着手术技术及医疗器械的不断改良更新,后路显微内窥镜下腰椎间盘突出髓核摘除术已不再局限于腰椎间盘突出症治疗,还被用于老年腰椎管狭窄症治疗。AIHARA T等[35]采用该术式治疗老年腰椎管狭窄症,获得了优于常规开放手术的满意效果。然而,后路显微内窥镜下腰椎间盘突出髓核摘除术容易出现术野渗血多、术区清晰度不高等情况,且存在要求操作者有开放手术经验、学习曲线亦较长等不足。近年来,以水为介质的脊柱内镜技术和等离子刀头等创新技术应运而生,可弥补上述不足。

    随着内窥镜技术的推广与发展,镜下减压治疗逐渐被广泛用于腰椎管狭窄症中。传统内镜下减压存在工作通道直径较小、操作不便、效率低下等不足,在处理双侧症状腰椎管狭窄症时难度尤其高,往往需进行预处理后才能置入工作套管。大通道脊柱内镜的工作通道较常规脊柱内镜更大,视野范围更广,适用于更大尺寸的镜下减压工具及器械,操作更便捷,效率更高。既往研究[36-37]使用Delta大通道内镜对老年腰椎管狭窄症患者进行单侧椎板间入路双侧减压术,获得了较好的手术疗效,并指出大通道内镜减压最佳适应证为中央型或合并侧隐窝型狭窄腰椎管狭窄症。有学者[38]认为,相较于传统内镜下减压,椎板间入路大通道内镜虽然优势更突出,但存在硬膜囊撕裂、神经损伤等并发症发生风险。因此,在减压的同时减少并发症发生,是今后镜下减压技术的改良目标。

    综上所述,老年腰椎管狭窄症患者保守治疗失败时,可选用合适的手术方式进行治疗。目前,腰椎管狭窄症的手术方式多种多样,但不同术式各有适应证,医师应结合患者的临床症状、体征、影像学检查结果等进行术前评估,以选用合适的手术方案。未来,老年腰椎管狭窄症患者椎板修复手术方法的研究趋势预计朝着精准微创手术技术、应用生物材料和个性化治疗方案等方向发展,这或可进一步改善手术效果,减少并发症发生,并提高患者的生活质量。

  • 图  1   各组PC-9/GR细胞凋亡情况

    A: 对照组; B: miR-338-3p NC组; C: miR-338-3p组; D: STAT1抑制剂组。

    图  2   各组PC-9/GR细胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表达情况

    表  1   不同浓度吉非替尼作用下PC-9细胞、PC-9/GR细胞的增殖率比较(n=6)(x±s)

    吉非替尼浓度/(μmol/L) 增殖率/%
    PC-9细胞 PC-9/GR细胞
    0 100.00±0 100.00±0
    0.25 92.53±4.48* 94.12±4.79
    0.50 82.74±4.16* 86.23±4.38*
    1.00 70.80±4.05* 76.72±4.16*#
    2.00 58.16±4.25* 65.02±4.14*#
    4.00 49.89±4.50* 57.64±4.42*#
    8.00 40.06±3.88* 49.22±3.95*#
    与0 μmol/L比较, *P < 0.05; 与PC-9细胞比较, #P < 0.05。
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    表  2   转染后PC-9/GR细胞miR-338-3p表达水平比较(n=6)(x±s)

    组别 miR-338-3p
    对照组 1.00±0
    miR-338-3p NC组 1.12±0.15
    miR-338-3p组 2.20±0.17*#
    STAT1抑制剂组 2.16±0.18*#
    与对照组比较, *P < 0.05;
    与miR-338-3p NC组比较, #P < 0.05。
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    表  3   各组PC-9/GR细胞增殖率比较(n=6)(x±s)

    组别 增殖率/%
    对照组 100.00±0
    miR-338-3p NC组 98.63±5.65
    miR-338-3p组 52.35±5.02*
    STAT1抑制剂组 82.68±5.46#
    与miR-338-3p NC组比较, *P < 0.05;
    与miR-338-3p组比较, #P < 0.05。
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    表  4   各组PC-9/GR细胞凋亡率比较(n=6)(x±s)

    组别 凋亡率/%
    对照组 18.56±1.55
    miR-338-3p NC组 18.04±1.60
    miR-338-3p组 35.92±2.69*
    STAT1抑制剂组 22.83±2.15#
    与miR-338-3p NC组比较, *P < 0.05;
    与miR-338-3p组比较, #P < 0.05。
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    表  5   各组PC-9/GR细胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较(n=6)(x±s)

    组别 p-STAT1/STAT1 PD-L1/GAPDH Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH
    对照组 0.45±0.06 0.72±0.06 0.80±0.07 0.43±0.05
    miR-338-3p NC组 0.47±0.07 0.71±0.07 0.83±0.07 0.40±0.05
    miR-338-3p组 0.83±0.07* 0.39±0.05* 0.40±0.04* 0.88±0.06*
    STAT1抑制剂组 0.60±0.06# 0.58±0.06# 0.65±0.05# 0.57±0.06#
    与miR-338-3p NC组比较, *P < 0.05; 与miR-338-3p组比较, #P < 0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-09-13
  • 网络出版日期:  2022-03-21
  • 发布日期:  2022-02-27

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